改良大鼠神经功能缺损评分mNSS

血塞泰对缺血性脑卒中大鼠STIM1、Orai1蛋白表达的影响郑钰;张逸凡;王子焱;刘承鑫;任欣;聂子星;郭志华;申思【期刊名称】《湖南中医药大学学报》【年(卷),期】2024(44)4【摘要】目的研究血塞泰对缺血性脑卒中(ischemic stroke,IS)大鼠基质相互作用分子1(stromal interaction molecule 1,STIM1)及钙释放激活钙通道蛋白1(calcium release-activated calcium channel protein 1,Orai1)的影响。

方法选取60只SPF级雄性SD大鼠,随机分为假手术组10只、造模组50只,采用线栓法制备大脑中动脉栓塞(medial cerebral artery occlusion,MCAO)模型。

采用随机数字表法将造模成功的41只大鼠分为模型组、血塞泰低剂量组(12.6 g/kg)、血塞泰中剂量组(25.2 g/kg)、血塞泰高剂量组(50.4 g/kg)和阿司匹林肠溶片组(18 mg/kg),其中血塞泰低剂量组9只,其余每组各8只;假手术组和模型组给予等量生理盐水灌胃。

每组连续干预7 d。

采用改良神经功能损伤评分(modified Neurological Severity Score,mNSS)评估各组大鼠神经功能损伤情况,TTC染色法检测大鼠脑组织的梗死面积,ELISA法测定大鼠血清中的白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)含量,RT-PCR检测脑组织中STIM1、Orai1 mRNA的表达,免疫共沉淀检测脑组织STIM1、Orai1的蛋白相对表达水平。

结果与假手术组相比,模型组大鼠mNSS评分增加(P<0.01),脑梗死率增加(P<0.01),血清IL-6、TNF-α含量增加(P<0.01),脑组织STIM1、Orai1 mRNA表达水平和蛋白相对表达水平升高(P<0.01)。

草酸艾司西酞普兰对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用张建斌;李晓慧【摘要】目的：探讨草酸艾司西酞普兰对局灶性脑缺血再灌注大鼠的神经保护作用及可能的机制。

方法取SD雄性大鼠160只，随机分为假手术组（Sham组）、生理盐水组（NS组）、干预组（CIT组，又分干预14 d组和21 d组）。

线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注（MCAO）模型，使用改良神经功能缺损（modified neurological severity score，mNSS）量表评价各组大鼠神经功能缺损情况。

分别于术后14 d和21 d按不同的实验时间点，使用激光共聚焦技术观察各组大鼠缺血区微血管直径、密度和总面积。

酶联免疫吸附法检测血浆血管内皮生长因子（VEGF）浓度。

免疫组化染色法和蛋白质印迹法检测VEGF表达。

结果模型制作后，干预14 d组和干预21 d组内的大鼠神经功能缺损情况明显改善，各项指标检测结果如下：术后14 d mNSS评分，生理盐水组评分为（6.57±1.13）分，干预14 d组评分为（4.39±0.92）分，较生理盐水组明显降低（P＜0.05）；术后21 d mNSS评分，干预21 d组[（3.23±0.55）分]较干预14 d组[（4.14±0.74）分]明显降低（P＜0.01）。

术后14 d三维共聚焦结果显示：药物干预的效果随着时间的推移而逐步见效。

术后14 d酶联免疫吸附法结果显示：相对于假手术组、生理盐水组干预14 d组和干预21 d组血浆VEGF浓度显著增加，药物干预后的实验组VEGF蛋白水平可显著增高。

术后14 d免疫组化分析法显示：干预21 d组缺血脑组织VEGF表达显著性高于干预14 d组（P＜0.01）。

结论草酸艾司西酞普兰可以明显减轻脑缺血再灌注大鼠的神经损伤和改善神经功能，具有神经保护作用，且药物干预的效果随着时间的推移而逐步增强，其机制可能与VEGF介导的血管新生有关。

modified neurological severity scoresModified Neurological Severity Scores (mNSS)是一种通过快速、经济地测量神经功能障碍程度来评估中风或其他神经系统疾病（例如脑损伤、脊髓损伤等）患者恢复的方法。

这种方法是通过对具有各种神经系统临床症状的患者进行全面评估来实现的。

在下面的文章中，我们将详细介绍如何使用这种方法进行评估。

步骤一：检查神经功能在使用mNSS评估时，首先需要对患者的神经功能进行检查。

这包括评估患者的触觉和反射反应、前臂和手掌的肌肉力量等。

这些功能检查是确定病患恢复情况的关键因素。

需要注意的是，这些测试可能需要在不同时间段内进行多次，以确保患者病情的稳定性。

步骤二：进行评估然后，需要对患者进行评估。

评估过程基于mNSS算法，其包括一系列可能代表神经系统受损的症状。

这些症状包括患者的触觉、前臂和手掌的肌肉力量、反射反应、身体平衡和协调等方面。

在评估过程中，需要进行各种测试和测量，以确定患者在不同方面的神经功能受损程度。

这些测试包括感觉测试、协调和平衡测试以及康复锻炼等。

步骤三：分析数据对患者的各项测试数据进行分析，以便了解患者的神经系统疾病的严重程度及其对患者的生活产生的影响。

这些数据可以通过使用不同算法进行分析，例如统计分析、曲线分析等。

分析数据有助于确定治疗的效果以及病情的转化。

步骤四：制定治疗方案根据数据分析结果，可以制定出适合患者的治疗方案。

这些治疗方案可以包含康复锻炼、药物治疗、其他非药物治疗等方式，以改善患者的症状和促进患者生活的质量。

总结：在这个流程中，每个步骤都是为了尽可能准确地评估患者的神经系统功能，以便根据此进行治疗方案的设计。

mNSS是一种稳健的测量工具，可以帮助医生更好地了解患者的神经系统患病情况，进而确定治疗方案。

这种方法的主要优点是简单易执行、经济实用以及数据分析的精准度高。

第 49 卷第 5 期2023年 9 月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.49 No.5Sep.2023DOI：10.13481/j.1671‑587X.20230511色甘酸二钠对大鼠脑缺血/再灌注损伤的改善作用及其机制朱娴, 陈薪旭, 陈奕斌, 黎昌炫, 刘杰, 王埮（海南医学院第一附属医院神经内科，海南海口570102）［摘要］目的目的：探讨色甘酸二钠（SCG）对缺血性卒中（CIS）大鼠神经功能和认知功能的影响，阐明其作用机制。

方法方法：选取80只雄性SD大鼠，随机选取18只作为假手术组，剩余大鼠采用线栓法构建大鼠脑缺血/再灌注（I/R）损伤模型。

将造模成功的45只大鼠随机分为I/R组、I/R+低剂量SCG组和I/R+高剂量SCG组，每组15只。

造模后24 h，I/R+低剂量SCG组和I/R+高剂量SCG组大鼠分别腹腔注射20 和60 mg·kg－1 SCG，连续2周。

采用改良的神经功能缺损程度评分（mNSS）法评估各组大鼠神经功能评分，2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色检测各组大鼠脑梗死面积，Y型迷宫实验检测各组大鼠记忆能力，电生理检测各组大鼠正确反应率、正确反应时间和兴奋性突触后电位（fEPSP）斜率，高尔基染色检测各组大鼠脑组织中海马齿状回区树突棘密度，免疫荧光法检测各组大鼠脑组织中海马齿状回区5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）阳性细胞数和双肾上腺皮质激素（DCX）蛋白表达水平， Western blotting法检测各组大鼠脑组织中脑源性神经营养因子（BDNF）、抗酪氨酸激酶受体B（TrkB）、神经生长因子3（NT-3）和抗酪氨酸激酶受体C（TrkC）蛋白表达水平。

结果：与假手术组比较，I/R组大鼠神经功能评分升高（P<0.05），脑梗死区域面积增大（P<0.05），正确反应率降低（P<0.05），正确反应时间增加（P<0.05），fEPSP斜率和树突棘密度降低（P<0.05），脑组织齿状回区BrdU阳性细胞数和DCX蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05），海马组织中NT-3蛋白表达水平升高（P<0.05），而BNDF、TrkB和TrkC蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。

大鼠行为学实验评价汇总大鼠行为学评定方法比较大鼠进行行为学评定(behavior test)的十分重要，对其评定的方法也颇多，但究竟那种方法更适用，目前未有人进行过比较。

为了合理选择MCAO后的评定方法，如下对目前常用的几种行为学评定方法进行比较。

行为学检查方法:由3位参加试验的人员分别以单盲法对试验的大鼠进行打分和记录.然后将3组的记分结果进行平均后的得分进行统计计算。

（国内）由一个对试验实施过程不了解的观察者对大鼠进行行为学评测。

评测续贯进行。

如果大鼠在一次评测中出现恰当的行为，而以后却未出现，按前者记分。

(国外)1. 神经行为学检查Longa评分法2．Berderson评分法姿势反射测验（postural reflex test）3. 攀绳实验4．网屏测验（screen test）5．肢体放置测验（limb-placement test）Elicited Forelimb Placing6．开野试验（Open－Field法）测定行为7．MNSS8.转动杆测验（rotating pole test）9．Rotation10．肢体对称试验评分法11. rotarod test12. adhesive-removal somatosensory test13．Spontaneous Activity14．Symmetry in the Movement of Four Limbs15．Forepaw Outstretching16．Climbing17．Body Proprioception18. Response to Vibrissae Touch改善记忆作用1.跳台试验2.避暗试验3.穿梭箱试验4.水迷宫试验Motor behavior(1) observation of spontaneous ipsilateral circling,(2) contralateral hindlimb retraction,(3) beam walking ability,平衡木测验（balance beam test）(4) bilateral forepaw grasp,Skilled forelimb function(1)staircase feeding apparatusnociception(1) plantar test1．神经行为学检查:Longa评分法神经学检查分5个等级：0分：正常，无神经功能缺损；1分：左侧前爪不能完全伸展，轻度神经功能缺损；2分：行走时，大鼠向左侧（瘫痪侧）转圈，中度神经功能缺损；3分：行走时，大鼠身体向左侧（瘫痪侧）倾倒。

网络出版时间：２０２３－１１－０８１６：２４：０４　网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｎｋ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｕｒｌｉｄ／３４．１０８６．Ｒ．２０２３１１０８．１３５４．００２◇复方药物药理学◇昼夜环境紊乱对缺血性中风后血管新生的影响及活血荣络方的干预作用曾富康１，张宇星２，周德生２，陈　瑶２，李　中２，刘利娟２（１．湘西州民族中医院重症医学科，湖南吉首　４１６０００；２．湖南中医药大学第一附属医院脑病科，湖南长沙　４１０００７）收稿日期：２０２３－０３－２３，修回日期：２０２３－０６－２３基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ８２１０４７６６）；湖南省自然科学基金项目（Ｎｏ２０２１ＪＪ３０５２１，２０２１ＪＪ４０４２４）；湖南省卫健委科研项目（Ｎｏ２０２１０３０７１１９０）；湖南省中医药管理局资助项目（Ｎｏ２０２１２１８）；湖南中医药大学中西医结合一流学科开放基金（Ｎｏ２０２０ＺＸＹＪＨ３８，２０２０ＺＸＹＪＨ３９）；湖南中医药大学校级科研基金与联合基金项目（Ｎｏ２０２１ＸＪＪＪ０３９，２０２１ＸＪＪＪ０５２）作者简介：曾富康（１９９６－），男，硕士，研究方向：防治神经系统疾病的中医药药理学，Ｅ ｍａｉｌ：１５０８８６６０７４＠ｑｑ．ｃｏｍ；刘利娟（１９８５－），女，博士，副主任医师，研究方向：中药药理作用对脑血管病及其并发症的防治，通信作者，Ｅ ｍａｉｌ：６０１２６４９６７＠ｑｑ．ｃｏｍｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２２０６０７８文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２３）１１－２１７７－０９中国图书分类号：Ｒ ３３２；Ｒ２８９ ５；Ｒ３２２ ８１；Ｒ３６４ ３；Ｒ３６４ ５；Ｒ７４３ ３１；Ｒ８５２ ６摘要：目的　观察昼夜环境紊乱对缺血性中风后血管新生的影响及活血荣络方的干预作用。

方法　ＳＤ大鼠随机分假手术组、模型组（ＭＣＡＯ）、活血荣络方组（ＭＣＡＯ＋ＨＸＲＬＦ）、模型＋生物节律紊乱组（ＭＣＡＯ ＥＣＤ）及模型＋生物节律紊乱＋活血荣络方组（ＭＣＡＯ ＥＣＤ＋ＨＸＲＬＦ），建立大脑中动脉闭塞再灌注模型，给药１０ｄ。

大承气汤对脑出血模型大鼠mNSS评分及Nrf2信号通路的影响杨树升;林丽;邱明义;田青【摘要】目的探讨大承气汤对脑出血大鼠模型的作用及机制.方法使用胶原酶Ⅶ于SD大鼠左侧尾壳核立体定位注射,复制脑出血模型,用低、高剂量大承气汤干预后,采用神经功能缺损评分、普鲁士蓝染色法检测大鼠脑出血后1、3、7、14、28 d时神经功能缺损和脑组织铁沉积的变化,用Western blot法检测脑出血后14 d 基底核Nrf2、TNF-α和Arg1的表达水平.结果高剂量大承气汤能有效逆转大鼠脑出血后神经功能受损,减少铁沉积,并下调基底核TNF-α和Nrf2水平,伴Arg1水平上升.结论大承气汤通过Nrf2介导的信号通路改善脑出血后神经功能缺损、减少脑组织铁沉积、促进抗炎性因子Arg1释放和抑制促炎性因子TNF-α释放,从而促进脑出血后脑组织恢复而发挥神经保护作用.【期刊名称】《华中科技大学学报（医学版）》【年(卷),期】2016(045)002【总页数】6页(P164-169)【关键词】大承气汤;脑出血;铁沉积;炎性因子;Nrf2【作者】杨树升;林丽;邱明义;田青【作者单位】湖北中医药大学,武汉430061;华中科技大学同济医学院基础医学院病理生理学系,武汉430030;武汉市十一医院中医科,武汉430015;湖北中医药大学,武汉430061;华中科技大学同济医学院基础医学院病理生理学系,武汉430030;湖北中医药大学,武汉430061;华中科技大学同济医学院基础医学院病理生理学系,武汉430030【正文语种】中文【中图分类】R743.34脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是由于脑血管脆性增加、破裂致使血液进入脑组织而引起的疾病。

ICH不包括外伤性脑出血，属于临床卒中，其死亡率高[1]，幸存者往往伴有长期或终生的神经功能障碍或部分缺失。

在美国、欧洲和澳大利亚，约10%～15%卒中为ICH，而在亚洲，该比率为20%～30%，综合全球范围该比率约为9%～27%[2]。

大鼠行为学实验评价汇总大鼠行为学评定方法比较大鼠进行行为学评定(behavior test)的十分重要，对其评定的方法也颇多，但究竟那种方法更适用，目前未有人进行过比较。

为了合理选择MCAO后的评定方法，如下对目前常用的几种行为学评定方法进行比较。

行为学检查方法:由3位参加试验的人员分别以单盲法对试验的大鼠进行打分和记录.然后将3组的记分结果进行平均后的得分进行统计计算。

（国内）由一个对试验实施过程不了解的观察者对大鼠进行行为学评测。

评测续贯进行。

如果大鼠在一次评测中出现恰当的行为，而以后却未出现，按前者记分。

(国外)1. 神经行为学检查Longa评分法2．Berderson评分法姿势反射测验（postural reflex test）3. 攀绳实验4．网屏测验（screen test）5．肢体放置测验（limb-placement test）Elicited Forelimb Placing6．开野试验（Open－Field法）测定行为7．MNSS8.转动杆测验（rotating pole test）9．Rotation10．肢体对称试验评分法11. rotarod test12. adhesive-removal somatosensory test13．Spontaneous Activity14．Symmetry in the Movement of Four Limbs15．Forepaw Outstretching16．Climbing17．Body Proprioception18. Response to Vibrissae Touch改善记忆作用1.跳台试验2.避暗试验3.穿梭箱试验4.水迷宫试验Motor behavior(1) observation of spontaneous ipsilateral circling,(2) contralateral hindlimb retraction,(3) beam walking ability,平衡木测验（balance beam test）(4) bilateral forepaw grasp,Skilled forelimb function(1)staircase feeding apparatusnociception(1) plantar test1．神经行为学检查:Longa评分法神经学检查分5个等级：0分：正常，无神经功能缺损；1分：左侧前爪不能完全伸展，轻度神经功能缺损；2分：行走时，大鼠向左侧（瘫痪侧）转圈，中度神经功能缺损；3分：行走时，大鼠身体向左侧（瘫痪侧）倾倒。

MCAO造模后行为学评定小结MCAO后大鼠行为学评定方法比较在对MCAO后大鼠进行行为学评定(behavior test)的十分重要，对其评定的方法也颇多，但究竟那种方法更适用，目前未有人进行过比较。

为了合理选择MCAO后的评定方法，如下对目前常用的几种行为学评定方法进行比较。

行为学检查方法:由3位参加试验的人员分别以单盲法对试验的大鼠进行打分和记录.然后将3组的记分结果进行平均后的得分进行统计计算。

（国内）由一个对试验实施过程不了解的观察者对大鼠进行行为学评测。

评测续贯进行。

如果大鼠在一次评测中出现恰当的行为，而以后却未出现，按前者记分。

(国外)1. 神经行为学检查 Longa评分法2．Berderson评分法姿势反射测验（postural reflex test）3. 攀绳实验4．网屏测验（screen test）5．肢体放置测验（limb-placement test）Elicited Forelimb Placing6．开野试验（Open－Field法）测定行为7．MNSS8.转动杆测验（rotating pole test）9．Rotation10．肢体对称试验评分法11. rotarod test12. adhesive-removal somatosensory test13．Spontaneous Activity14．Symmetry in the Movement of Four Limbs15．Forepaw Outstretching16．Climbing17．Body Proprioception18. Response to Vibrissae Touch改善记忆作用1.跳台试验2.避暗试验3.穿梭箱试验4.水迷宫试验Motor behavior(1) observation of spontaneous ipsilateral circling,(2) contralateral hindlimb retraction,(3) beam walking ability,平衡木测验（balance beam test）(4) bilateral forepaw grasp,Skilled forelimb function(1)staircase feeding apparatusnociception(1) plantar test1．神经行为学检查:Longa评分法神经学检查分5个等级：0分：正常，无神经功能缺损；1分：左侧前爪不能完全伸展，轻度神经功能缺损；2分：行走时，大鼠向左侧（瘫痪侧）转圈，中度神经功能缺损；3分：行走时，大鼠身体向左侧（瘫痪侧）倾倒。

第59卷 第5期2023年10月青岛大学学报(医学版)J O U R N A LO FQ I N G D A O U N I V E R S I T Y (M E D I C A LS C I E N C E S)V o l .59,N o .5O c t o b e r 2023[收稿日期]2022-04-07; [修订日期]2023-10-16[基金项目]青岛市博士后基金项目(2018-80)[第一作者]王素平(1971-),女,硕士,主任医师㊂E -m a i l:w a n g j i n g l i n g@163.c o m ㊂[通信作者]张睿(1980-),男,博士,副主任医师,硕士生导师㊂E -m a i l :z z t g@163.c o m ㊂h U C -M S C s 源性神经干细胞样细胞对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用王素平1,钟亮1,兰小磊2,翟秋月3,张睿3(1 青岛市第三人民医院神经康复科,山东青岛 266041; 2 青岛大学附属医院神经外科; 3 青岛大学附属医院神经外科监护室)[摘要] 目的 探究人脐带间充质干细胞(h U C -M S C s )来源的神经干细胞样细胞(N S C L C s)对大脑中动脉闭塞/再灌注(M C A O /R )损伤的保护作用㊂方法 将h U C -M S C s 诱导成N S C L C s ㊂选取250~280g 雄性S p r a gu e D a w l e y 大鼠30只,随机分为假手术组(S h a m 组)㊁模型组(M C A O /R 组)和治疗组(N S C L C s 组)㊂采用线栓法构建M C A O /R 损伤模型,N S C L C s 组造模后采用经颈外-颈内动脉注射移植N S C L C s 治疗㊂通过改良神经功能缺损评分(m N S S 评分)评估各组大鼠的神经行为功能,苏木精-伊红(H E )染色观察神经元形态结构,免疫组化染色观察神经元核蛋白(N e u N )表达㊂结果 M C A O /R 组大鼠m N S S 评分较S h a m 组显著下降,而N S C L C s 组较M C A O /R 组显著升高(F =5.119,P <0.05);M C A O /R 组损伤神经细胞较S h a m 组增多,而N S C L C s 组较M C A O /R 组显著减少(F =173.928,P <0.01);N e u N 阳性细胞数目M C A O /R 组较S h a m 组显著降低,而N S C L C s 组较M C A O /R组显著升高(F =73.120,P <0.01)㊂结论 N S C L C s 移植可通过改善神经元细胞损伤对大鼠脑缺血再灌注损伤发挥保护作用㊂[关键词] 神经干细胞;间质干细胞;脑缺血;再灌注损伤;神经保护;大鼠[中图分类号] R 743.3;R 338.2 [文献标志码] A [文章编号] 2096-5532(2023)05-0709-05d o i :10.11712/jm s .2096-5532.2023.59.167[开放科学(资源服务)标识码(O S I D )][网络出版] h t t ps ://l i n k .c n k i .n e t /u r l i d /37.1517.R.20231129.1359.002;2023-11-30 17:07:28T H E P R O T E C T I V EE F F E C TO FN E U R A LS T E MC E L L -L I K EC E L L SD E R I V E DF R O M H U M A NU M B I L I C A LC O R D M E S E N C H Y -M A LS T E M C E L L SA G A I N S TC E R E B R A LI S C H E M I A /R E P E R F U S I O NI N J U R YI N R A T S WA N G S u p i n g ,Z H O N G L i a n g ,L A N X i a o l e i ,Z HA IQ i u y u e ,Z HA N GR u i (D e p a r t m e n t o fN e u r o l o g y R e h a b i l i t a t i o n ,T h e 3r dH o s p i t a l o fQ i n g d a oC i t y ,Q i n g -d a o 266041,C h i n a)[A B S T R A C T ] O b j e c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h e p r o t e c t i v ee f f e c to fn e u r a l s t e mc e l l -l i k ec e l l s (N S C L C s )d e r i v e df r o m h u m a n u m b i l i c a l c o r dm e s e n c h y m a l s t e m c e l l s (h U C -M S C s )a g a i n s t m i d d l ec e r e b r a l a r t e r y o c c l u s i o n /r e p e r f u s i o n (M C A O /R )i n j u r y in r a t s . M e t h o d s T h eh U C -M S C sw e r e i n d u c e d i n t oN S C L C s .At o t a l o f 30m a l e S p r a g u e -D a w l e y r a t sw e i g h i n g 250-280g w e r e r a n d o m l y d i v i d e d i n t os h a m -o p e r a t i o n g r o u p (S h a m g r o u p ),m o d e l g r o u p (M C A O /R g r o u p ),a n dt r e a t m e n t g r o u p (N S C L C s g r o u p ).T h e s u t u r em e t h o dw a s u s e d t oe s t a b l i s ha r a tm o d e l o fM C A O /R ,a n da f t e rm o d e l i n g ,t h e r a t s i nt h e t r e a t m e n t g r o u pw e r e t r e a t e dw i t h N S C L C st r a n s p l a n t a t i o n v i at h ee x t e r n a l -i n t e r n a lc a r o t i d a r t e r y .T h e m o d i f i e d N e u r o l o g i c a lS e v e r i t y Sc o r e (m N S S )w a s u s ed t oe v a l u a t e t h e n e u r o b e h a v i o r a lf u n c t i o no f r a t s i ne a c hg r o u p ,H Es t a i n i n g wa su s e d t oob s e r v en e u r o n a lm o r -p h o l o g y a n d s t r uc t u r e ,a n di mm u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n g w a su s e dt o m e a s u r et h ee x pr e s s i o no fn e u r o n a lN e u r e x i n (N e u N ).R e s u l t s T h eM C A O /R g r o u p h a d a s i g n i f i c a n t r e d u c t i o n i nm N S S s c o r e c o m p a r e dw i t h t h e S h a m g r o u p ,w h i l e t h eN S C L C s g r o u p h a da s i g n i f i c a n t i n c r e a s e c o m p a r e dw i t h t h eM C A O /R g r o u p (F =5.119,P <0.05).C o m p a r e dw i t h t h e S h a m g r o u p,t h eM C A O /R g r o u p h a d a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n t h e n u m b e r o f i n j u r e dn e u r o n a l c e l l s ,a n dc o m p a r e dw i t h t h eM C A O /R g r o u p ,t h eN S C L C s g r o u p h a d a s i g n i f i c a n t r e d u c t i o n i n t h e n u m b e r o f s u c h c e l l s (F =173.928,P <0.01).C o m p a r e dw i t h t h e S h a m g r o u p,t h eM C A O /R g r o u p h a d a s i g n i f i c a n t r e d u c t i o n i n t h en u m b e r o fN e u N -p o s i t i v e c e l l s ,a n dc o m p a r e dw i t ht h e M C A O /R g r o u p,t h eN S C L C s g r o u p h a d a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n t h e n u m b e r o f s u c h c e l l s (F =73.120,P <0.01). C o n c l u s i o n N S C L C s t r a n s pl a n t a t i o ne x e r t s a p r o t e c t i v e e f f e c t a g a i n s t c e r e b r a l i s c h e m i a /r e p e r f u s i o n i n j u r y i n r a t s b y i m p r o v i n g n e u r o n i n j u r y.[K E Y W O R D S ] n e u r a l s t e mc e l l s ;m e s e n c h y m a l s t e mc e l l s ;b r a i n i s c h e m i a ;r e p e r f u s i o n i n j u r y ;n e u r o pr o t e c t i o n ;r a t s 缺血性卒中发生率很高,组织纤溶酶原激活剂静脉溶栓是目前的主要治疗手段[1-3],但该治疗窗口狭窄且使出血转化的可能性增大[4-5]㊂临床上,脑缺血再灌注损伤可导致广泛的神经血管损伤和神经功能障碍[6-7]㊂由于中枢神经系统自我修复的能力有限,因此,替代方法将有望改善脑缺血再灌注的治710青岛大学学报(医学版)59卷疗[8]㊂神经干细胞(N S C s)能分化成神经元㊁星形胶质细胞和少突胶质细胞,具有补偿内源性神经细胞不足和改善细胞存活的炎症微环境的能力[9]㊂基于N S C s的细胞治疗成为脑缺血再灌注损伤的一种新型治疗策略㊂本研究将人脐带间充质干细胞(h U C-M S C s)诱导成神经干细胞样细胞(N S C L C s)后移植至缺血再灌注损伤大鼠脑内,旨在探讨N S C L C s移植对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及可能机制㊂1材料与方法1.1实验材料h U C-M S C s无血清培养基购自上海弗元生物科技有限公司;上皮细胞生长因子(E G F)以及碱性成纤维细胞生长因子(b F G F)购自美国P r e p r o T e c h 公司;B-27T M添加剂购自美国G i b c o公司;性别决定区Y-B o x2(S O X2)抗体购自武汉P r o t e i n t e c h公司; N e s t i n抗体购自美国S T E M C E L L公司;N e u N抗体购自武汉A B c l o n a l公司;H o e c h s t33342染色液及荧光二抗购自上海碧云天公司;改良苏木精-伊红(H E)染色试剂盒购自北京索莱宝公司㊂1.2实验方法1.2.1 h U C-M S C s诱导形成N S C L C s经青岛大学附属医院伦理委员会审议批准(Q Y F Y W Z L L 26435)㊁产妇知情同意后,取足月分娩的健康胎儿脐带10~15c m(包含脐带和胎盘连接处5~6c m)㊂采用机械分离培养组织块的方法分离获得h U C-M S C s,将获得的h U C-M S C s进行传代培养㊂取传至第6~8代的h U C-M S C s,将其接种至低吸附六孔板中,加入N S C L C s诱导培养液(D M E M/F12+ 20μg/LE G F+20μg/Lb F G F+20g/LB27),每隔2d换一次液,诱导7d后收集获得N S C L C s,细胞密度为1ˑ1010/L[10]㊂1.2.2动物分组及处理雄性S p r a g u eD a w l e y大鼠30只,体质量250~280g,由北京维通利华公司(S C X K(京)2016-0011)提供,在实验动物中心适应性饲养7d,术前禁食12h㊂随机取8只大鼠作为假手术组(S h a m组),剩余22只大鼠用于构建大脑中动脉闭塞/再灌注(M C A O/R)模型(M C A O/R组)及造模后N S C L C s治疗(N S C L C s组),M C A O/R 组和N S C L C s组每组至少8只大鼠存活㊂治疗7d 后处死大鼠取脑组织用于后续研究㊂所有动物实验均经青岛大学和青岛大学附属医院伦理委员会批准(批准号20210720S D15020211230062,Q Y F Y W Z L L 26598)㊂1.2.3 M C A O/R模型构建及N S C L C s移植大鼠称体质量,应用100g/L的水合氯醛(0.3m L/k g)腹腔注射麻醉以后,仰卧位固定,分离出颈总动脉(C C A)㊁颈内动脉(I C A)以及颈外动脉(E C A)㊂结扎E C A远心端,在其近心端和远心端之间剪出一缺口,将线栓由E C A缺口插入,插至深度为18~ 22mm处,微感阻力即可,缺血90m i n后,将线栓缓慢拔出完成缺血再灌注㊂N S C L C s移植方法参照已有的相关研究[11],在线栓拔出时,将注射用软管从E C A残端经C C A到达I C A,设置微量注射泵, 5m i n内注射100μL的细胞悬液,注射细胞数目为1ˑ106个㊂1.2.4改良神经功能缺损评分(m N S S评分)基于已有的相关研究,采用m N S S评分表评估各组大鼠神经行为功能[12]㊂m N S S评分表包括肌张力㊁运动㊁感觉㊁平衡和反射指标检测,总分为18分,评分越高说明神经系统损伤越严重㊂1.2.5细胞免疫荧光染色收集N S C L C s用P B S 洗涤,以40g/L多聚甲醛固定㊂透膜后,室温封闭1h㊂加一抗S O X2和N e s t i n(1ʒ100)在4ħ下孵育过夜㊂次日,滴加荧光二抗(1ʒ100)37ħ孵育1h后,用H o e c h s t33342对细胞核进行染色㊂1.2.6 H E染色取各组大鼠缺血皮质区域脑组织进行石蜡包埋并切片㊂按照说明书指示进行脱蜡水化㊁苏木精染色㊁分化液分化㊁返蓝液返蓝㊁伊红染色,脱水及透明后封片㊂光镜下观察,视野内苏木精所染细胞核的数目记为细胞总数,变性细胞通常表现为细胞核皱缩且着色加深㊂每张切片随机选取5个不重叠的视野,采用I m a g e J软件统计损伤神经元比例,即变性细胞指数(D C I),D C I=变性细胞数目/细胞总数㊂实验重复3次㊂1.2.7免疫组化染色取各组大鼠缺血皮质区域脑组织石蜡切片,干燥后经二甲苯㊁梯度乙醇脱蜡水化㊂经柠檬酸抗原修复液进行抗原修复后,封闭30m i n,加一抗N e u N(1ʒ100)4ħ孵育过夜㊂次日,加荧光二抗37ħ孵育1h,H o e c h s t33342染核后加入抗荧光淬灭剂封片㊂荧光光镜下观察,每张切片随机选取5个不重叠的视野,采用I m a g e J软件统计N e u N阳性细胞数目㊂实验重复3次㊂1.3统计学分析应用S P S S22.0软件进行统计学分析,计量数据以 xʃs表示,3组均数的比较采用单因素方差分5期王素平,等.h U C -M S C s 源性神经干细胞样细胞对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用711析,两两比较采用D u n n e t t 检验㊂P <0.05为差异有统计学意义㊂2 结 果2.1 N S C L C s 形成及鉴定第6代的h U C -M S C s 贴壁生长呈长梭形,悬浮培养诱导至第7天时,形成克隆球状N S C L C s (图1A )㊂细胞免疫荧光染色的结果显示,N S C L C s 呈N S C s 表面关键特异性抗原S O X 2(绿色)和N e s t i n (红色)阳性(图1B )㊂2.2 N S C L C s 治疗对M C A O /R 大鼠行为学评分的影响m N S S 评分结果显示,3组m N S S 评分差异有统计学意义(F =5.119,P <0.05)㊂两两比较结果显示,与M C A O /R 组相比,N S C L C s 组治疗7d 后的行为学评分显著降低(P <0.05)㊂见表1㊂2.3 N S C L C s 治疗对M C A O /R 大鼠神经元损伤的影响缺血皮质区H E 染色结果显示,S h a m 组神经元排列整齐,轮廓清晰,细胞核着色均匀;M C A O /R组细胞核着色加深且固缩,细胞排列无序;N S C L C s 治疗后,细胞损伤情况得到改善(图2)㊂3组D C I 比较差异有统计学意义(F =173.928,P <0.01)㊂两两比较结果显示,M C A O /R 组D C I 较S h a m 组显著升高(P <0.01),N S C L C s 组D C I 较M C A O /R组显著降低(P <0.05)㊂见表1㊂A :第6代的h U C -M S C s 形态学(左)及诱导第7天的N S C L C s 形态学(右);B :克隆球免疫荧光染色㊂①复合染色,②红色N e s t i n ,③绿色S O X 2,④蓝色H o e c h s t ㊂比例尺50μm ㊂图1 N S C L C s形成及鉴定注:红色箭头指示损伤细胞,黑色箭头指示正常细胞㊂H E 染色,400倍㊂图2 N S C L C s 治疗对M C A O /R 大鼠神经元损伤的影响2.4 N S C L C s 治疗对M C A O /R 大鼠N e u N 表达的影响大鼠缺血皮质区免疫组化染色结果显示,3组N e u N 阳性细胞数目差异有显著意义(F =73.120,P <0.01)㊂两两比较结果显示,与S h a m 组相比,M C A O /R 组N e u N 阳性细胞数目显著减少(P <0.01);与M C A O /R 组相比,N S C L C s 组N e u N 阳性细胞数目显著增多(P <0.05)㊂见图3㊁表1㊂3 讨 论目前,针对缺血性脑卒中,临床治疗方法主要是尽早恢复大脑局部血流供应,从而降低脑卒中发病后死亡㊁残疾或者功能障碍的发生率以及严重程表1 各组m N S S 评分㊁D C I 和N e u N 表达比较(n =8, x ʃs )组别m N S S 评分D C IN e u N 表达S h a m 组25.31ʃ5.33436.00ʃ44.19M C A O /R 组7.75ʃ0.7180.19ʃ2.46143.33ʃ24.95N S C L C s 组6.88ʃ0.84*69.24ʃ3.04*220.00ʃ16.09* 注:与M C A O /R 组比较,*F =5.119~173.928,P <0.05㊂度[13]㊂由于病人年龄㊁缺血部位和时间及局部神经细胞自我修复能力等因素存在差异,部分病人治疗后可能由于血流量的恢复而加剧脑损伤,即诱发缺血再灌注损伤,因而引起的瘫痪㊁感觉减退㊁失语㊁吞咽困难和认知障碍的发生率很高,加之中枢神经系统的再生能力有限,脑缺血再灌注损伤病人往往终身残疾[14-15]㊂研究表明,干细胞移植治疗逐渐成为712青岛大学学报(医学版)59卷绿色荧光标记细胞为N e u N阳性细胞,放大200倍㊂图3N S C L C s治疗对M C A O/R大鼠缺血皮质区N e u N表达的影响脑缺血再灌注损伤的新疗法[16]㊂N S C s由于可以分化成多种类型的神经细胞,已成为治疗脑缺血再灌注损伤的理想候选干细胞类型[17]㊂然而,N S C s的获取和移植后在富含活性氧㊁炎症因子缺血微环境中的低存活率和低分化率限制了其临床应用[18]㊂因此,寻找合适的N S C s来源,探索其对脑缺血再灌注损伤的临床治疗具有重要意义㊂相关研究结果表明,间充质干细胞(M S C s)在某些特定的条件下可以分化为N S C s或者神经祖细胞(N P C)[19-20]㊂b F G F和E G F是诱导M S C s成为N S C s的关键因子,且生长因子诱导的N S C s存活时间明显长于化学诱导者[21]㊂本研究在此基础上,添加E G F和b F G F诱导h U C-M S C s形成N S C L C s,并探究N S C L C s移植后对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用㊂动物行为学检测指标是判断脑缺血再灌注损伤治疗效果的重要指标之一[22]㊂本研究结果表明, N S C L C s移植后大鼠的神经行为学评分较M C A O/ R组显著提高,表明N S C L C s治疗可以改善脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能缺损㊂脑缺血再灌注发生可导致神经元损伤加剧,加上神经元自身无法再生,因此,减轻神经元损伤㊁促进其再生是治疗脑缺血再灌注损伤的重要思路之一[14]㊂本实验H E染色和神经元N e u N表达检测结果显示,N S C L C s治疗可显著改善M C A O/R导致的神经元损伤,并增强N e u N表达水平㊂综上所述,本研究通过细胞因子诱导法实现了h U C-M S C s向N S C L C s的诱导分化,并初步证实了N S C L C s移植对M C A O/R损伤大鼠具有较好的治疗效果,这为脑缺血再灌注损伤的治疗提供了新的思路㊂[参考文献][1]S P O R N SPB,M I N N E R U PJ,WA R N E K E N,e t a l.I m p a c to f t h e i m p l e m e n t a t i o no f t h r o m b e c t o m y w i t hs t e n tr e t r i e v e r s o n t h e f r e q u e n c y o f h e m i c r a n i e c t o m y i n p a t i e n t sw i t ha c u t e i s-c h e m i c s t r o k e[J].C l i n i c a lN e u r o r ad i o l o g y,2017,27(2):193-197.[2]WA H L G R E N N,MO R E I R AT,M I C H E LP,e t a l.M e c h a n i-c a l t h r o m b e c t o m y i na c u t e i s c h e m i cs t r o k e:c o n s e n s u ss t a t e-m e n t b y E S O-K a r o l i n s k aS t r o k eU p d a t 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