蛋白质电泳与操作26页PPT

3. 分离；
1
4. 染色和脱色。
2
3
应用：用于分析蛋白质的分子量，常用于蛋白质 纯度鉴定和相对定量。
案例二：2-DE分析
• 2-DE简介：2-DE即双向凝胶电泳，是一种分离复杂 蛋白质混合物的方法。通过第一向等电聚焦和第二 向SDS-PAGE分离蛋白质，可展示蛋白质的等电点和 分子量。
案例二：2-DE分析
采用自动化技术，减少人为误差，提高电泳操作的重复性和可靠性。
04 蛋白质电泳实验注意事项
安全注意事项
1 2
避免使用未经灭菌的器具
在实验过程中，应确保所有使用的器具均经过严 格的灭菌处理，以防止微生物污染。
避免直接接触缓冲液
某些缓冲液可能含有刺激性或腐蚀性成分，应避 免直接接触皮肤或眼睛。
3
正确处理废弃物
03 蛋白质电泳技术优化
优化电泳条件
01
02
03
缓冲液选择
根据蛋白质的性质选择合 适的缓冲液，以提高电泳 分离效果。
电压与电流控制
优化电泳过程中的电压和 电流，以获得更好的分辨 率和分离效果。
电泳温度
选择适当的电泳温度，以 减少热量对蛋白质的干扰， 提高分辨率。
改进样品制备方法
样品溶解与变性
采用适当的溶解和变性方法，使蛋白质充分溶解并保持其天然构 象。
琼脂糖凝胶电泳
根据蛋白质分子的电荷和分子 量进行分离，常用于基因工程 和分子生物学研究。
等电聚焦电泳
根据蛋白质分子的等电点进行 分离，常用于蛋白质组学和生
物医学研究。
蛋白质电泳的应用
蛋白质组学研究
用于鉴定、分离和比较不同组织和细胞类型的蛋 白质，有助于深入了解生命活动的分子机制。

氨基酸的酸碱性质
• 氨基酸在水溶液或结晶内基本上均以兼性离子 或偶极离子的形式存在。 • 兼性离子： 又称为两性离子是指在同一个氨基 酸分子上带有能释放出质子的 NH3+ 正离子和 能接受质子的 COO- 负离子，因此氨基酸是两 性电解质。 • 氨基酸的等电点： 氨基酸的带电状况取决于所 处环境的 PH 值，改变 PH 值可以使氨基酸带正 电荷或负电荷，也可使它处于正负电荷数相等， 即净电荷为零的两性离子状态。使氨基酸所带 正负电荷数相等即净电荷为零时的溶液pH值称 为该氨基酸的等电点（isoelectric point）。
蛋白质电泳与操作
福建中医药大学康复医学研究所 林炜 博士
2019.4.13
蛋白质特性
Questions：
• • • • • • • 什么是氨基酸？ 氨基酸有何结构特点？ 什么是肽？ 肽是如何形成的？ 形成肽的化学键是什么？ 什么是蛋白质？ 蛋白质的结构特点是什么？
氨基酸（amino acid）
• 含有一个碱性氨基和一个酸性羧基的有机化合 物。是蛋白质的基本组成单位。
利用聚丙烯酰胺形成的凝胶对大分子生物物质（如核酸、蛋白质） 通过附加电场使分子不同的按照分子量大小在凝胶中得到分离。
蛋白质的聚丙烯凝胶电泳类型：
按蛋白质变性与否分为变性电泳和非变性电泳； 按凝胶浓度梯度分为不连续电泳与连续电泳； 按电泳的向性分为单向电泳与双向电泳。
蛋白质变性电泳
• 蛋白质变性：蛋白质的三级结构和四级结构的结合力主要是半胱氨酸 之间形成的二硫键（Disulfide bond）。而蛋白质三级结构和四级结构 是蛋白质的功能基础。蛋白质变性就是使二硫键打开，从而使蛋白质 亚基解离和三级结构打开，使蛋白质失去生物活性，故称变性 （denature）。 • 蛋白质变性的方法： 95℃加热5分钟足以破坏蛋白质中的二硫键，但 是当温度降至常温后，二硫键能够重新形成，这个过程称为复性 （renature）。为了使变性后的蛋白不再复性通常使用β-巯基乙醇（2Mercaptoethanol ）或二硫苏糖醇 （Dithiothreitol ，DTT）保护自由的 半胱氨酸巯基。另外，为了避免复性，通常在加热后立即放入冰浴以 减少蛋白质复性的机会。 • 蛋白质变性电泳的方法：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 （sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

2.制备分离胶：按分离胶配制方法配好分离胶，缓慢注入胶 模中（占玻璃板的2/3），为了防止氧化，沿 玻璃板壁轻轻加一层水层（注意不能将胶冲 起），室温下聚合40min。
3. 制备浓缩胶：配制好3%浓缩胶。将胶模中上层水倾倒出 去，用滤纸吸干余水。倒入浓缩胶插好样品 梳，注意避免汽泡出现。
4. 电泳：将胶模装好，去胶条后，装入电泳槽中，检查是否 漏液后，倒入电泳缓冲液，胶模内侧的液面没过 矮板但不可超过高板（矮板在内）。
实验原理 实验仪器 实验试剂与材料 实验步骤
实验原理
以聚丙烯酰胺作为支持介质的一种电泳技术。凝胶是 聚丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺交联而成的，催化剂为过硫 酸铵，加速剂为TEMED。
本实验采用聚丙烯酰胺凝胶不连续体系与非解离体系， 电泳迁移率的大小与带电粒子的大小、形状和带净电荷的 数量等因素有关。不同蛋白质，可根据其所带电荷大小、 形状而得到分离。
分离胶：溶液1 5ml、溶液3 3.75mL、水6.25ml、1O%AP 0.O5mL、 TEMED 0.0lmL

实验材料： 胰蛋白酶（牛的胰蛋白酶氨基酸残基223
个，分子量为23300）和牛血清白蛋白（分子 量68KD）混合物。
实验步骤
1.胶模固定：将两块洗净的玻璃板，按要求对齐，夹好。将 胶模装入电泳槽固定好，并将胶模下端封好， 防漏。(电泳槽按要求清洗干净)。
46ml冰乙酸定容到5O0ml。 7．加样缓冲液：甘油3.2m1，2M Tris一HCl（pH6.8）1.25ml，溴酚兰粉末少许加水至
l0ml。 8．脱色液： 20%甲醇，7%～10%的冰乙酸(现用现配) 9．凝胶配制：实验用分离胶为10%，浓缩胶为3%（现用现配）
浓缩胶：溶液2 1.25ml、溶液3 0.65mL、水3.05ml、1O%AP 25μl、 TEMED 5μl

生物化学与分子生物学实验教17学中心
肝硬化型
主要特征： Alb均有不同程度的降低，α 1、α 2和β 球蛋 白正常或降低，γ -G明显增高且宽度增加，可见β -γ 桥。
病理生理： 肝细胞受损导致Alb明显降低，β -γ 桥的出现 与血清免疫球蛋白，特别是IgA、IgM、IgG同时增加有关， 其中以IgA影响较大，当IgA和IgM泳动在β 和γ 之间，使β 区带与γ 区带融合而形成β -γ 桥。
区带电泳（按支持介质）：淀粉凝胶电泳 滤纸电泳 醋酸纤维素薄膜电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳
按支持介质形式：水平式电泳、垂直电泳
按缓冲液pH值：连续pH和不连续pH电泳
生物化学与分子生物学实验教3学中心
临床电泳项目
临床上以琼脂糖电泳法开展的电泳项目：
血清蛋白电泳 免疫固定电泳 尿蛋白电泳 同工酶电泳 脑脊液寡克隆电泳 本周氏蛋白电泳 脂蛋白电泳
血清免疫固定电泳（IFE）
是一种包括琼脂糖凝胶蛋白电泳和免疫沉淀两个 过程的操作，是免疫沉淀反应的一种混合技术。 优势：将血清蛋白电泳、高分辩率、抗原-抗体特 异性免疫反应等有机结合，对蛋白进行分离和定 型，形象地观察Ig的各类重链和轻链分型。
生物化学与分子生物学实验教6学中心
血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳结果
正常血清蛋白质电泳图谱
生物化学与分子生物学实验教9学中心
血清蛋白电泳区带
白蛋白区带：主要由白蛋白构成。 α 1-球蛋白区带： α 1-抗胰蛋白酶、 α 1-脂蛋白、 α 1-酸性糖蛋白 、甲状腺结合球蛋白、凝血酶原等。 α 2-球蛋白区带： α 2-巨球蛋白、结合珠蛋白、铜蓝蛋白、 α 2-脂 蛋白、红细胞生成素等。 β -球蛋白区带：主要含铁蛋白、β -脂蛋白、补体C3、C4、β 2-微球 蛋白等。 γ -球蛋白区带含IgG、M、A、D、E免疫球蛋白。

的电荷（种类和数量）、大小和形状，在
一定时间内它们在相同电场中泳动速度不
同，各自集中到特定的位置上而形成紧密
的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技 术进行分离、分析和鉴定的基本原理。
-
（四）电泳的基本原理
勤奋 严谨 求实 创新
迁移率(mobility,m） 带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度
V m=
用
（四）影响电泳的因素
4.缓冲溶液
勤奋 严谨 求实 创新
• 决定带电颗粒的解离程度，即所带净电荷的量Q，pH>>pI，Q↑，V↑ pH值
• 最适离子强度在0.02～0.2， 离子强度 • I↑→吸引被分离带电颗粒→形成离子扩散层→被分离颗粒电动电势↓→V↓
• 溶液粘度η↑→V↓ 溶液粘度
勤奋 严谨 求实 创新
勤奋 严谨 求实 创新
T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质， 但过大，胶越硬也易脆裂。
T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。 但过小，胶稀软不易操作。
C过高，胶变脆，缺乏弹性，透明度降低。 C过低，聚合不良，呈糊状。
勤奋 严谨 求实 创新
根据样品分子的大小选择凝胶配方 一般情况下，体内蛋白质多采用7.5％浓度凝
勤奋 严谨 求实 创新
2. 电荷效应
• 在分离胶中进行，在高度浓缩的蛋白质薄层中，由 于各种蛋白质分子的PI不同，所带电荷不同，其迁 移率也不同，各种蛋白质就按迁移率的快慢顺序而 分离。
勤奋 严谨 求实 创新
3.分子筛效应
• 分子量或构型不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶 时所受的摩擦力不同，受阻滞的程度不同。因此表 现出不同的泳动率即所谓分子筛效应。
勤奋 严谨 求实 创新

血清蛋白电泳1809年pehce俄国物理学家首先发现电泳现象1937年tiselius瑞典制成界面电泳仪应用于蛋白质研究1948年wieland和fischer建立了滤纸电泳法奠定了区带电泳技术的基础1959年raymond和weintraub创建聚丙烯酰胺凝胶电泳血清蛋白电泳电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其电性相反的电极移动的现象
先天性白蛋白缺陷型
主要特征：由于血清白蛋白 的显著降低，血清总蛋白也 随之降低，α1、α2球蛋白 明显增高，γ球蛋白也增高。 严重无白蛋白血症时，白蛋 白有时可降为零。 产生原因：本病是极少见的 先天性疾病，可能由于肝细 胞内白蛋白合成功能遗传性 缺陷或明显低下所致。
MM的电泳图谱
思考题
❖ 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳后为 何会有区带拖尾及分开不明显的情 况？如何避免？
谢谢观看！ 炎 α带设╱温向优C液6占按无炎醋取按薄薄蛋优电漂取设6按 见按╱见占薄无 蛋温电人血γ血由白白设血纤温出 设如按血染暂 温漂无液无见蛋蛋 γ电电无血纤蛋1如蛋液设产带炎肾1液炎1优标 液无╲╲见1用见出占按见向产见13Cmmm9999971OA症电各度白点体总支光症纤试用膜膜白点泳洗试各分于支于总膜光白度泳类浆清于蛋等各清维度现各果支清色时度洗光体光于白白泳泳光清维白果白体各生电症病体症点本体光于5于现总分于白生于35345℃：MlloO2,,79789其其l型荷 部 、 蛋 ： 对 蛋 持 泽 型 膜 管 途 未 未 质 ： 技 液 管 部 离急 持 急 蛋 位 泽质 、 是 血 ::电 白 成 部 蛋 素 、 β部 电 持 :液 未 型、 液 泽 对 泽 急 质 质技 技 泽 蛋 素 缺 电 质 对 部 原 荷 型 型 对 型 ： ：对 泽 急 急 β蛋 离 急 蛋 原 急+++01α/对年年年年年-是是是L和 和n01HHOO余余： 多吸分白C固白介面：规6不完完的C术：6吸的 慢介慢白置面 的分指液泳、分吸白薄分吸渗介：完主 分：面固面慢的的 术术面白薄乏渗的固吸因多：：固：C血 固面慢慢白的慢白因慢染N，，，，m，-酸指指指支支2γγ++HHAAA各各a表 、光子管体的质朝表格同全全等指3光原 性质性的歪朝 等子带中法脂。光醋膜子光与质丽全要 子3朝体朝性等等 除除朝醋膜症与等体光：、表表体表清 体朝性性的原性管：性比难难0ββW料TRTR性离离离--MMMO，%，%mii管管aa现 分度大中支百形下现及：浸浸电利度理 肾形肝百斜下 电大电有设蛋度酸电大度电形春浸是 大下支下肾电电 了了下酸电：电电支度本分现现支现应 支下肾肾百理肾中本肝ss色以 以i不电电电糖体体体He（（iyyee在在n加加lmm为 子分小加持分状，为点分透透点用分不 炎状炎分、， 点小粒备白分泳小分泳状红透指 小，持，炎点点 用用，泳主泳点持分病子为为持为新 持，炎炎分不炎加病炎1液，分 分lla吸泳泳泳蛋并的的iiαα╱╱VVuu白白2nCoo00╲╲22量别、入物数不点样析或或、电别同 、不和数弯点 、、子简、别、别方不或肾 点物点、、、 于于点要方、物别是量白物鲜 物点、数同、入是和ααSαα6以ss离 离//5附具具具d白经血血nnVV..O蛋蛋m((1111染种和瑞瑞dd小为吸的同样示电温温分泳为： 肾同肝曲样 分吸在单抗为吸为向同温功 吸样的样肾分分 小样包向分的为极小蛋的， 的样肾肾：肾极肝4(((4空））， ，、 、、、++，有有有；过液液O%%%ααl++和和白白00，色以F典典11者附相：侧意泳度度子现区 病：硬，侧 子附电体附相：度能 附侧相侧病子子 分分侧括子相少者白相不 相侧病病区病少硬AA,AAAHH白醋醋出 出-%%αααα蛋灵灵灵)))OO抗经经操iWW管 管其sAAAAA液上2222++))，作对薄置图、过过量象带综薄化与置量作场、作同薄过不作置对置综量量子子置同量对见，及对得对置综综带综见化α醋醋HH管酸酸现 现c白敏敏敏制制凝过过作、、、、、ee和 和和和内内1余h蛋--ii泳用移层于制高高及对电 合层。电于 及用的补用，层高全 用于移于合及及 物物于，及移的泳移溶 移于合合电合的。γ酸酸调溶溶抗nn区e度度度成成的自自方AAAAA“ “-ββββ加加各白ttr球动等动电负备导导迁混泳 征电流负 迁等作体等电导的 等负动负征迁迁 质质负迁动先动动血 动负征征泳征先VVaaaaa╱0╱0rr零液液建三 三三三胰带高高高界界血然然便ββaa入入11111..管变变质C蛋uu--较，泳极电致致移合、 、泳方极 移用、泳致患 极，极、移移 的的极移，天较，，极、、、、天，╲╲立种 、种、、、、种种蛋均，，，面面γγ液凝凝,bbO00具加大大成桥 桥白快由、端泳干干率物自 肾、向端 率下凝、干者 端由端肾率率 分分端率由性快由由端肾肾自肾性创创读了..球 A球AAAA球球白匀标标标电电经固固O有入；；分” ”aaaaa降；缓板，、燥燥进由 功板不， ，血板燥在 缓，功离离，缓疾；缓缓，功功由功疾建建各H滤蛋 蛋蛋蛋酶，本本本泳泳过而而22222高3。， ，低、、、、、冲电通定或或行界 能电平通 向酶电或治 通冲通能分分通冲病冲冲通能能界能病聚聚管纸白 白白白缺m背用用用仪仪离析析分此 此，AAAAA液泳电量水水分面 衰泳行电 着原泳水疗 电液电衰析析电液，液液电衰衰面衰，l丙丙吸电均 均均均乏景量量量，，，心出出辨βββββ现 现的和免分分离电 竭和与和和分期 的竭外外的可的的竭竭电竭可烯烯光泳α增 增增增症、、、、、清少少少应应将沉的的率2象 象水柱疫蒸蒸分泳 等柱其凝柱蒸间 水等水能水水等等泳等能,,酰酰度法高 高高高、AAAAA晰，，，用用各淀液液最最和及往往γγγγγ分电电发发析、 。电电血电发使 分。分由分分。。、。由胺 胺，，，，，分 分 分于 于蛋后体体主 主。 。 。 。 。γβ选往 往-子泳泳薄薄的等 泳性因泳薄用 子子于子子等于凝凝奠-见 见见见既辨辨辨蛋蛋白球的部部要要球择是 是和和膜膜技速 相子膜大 和和肝和和速肝胶胶定于 于于于易率率率白白区蛋上分分用用蛋性由 由支连与与术电 反、与剂 支支细支支电细电电了各 各各各比高高高质质带白清..于于白特于 于持续滤滤。泳 的抗滤量 持持胞持持泳胞泳泳区种 种种种色，，，研研缺剪部蛋蛋升点II介制纸纸、 电凝纸的 介介内介介、内gg带急 急急急定区区区究究乏下分白白高,AA已质备桥桥等 极血桥质质白质质等白β电、 、、、量带带带症分增 增.质质。-成内的电接接电 移因接的的蛋的的电蛋泳慢 慢慢慢，清清清等别高 高,,核核为酰表泳触触聚 动子触表表白表表聚白技性 性性性又晰晰晰（置所 所酸酸医胺面。不不焦 的、不面面合面面焦合术炎 炎炎炎易，，，较致 致于等等学类之良良电 现良之之成之之电成α的症 症症症透电电电少， ，各生生1检抗间泳 象间间功间间泳功基和 和和和-明泳泳泳见试抗II物物gg验生产。产产能产产能础应 应应应后时时时）管AA胰分分中素生生生遗生生遗与 与激 激激激进间间间中蛋子子常，的的的传的的传肝 肝反 反反反行短短短，白的的用可一一一性一一性纤 纤应 应应应光，，，另、研研的形种种种缺种种缺维 维。 。。。密操操操从究究α技成相相相陷相相陷化 化度作作作空1..术-快关关关或关关或有 有扫简简简糖白.泳电电电明电电明关 关描便便便蛋背动荷荷荷显荷荷显。 。。快快快白景性所所所低所所低捷捷捷、剪的引 引 引 下 引 引 下；；；α一2白起起起所起起所块-巨蛋。。。致。。致平球白。。均蛋成大白分小、，的转治膜铁疗条蛋中置白断于和即空其逐白他渐管微消中量失，蛋。

蛋白质组学研究
蛋白质电泳分析在蛋白质组学研 究中具有重要作用，可用于分离 和鉴定蛋白质，揭示蛋白质的表
达模式和功能。
生物标志物发现
通过蛋白质电泳分析，可以发现 与疾病相关的生物标志物，有助
于疾病的早期诊用于药物靶点 的筛选和验证，以及药物作用机
制的研究，有助于新药研发。
绝对定量
通过灰度扫描电泳图谱中蛋白质条带， 可以计算出各蛋白质条带的相对含量。
通过标准品或已知浓度的蛋白质样品， 可以建立标准曲线，从而对未知浓度 的蛋白质样品进行绝对定量分析。
相对定量
通过比较不同样品中蛋白质条带的灰 度值或亮度，可以计算出各蛋白质的 相对表达量。
04
蛋白质电泳分析的优缺点
优点
03
蛋白质电泳分析结果解读
电泳图谱的解读
01
02
03
蛋白质分子量标准
电泳图谱中通常会有一条 蛋白质分子量标准，用于 参考和标定蛋白质的分子 量。
蛋白质条带位置
通过观察电泳图谱中蛋白 质条带的位置，可以判断 蛋白质的迁移率和分子量 大小。
蛋白质表达量
通过比较不同样品中蛋白 质条带的亮度或密度，可 以判断蛋白质的表达量。
在食品安全和检测领域的应用前景
食品成分分析
蛋白质电泳分析可用于食品中蛋白质的鉴定和含 量测定，确保食品质量和安全。
污染物检测
蛋白质电泳分析可以检测食品中的有害物质和污 染物，如农药残留、重金属等。
转基因食品检测
通过蛋白质电泳分析，可以检测转基因食品中的 外源蛋白质，保障消费者权益。
THANKS
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蛋白质电泳分析PPT 课件
目录
• 蛋白质电泳分析概述 • 蛋白质电泳分析实验操作 • 蛋白质电泳分析结果解读 • 蛋白质电泳分析的优缺点 • 蛋白质电泳分析展望

操作(cāozuò)中，注意控制染色和漂洗的时间 ，防止背景过深或某些区带太浅。
第十四页，共29页。
6.记录和分析实验结果(jiē guǒ) 漂洗完毕后将薄膜取出, 放在滤纸上。将薄膜上
的5条色带根据其颜色深浅、形状、大小及相对位置 进行描述、记录在实验本上，并判断分析其结果(jiē guǒ)。
第十五页，共29页。
聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。
第二十页，共29页。
第二十一页，共29页。
三、实验(shíyàn)器材 与试剂
1.实验材料(cáiliào)：正常人血清
2.实验器材：圆盘电泳槽、电泳仪、玻璃管（ 10cm×0.6cm）、洗耳球、培养皿、微量加样器、注 射器、小烧杯
第二十二页，共29页。
调节血浆pH值,维持酸碱平衡 运输营养物质,代谢物,
第十六页，共29页。
注意事项
1、醋酸纤维素薄膜一定要充分(chōngfèn)浸透后才能点样。点样后电泳 槽一定要密闭。电流不宜过大，以防止薄膜干燥，电泳图谱出现条痕。 2、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影 响电泳区带分离效果。 3、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。 4、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。 5、通电过程中，不准取出或放入薄膜。通电完毕后，应先断开电源后再 取薄膜，以免触电。 6、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易 区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。
第二十六页，29页。
4.电泳 接通(jiē tōnɡ)电源，上负下正，调节电流3mA/管，电压260V-280V，待示踪 染料离管下口0.5cm时切断电源。
第二十七页，共29页。