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反胶团萃取法
反胶团：是分散于连续有机相中、由表面活性剂所形成的稳定的纳米尺度的聚集体。
反胶团萃取：是利用表面活性剂在有机溶剂中形成的反胶团，从而在有机相内形成分散的亲水微环境，使生物分子在有机相（萃取相）内存在于反胶团的亲水微环境中，消除了生物分子，特别是蛋白质类生物活性物质难溶解在有机相中或在有机相中发生不可逆变性的现象。
特点：
1.成本低，溶剂可反复使用；
2.萃取率高；
3.反胶团是透明的、热稳定的体系；
4.极性“水核”具有较强的溶解能力；
5.生物大分子由于具有较强的极性，可溶解于极性水核中，防止与外界有机溶剂接触，减少变性作用。
6.由于“水核”的尺度效应，可以稳定蛋白质的立体结构，增加其结构的刚性，提高其反应性能。
反胶团萃取法，亦称“逆胶束萃取法”。
利用反相微胶团在油相中形成的亲水空穴能选择性地溶解某些蛋白质分子的特性,来分离萃取蛋白质分子的一种方法。
反相微胶团是指油相中表面活性剂浓度超过临界胶团浓度后,在非极性油溶液中形成的聚集体,其内腔由表面活性剂分子的亲水头构成,外面被伸向连续油相的憎水尾部所包围,这种结构使其在连续油相中形成了许多亲水空穴,水相中的极性分子有可能溶解在油相中。
如水相中含有几种蛋白质,可调节系统的条件,使某些蛋白质溶于胶团中,而其他蛋白质则不能,以此达到分离的目的。
该法已成功地通过控制pH和氯化钾浓度,实现了α-核糖核酸酶、细胞色素C和溶菌酶的分离以及α-淀粉酶的连续萃取和反萃取操作。
反胶团萃取的原理
反胶团萃取是一种从溶液中去除胶体颗粒的方法。
它利用与胶体颗粒相反的电荷特性，通过添加电荷相反的染料或胶体颗粒，使胶体颗粒与添加剂发生吸附作用，形成重叠反胶团结构。
这些重叠的反胶团结构会相互吸引，从而形成更大的聚集体，使胶体颗粒变得更易沉淀。
该方法的原理是通过添加电荷相反的剂量，改变胶体颗粒表面的电荷性质。
胶体颗粒通常具有带负电或带正电的表面电荷分布，造成它们在溶液中的稳定分散。
当添加具有相反电荷的反胶团剂，如阳离子染料或阳离子胶体颗粒时，这些反胶团剂会吸附到胶体颗粒表面，改变胶体颗粒电荷的分布。
反胶团剂与胶体颗粒的吸附作用导致胶体颗粒之间的吸引力增强，形成更大的组块。
这些组块比起单个胶体颗粒更重，因此在重力或离心力的作用下更容易沉淀。
此外，重叠的反胶团结构还可以通过减少胶体颗粒与溶剂之间的接触面积，进一步促进沉淀。
反胶团萃取方法简单易行，并且可以有效地去除溶液中的胶体颗粒。
通过调整反胶团剂的剂量和溶液的pH值等条件，可以
控制胶体颗粒的去除效果。
然而，需要注意的是，该方法可能对一些溶液中的其他成分产生影响，因此在具体操作中需要仔细考虑和控制实验条件。
反胶团萃取1．研究背景传统的分离方法，如液-液萃取技术，具有操作连续、多级分离、放大容易和便于控制等优点，在化学、化工、石化等领域得到广泛应用。
但很难用于具有某些特殊性质的生化产品(如蛋白质、氨基酸等)的提取与分离，原因在于这类物质多数不溶于非极性有机溶剂，或与有机溶剂接触后会引起变性和失活。
20世纪80年代中期发展起来的反胶团萃取技术解决了这一难题。
所谓反胶团，是指当油相中表面活性剂的浓度超过临界胶束浓度后，其分子在非极性溶剂中自发形成的亲水基向内、疏水基向外的具有极性内核(polar core)的多分子聚集体(aggregates)。
反胶团的极性内核可以溶解某些极性物质，而且在此基础上还可以溶解一些原来不能溶解的物质，即所谓二次加溶原理。
例如，反胶团的极性内核在溶解了水后，在内核中形成“水池”(water poo1)，可以进一步溶解蛋白质、核酸和氨基酸等生物活性物质。
胶团的屏蔽作用，使这些生物物质不与有机溶剂直接接触，而水池的微环境又保护了生物物质的活性，从而达到了溶解和分离生物物质的目的。
这种技术既利用了溶剂萃取的优点，又实现了生物物质的有效分离，作为一种新型的生物分离技术应用于蛋白质、氨基酸及药物、农药等物质的分离分析中，显示了巨大的应用潜力。
[1]2．文献综述2.1反胶团的形成[2]正向胶团(normal micelle)是表面活性剂分子在极性溶剂，如水中形成的一种亲水基团(头)朝外，而疏水基团(尾)朝内的具有非极性内核的多分子聚集体。
洗涤剂中的表面活性剂分子在水中形成的就是这种胶团，其非极性内棱可以溶解各种油污。
从而达到去污的效果。
与此相反，表面活性剂在非极性溶剂如某些有机溶剂中就会形成亲水头向内和疏水尾向外的具有极性内核(polar core)的多分子聚集体(aggregates)，由于其表面活性剂的排列方向与一般的正向胶团相反，因此，称为反胶团。
示意图如图（2－1）。
图2－1 表面活性荆分子在非极性溶荆中形成的反胶目反胶团的极性内核可以溶解某些极性物质，而且在此基础上还可以溶解一些原来不能溶解的物质，即所谓二次加溶原理。
例如，反胶团的极性内核在溶解了水后，在内核形成了“水池”(water pool)，可以进一步溶解蛋白质、核酸、氨基酸等生物活性物质。
由于胶团的屏蔽作用，使这些生物物质不与有机溶剂直接接触，而水池的微环境又保护了生物物质的活性，达到了藩解和分离生物物质的目的。
图2－2是解释此过程的一种常用的模型一“水壳模型”的示意图。
图2－2 利用反胶团特蛋白质溶解于有机溶荆中的水壳模型这种技术既利用了溶剂萃取的优点，又实现了生物物质的有效分离，成为一种新型的生物分离技术。
2.2 反胶团及其萃取原理反胶团是表面活性剂溶解在有机溶剂中形成的纳米级聚集体，是一种透明、稳定的热力学体系。
反胶团中表面活性剂非极性头向外与有机溶剂接触，极性头向内形成极性核，极性核溶入水后形成微“水池”。
反胶团的一个重要参数是它的含水量(“水池”中溶入的水与表面活性剂的摩尔比，W0)，它决定反胶团的尺寸。
在W0<10时[3]，水分子被束缚在反胶团的壁上，它的凝固点下降、共价键参数改变、氢键破坏；只有在W。
较大时，才存在自由水。
当含反胶团的有机溶剂和蛋白质水溶液接触时，蛋白质在某种作用力(静电、亲和、疏水)下进入“水池”中，水和表面活性剂分子在蛋白质周围形成一个保护层，使蛋白质避免与有机溶剂接触，不致失活。
2.3 反胶团萃取蛋白质的影响因素蛋白质的萃取受很多因素影响，这些因素包括原料液的pH值、离子强度、表面活性剂和有机溶剂种类等：蛋白质等电点、亲水性、电荷密度及分布也是影响其萃取的重要因素。
2.3.1 表面活性剂表面活性剂是反胶团萃取的一个关键因素，不同结构的表面活性剂形成的反胶团含水量和性能有很大差别。
通常希望所选表面活性剂形成极性核较大的反胶团，且反胶团与蛋白质的作用不应太强，以减少蛋白质的失活。
最常用的是阴离子表面活性剂丁二酸(二)-2-乙基己基酯磺酸钠(AOT)，它形成反胶团时，不需要加入助剂。
AOT反胶团体系适宜于萃取小分子量(分子量<30kDa)蛋白质(如溶菌酶、胰蛋白酶、细胞色素C等)。
Somnuk等[4]用AOT-异辛烷体系进行了从发酵液中提取细胞色素C、溶解酵素、核糖核酸酶A的试验，结果三种酶的最终萃取率在70％~97％之间，并发现酶在原料液中的初始浓度对萃取率[萃入有机相的蛋白质浓度(或质量)与原料相中蛋白质浓度(或质量)的比值]没有影响。
Ludger[5]等用同一反胶团体系在Graesser接触器中对溶解酵素和细胞色素C进行提取，40min后，两者的萃取率都在95％以上。
AOT 反胶团体系对于分子量较大(胃蛋白酶、血红蛋白、血清蛋白等)的蛋白质萃取率很低，且易在两相界面形成不溶性凝聚物[6,7]。
分子量大，蛋白质的体积就大，传递过程中障碍也大，所以萃取率相对的小。
Goto[8]等合成了一系列双油基磷酸型(DOLPA、DTDPA、DEPTA)表面活性剂。
他们发现，DTDPA反胶团体系对溶解酵素和细胞色素C的萃取率近乎100％，对血红蛋白(HB)的萃取率为80％；而同一条件下AOT反胶团体系对HB的萃取率仅为16％，且在两相界面上有红色不溶凝聚物出现。
结果表明，决定蛋白质萃取率的一个关键因素是表面活性剂的疏水基结构，由于表面活性剂的疏水基和蛋白质的疏水部位问的作用，可显著提高蛋白质萃取率。
为使大分子蛋白质溶入反胶团，所用表面活性剂有较强的疏水性是必要的，DTDPA疏水基比AOT 大，对蛋白质的输水部位作用较强，所以对血红蛋白有较好的萃取。
Long等[9]用DEPTA-异辛烷萃取血红蛋白的试验。
结果表明，原料相中血红蛋白浓度为0.5mg/mL、KC1为0．2mol/L，有机相中DEPTA为0.02mol/L时，HB的萃取率在等电点附近达到97％；经紫外检测，反萃后的HB与原料相的HB谱峰无显著差异，表明HB仍保持较高的活性。
常用的阳离子表面活性剂有三辛基甲基氯化铵(TOMAC)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基苯基氯化铵(DMBAC)、Aliquat366等铵盐；利用非离子表面活性剂形成反胶团的研究很少，主要有Span-60、Tween-80等。
向单一反胶团体系中加入助表面活性剂或导入亲和试剂形成复合反胶团体系，这样能显著提高反胶团的选择性和蛋白质的萃取率。
近年来，复合反胶团体系研究的较多。
Koichiro[10]等采用AOT-TOA(长链烷基胺)混合反胶团体系萃取溶菌素酶和牛血清蛋白(BSA)的研究。
AOT/TOA体系与酸性原料液混合时，TOA与HB结合形成阳离子铵盐，铵盐能和极性头带负电的AOT作用形成复合物，从而改变反胶团的性能。
他们发现，对于溶菌素酶，AOT和AOT-TOA的萃取率相近。
在pH<5时，AOT 体系在界面和水相中有不溶物出现，这是由于强烈的静电作用，溶菌素酶和AOT结合形成凝聚物所致，AOT-TOA无此现象。
AOT反胶团体系在较宽的pH范围内对大分子蛋白质BSA的萃取率很低，且有凝聚物出现。
AOT-TOA对BSA 的萃取率在90％以上，这说明TOA的加入改变了AOT与BSA之间的作用力(静电或疏水)，抑制了凝聚物的形成。
严勇朝[11]等用TRPO-AOT萃取牛血红蛋白时发现，混合反胶团的萃取能力高于单纯的AOT，前者在pH较宽范围内保持很高的萃取率。
DLS(动力光散射仪结果证实，TRP0使AOT反胶团变大，从而提高其萃取容量。
2.3.2 亲和助剂在反胶团中导入与目标蛋白有特异亲和作用的助剂可形成亲和反胶团。
亲和助剂的极性头是一种亲和配基，可选择性地结合目标蛋白，该系统使蛋白质的萃取率和选择性大大提高。
而且可使操作参数(如pH值、离子强度)的范围变宽。
Zhang等[12]采用CTAB-己烷反胶团系统，以色素Cibicaron Blue 3GA (CB)为亲和配体，发现在等电点附近，CB为1.6mmol/L时，BSA的萃取率由7.88％提高到63％，并使可发生萃取的pH范围增大。
在等电点附近，反胶团和蛋白质的静电作用很弱，CB的加入说明亲和作用是BSA萃取率提高的主要因素。
Motonari[13]等向C10E4反胶团中导入胰岛素抑制剂作为亲和配体，成功地从胰液素中提取出胰岛素，并抑制了胰岛素的自身降解。
C10E4是非离子表面活性剂，对亲水性蛋白质的静电作用很小，抑制剂的亲和作用是该过程的主要动力。
研究表明[14,15]，亲和反胶团体系具有很好的开发应用前景。
2.3.3 水相pH值pH值对蛋白质萃取过程的影响主要体现在改变蛋白质的表面电荷上。
一定条件下，当原料相pH值小于蛋白质的等电点(PI)时，蛋白质表面带正电，如选用的反胶团内核带负电，蛋白质会在静电作用下由水相转入反胶团相，从而实现不同PI的蛋白质分离。
一般说来，不同蛋白质达到最大萃取率时原料液pH值偏离蛋白质PI的程度不一样，但pH偏离PI较远时，由于强烈的静电作用，表面活性剂吸附于蛋白质表面，在两相界面形成蛋白质一表面活性剂不溶凝聚物，蛋白质变性严重。
2.3.4 离子强度的影响离子影响蛋白质表面电荷的分布及表面活性剂的电离程度，一个重要因素是萃取过程中随蛋白质一起进入反胶团极性核的离子会产生“屏蔽”作用，减小表面活性剂极性头之间的相斥力，反胶团变小，性能改变。
Yashhiro等[16]采用AOT-异辛烷体系研究了不同离子对溶菌素酶的萃取情况。
结果发现，对KC1-KC1(原料相和反萃相的盐的种类)体系，溶菌素酶能成功被萃取和反萃；对NaC1-KC1体系，虽然形成的反胶团尺寸较大，但在界面出现了不溶性凝聚物，不利萃取；对KC1-BaC12体系，由于Ba2+与表面活性剂的极性头问的强烈静电作用，Ba2+聚结在反胶团极性核内，反胶团最小。
表面活性剂、Ba2+、蛋白质形成复杂的凝聚物，无法完成溶菌素酶的萃取。
通常，随着离子强度的增大，蛋白质与反胶团内核的静电作用变弱，萃取率减小。
Giordana等[17]用AOT反胶团萃取。
一糜蛋白酶时发现所选离子种类(NaC1，KC1，LiC1，CaC12 )和浓度对萃取率均有显著影响。
随离子强度增大，萃取率降低；相同萃取率时对应各种离子强度也有显著差别。
离子强度最小为0.08mol/L。
Li+最大为1.2mol/L。
Andrews等用同样的反胶团体系考察了核糖核酸酶A等四种蛋白质的萃取情况。
结果表明，随离子强度( K+，Na+)增大，四种蛋白质的萃取率均减小，当原液相中为K+时，萃取率减小趋势比Na+快的多，这说明半径较大的K+“屏蔽”作用较强，使蛋白质和反胶团间的作用力减小较快。
对于疏水性强的蛋白质，由于它和表面活性剂及有机溶剂的强烈疏水作用，萃取率受离子强度影响也小。
