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基金项目：国家自然科学基金资助项目（８１７７１４１３）；辽宁省自然科学基金指导计划项目（２０１９ ＺＤ ０８８４）作者单位：１１６０３３辽宁省大连市中心医院神经内科（马舒贝）；大连市第三人民医院神经内科（孙威）；首都医科大学宣武医院脑血管病研究室（罗玉敏、赵海苹）通信作者：罗玉敏，Ｅｍａｉｌ：ｙｕｍｉｎ１１１＠ｃｃｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ·论著·ｄｂ／ｄｂ小鼠远端大脑中动脉闭塞模型行为学评估方法的筛选马舒贝 孙威 赵海苹 罗玉敏摘要：目的 通过对比分析瘦素受体突变导致自发性２型糖尿病的ｄｂ／ｄｂ小鼠远端大脑中动脉闭塞（ｄＭＣＡＯ）后行为学评估结果，筛选适合ｄｂ／ｄｂ小鼠ｄＭＣＡＯ模型的行为学评估方法。
方法 选择ｄｂ／ｄｂ小鼠作为２型糖尿病模型，选择同窝杂合子小鼠（ｄｂ／＋）和Ｃ５７野生型小鼠（ＷＴ）作为双对照组。
采用ｄＭＣＡＯ作为脑缺血模型。
测量各品系小鼠血糖水平及ｄＭＣＡＯ后３、３５ｄ时脑组织缺损体积以评估合并糖尿病的卒中模型造模是否成功。
选择以下行为学评估方法进行分析：转棒测试、圆筒测试、粘贴撕除测试、错步测试方法评估ｄＭＣＡＯ模型的感觉运动功能及运动协调性；选择Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫测试和新事物认知测试评估模型认知功能；选择旷场测试评估模型焦虑状态和一般运动能力及探索能力。
结果 ｄｂ／ｄｂ小鼠ｄＭＣＡＯ前后血糖水平均明显高于ｄｂ／＋和ＷＴ小鼠（均Ｐ＜０ ０１）；ｄＭＣＡＯ术后３ｄ，ｄｂ／ｄｂ小鼠脑组织缺损体积明显大于ｄｂ／＋小鼠［（１９ ３±１ ０）％比（１０ ９±１ ５）％，Ｐ＜０ ０１］和ＷＴ小鼠［（１２ １±１ ４）％，Ｐ＜０ ０５］，证明合并糖尿病的卒中模型造模成功。
行为学评估结果：（１）粘贴撕除测试。
假手术组ｄｂ／ｄｂ、ｄｂ／＋和ＷＴ小鼠间的接触粘纸时间（品系效应：Ｆ＝２ ５６，Ｐ＝０ ０８）和移除粘纸时间（品系效应：Ｆ＝０ １８，Ｐ＝０ ８４）差异均无统计学意义。
小鼠脑发育指标摘要：一、引言二、小鼠脑发育的指标1.生理指标2.行为指标3.神经影像学指标三、小鼠脑发育的研究方法1.生理实验2.行为学实验3.神经影像学技术四、小鼠脑发育的应用1.疾病模型2.药物筛选3.神经康复研究五、结论正文：一、引言小鼠作为模式生物，其在脑发育研究领域具有重要地位。
脑发育是一个复杂的过程，涉及神经细胞的增殖、迁移、分化、突触形成和修剪等多个环节。
为了研究这些过程，科学家们建立了多种小鼠脑发育的指标，从而为研究脑发育提供了有力的工具。
二、小鼠脑发育的指标1.生理指标在小鼠脑发育过程中，生理指标如脑重、脑体积、神经元数量等可以反映脑发育的进程。
通过对这些指标的测量，可以了解小鼠脑在不同发育阶段的特点。
2.行为指标行为指标是评估小鼠脑发育的另一重要途径。
通过对小鼠的行为表现进行观察，如学习能力、记忆能力、空间导航能力等，可以反映脑功能的发展。
3.神经影像学指标神经影像学技术为研究小鼠脑发育提供了直观的观察手段。
通过对脑部结构的成像，可以揭示神经细胞的分布、连接和功能。
常用的神经影像学技术包括荧光显微镜、光遗传学、脑电图等。
三、小鼠脑发育的研究方法1.生理实验生理实验是研究小鼠脑发育的基本手段。
通过手术、电生理、生物化学等方法，可以直接观察和检测神经细胞的变化。
2.行为学实验行为学实验有助于评估小鼠的脑功能。
常用的行为学实验包括水迷宫、杨氏矩阵、Morris水迷宫等。
3.神经影像学技术神经影像学技术可以直接反映小鼠脑部的结构和功能。
通过对脑部成像数据的分析，可以了解神经细胞的组织结构和功能连接。
四、小鼠脑发育的应用1.疾病模型小鼠脑发育的研究有助于建立疾病模型，如自闭症、智力障碍等。
这些模型为研究疾病发病机制和寻找治疗方法提供了重要工具。
2.药物筛选通过对小鼠脑发育的研究，可以筛选出具有神经发育作用的药物。
这些药物有望用于治疗神经发育障碍或促进脑损伤后的修复。
3.神经康复研究小鼠脑发育的研究可以为神经康复提供理论依据。
·408·创伤性脑损伤 （traumatic brain injury，TBI ） 是世界范围内最主要的致死和致残原因［1］。
在中国，每10万人中有13人因脑损伤而死亡［2］。
TBI显著增加其他神经系统疾病风险，包括慢性创伤性脑病、阿尔茨海默病和抑郁等［3］，从而带来巨大社会压力和经济损失［2］。
脑血管损伤是TBI重要的病理生理过程，脑血管结构破坏、功能障碍参与了TBI的发病、发展及损伤修复过程，并与继发性损伤密切相关。
血管功能障碍常表现为脑出血、脑梗死、脑水肿等［4］。
脑血流是评估血管功能的重要指标之一，大多数TBI 患者在受伤后可以观察到局部或整体的脑血流减· 论著 ·小鼠脑外伤后脑血流的动态变化及其与行为学恢复的相关性李坤航1，张旭东1，赵丹2，梁宇2，钟诗雨1，赵伟东2，包义君1 （中国医科大学 1. 附属第四医院神经外科，沈阳 110032； 2. 生命科学学院发育细胞生物学教研室，沈阳 110122） 摘要 目的 明确小鼠创伤性脑损伤 （TBI ） 后脑血流的动态变化，及其与运动功能受损和修复的相关性。
方法 构建小鼠中度TBI 模型。
通过激光散斑成像技术监测活体脑血流；通过转棒、悬绳和壁架实验分析小鼠运动协调能力，并评估脑血流与运动功能损伤和恢复的相关性。
结果 脑血流在TBI 急性期显著减少，TBI 后6 h、1 d 和3 d 分别减少了69.8%、62.9%和67.8%，TBI 后3 d 开始恢复，至TBI 后14 d 恢复到正常水平。
TBI 导致小鼠运动协调功能障碍，TBI 后3 d 运动功能损伤最严重，TBI 后28 d 基本恢复到正常水平；TBI 后脑血流恢复和运动功能恢复呈显著正相关。
结论 TBI 导致小鼠脑损伤部位脑血流下降和运动功能障碍，此后脑血流和运动功能逐渐恢复，二者的恢复有相关性，且脑血流的恢复早于运动功能的恢复。
提示TBI 后通过改善脑血流能够促进运动功能的恢复。
苯妥英钠对脑缺血再灌注小鼠学习记忆功能的保护作用顾饶胜;何玲;都培双;沈楠;吴晓东;王艳春;刘微【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2003(007)013【摘要】目的探讨苯妥英钠对脑缺血再灌注小鼠学习记功能保护作用的作用机制,为苯妥英钠用于脑缺血缺氧的治疗提供理论依据.方法采用清醒小鼠脑缺血再灌注手术方法,应用跳台法和避暗法,脑海马 CA1区神经细胞计数等方法研究苯妥英钠对小鼠脑缺血再灌注行为学、脑病理形态学的影响.结果脑缺血再灌注组(模型组)小鼠错误次数明显增多: 3.2± 1.1(跳台)、8.4± 3.2(避暗);逃避潜伏期( EL)延长: (37.5± 15.0) s,出现明显的学习记忆功能障碍并使脑海马 CA1区神经细胞数明显减少70± 6神经细胞数(个 /2 mm2);苯妥英钠可较好地改善脑缺血再灌注致学习记忆障碍小鼠的学习记忆功能,错误次数减少: 1.0± 0.5(跳台), 2.5± 1.7(避暗); EL缩短: (6.7± 1.9) s且使脑海马 CA1区神经细胞数明显增加: 76± 6神经细胞数(个 /2 mm2).结论苯妥英钠对脑缺血再灌注小鼠的学习记忆障碍有明显的改善作用,其作用机制可能与保护小鼠脑海马 CA1区神经细胞有关.【总页数】2页(P1890-1891)【作者】顾饶胜;何玲;都培双;沈楠;吴晓东;王艳春;刘微【作者单位】解放军第四军医大学吉林军医学院药理教研室,吉林省吉林市,132013;解放军第四军医大学吉林军医学院药理教研室,吉林省吉林市,132013;解放军第四军医大学吉林军医学院药理教研室,吉林省吉林市,132013;解放军第四军医大学吉林军医学院药理教研室,吉林省吉林市,132013;解放军第四军医大学吉林军医学院药理教研室,吉林省吉林市,132013;解放军第四军医大学吉林军医学院药理教研室,吉林省吉林市,132013;解放军第四军医大学吉林军医学院药理教研室,吉林省吉林市,132013【正文语种】中文【中图分类】R743.3【相关文献】1.大黄酚对脑缺血再灌注小鼠记忆功能的保护作用 [J], 王树;张丹参;张力;安芳;薛贵平;武海霞2.大黄素对脑缺血再灌注小鼠记忆功能的保护作用 [J], 王树;张力;薛贵平3.大黄素对脑缺血再灌注小鼠记忆功能的保护作用 [J], 王树;张力;薛贵平;4.醒脑静注射液对小鼠脑缺血再灌注致学习记忆功能障碍的保护作用 [J], 周红宇;胡国新;等5.二巯丙磺钠对小鼠脑缺血再灌注致学习记忆功能障碍的保护作用 [J], 胡国新;周红宇;等因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
替罗非班对急性缺血性卒中小鼠的神经保护作用满旭;韩滨;汪青青;孙锦平【期刊名称】《青岛大学学报（医学版）》【年(卷),期】2024(60)1【摘要】目的探讨替罗非班对急性缺血性卒中(AIS)小鼠脑梗死体积及神经元凋亡的影响。
方法将65只雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组、模型组及替罗非班低、中、高剂量组,每组13只。
采用光化学脑卒中法建立小鼠脑缺血模型。
模型组尾静脉注射相同体积的生理盐水,替罗非班各剂量组尾静脉注射不同剂量的替罗非班。
采用神经行为学评分(mNSS评分)评估小鼠神经功能缺损,2,3,5氯化三苯基四氮唑(TTC)测定小鼠脑梗死体积,TUNEL染色与NeuN染色检测小鼠神经元凋亡情况。
结果5组的mNSS评分、脑梗死体积、TUNEL阳性细胞数量和NeuN阳性细胞数量差异有统计学意义(F=9.630~124.927,P<0.05)。
与模型组相比,替罗非班中剂量组神经行为损伤明显改善、脑梗死体积下降、TUNEL阳性细胞数量减少、NeuN阳性细胞数量增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。
结论中剂量替罗非班可降低AIS小鼠神经功能缺损评分、减小脑梗死体积及减轻神经元凋亡,从而发挥神经保护作用。
【总页数】6页(P17-22)【作者】满旭;韩滨;汪青青;孙锦平【作者单位】青岛大学;附属医院神经内科;附属医院急诊内科【正文语种】中文【中图分类】R972.7;R743.3【相关文献】1.替罗非班联合溶栓对急性缺血性脑卒中患者神经功能的影响2.替罗非班联合血管内取栓对急性缺血性脑卒中患者神经功能的影响3.替罗非班对急性缺血性卒中大鼠PI3K/Akt/e NOS通路及神经损伤的影响4.替罗非班联合尿激酶对急性缺血性脑卒中介入治疗患者神经功能及预后的影响5.替罗非班桥接双抗方案对超溶栓窗急性缺血性脑卒中患者神经功能及预后的疗效观察因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
阿尔兹海默症小鼠评价指标和实验方法阿尔兹海默症（Alzheimer's Disease，AD）小鼠的常用评价指标和实验方法主要包括以下几种：1. 条件性恐惧实验：这是一种基于巴普洛夫的条件反射原理设计的实验，可用于评估小鼠对特定环境刺激的记忆能力。
实验中，小鼠被置于特定环境中，并给予一个声音信号作为条件刺激，紧接着给予电击作为非条件刺激。
小鼠在恐惧时会出现静止状态，即除了呼吸之外无其他任何活动的防御姿势。
随后在相同或不同的环境中测试小鼠静止状态的持续时间，以评估其条件恐惧程度和记忆能力。
该实验对于评估AD动物模型的焦虑状态和环境条件刺激记忆功能具有良好效果。
2. 放射状迷宫（八臂迷宫）实验：这是一种用于评估小鼠空间学习和记忆能力的实验方法。
在一个八臂迷宫中，小鼠需要通过探索各个臂来找到食物。
通过比较造模前后小鼠在迷宫中的表现，可以评估其空间学习和记忆能力。
该实验可以用于检测AD模型小鼠的空间认知障碍。
3. Morris水迷宫实验：这是一种评估小鼠学习和记忆能力的行为学实验。
在一个圆形水池中，小鼠需要寻找一个隐藏的平台以逃离水面。
通过记录小鼠寻找平台的时间和路径，可以评估其空间学习和记忆能力。
该实验可以用于检测AD模型小鼠的空间认知障碍。
4. 一般行为学观察：包括观察小鼠的精神状态、毛发、饮食以及开场行为（在新环境中的探究活动）等变化。
这些观察可以提供有关小鼠整体健康状况和行为表现的信息，有助于发现与AD相关的非认知行为变化。
5. 生物标志物检测：通过检测小鼠脑组织中淀粉样蛋白（Aβ）和tau蛋白等生物标志物的含量和分布，可以评估AD的病理进展。
这些标志物在AD 患者脑中沉积形成老年斑和神经纤维缠结，导致神经元死亡和认知障碍。
检测这些标志物可以帮助了解AD模型小鼠的病理状态，并可作为药物筛选的指标之一。
6. 神经电生理检测：通过记录小鼠脑电波活动和神经元放电情况，可以评估其神经功能和信息处理能力。
产气柯林斯菌联合丁酸梭菌干预局灶性缺血性脑卒中小鼠的实验研究徐晓松,蔡祥胜,周辉,李瑞莹,陈小明,官煜彬摘要目的:探讨产气柯林斯菌及丁酸梭菌联合干预局灶性缺血性脑卒中小鼠模型的疗效㊂方法:48只无特定病原体(SPF)级8~ 10周龄C57BL/6J雄性小鼠,通过颈外动脉插线法建立局灶性缺血性脑卒中小鼠模型,随机分为对照组(12只)㊁生理盐水组(9只)㊁产气柯林斯菌悬液组(9只)㊁丁酸梭菌悬液组(9只)㊁混合菌悬液组(9只),生理盐水组㊁产气柯林斯菌悬液组㊁丁酸梭菌悬液组㊁混合菌悬液组每日分别给予生理盐水㊁产气柯林斯菌悬液㊁丁酸梭菌悬液㊁混合菌悬液灌胃1次,灌胃容积为0.1~0.2mL/10g,最大容积不超过0.8mL㊂分别于建模成功后2h㊁1周㊁2周观察各组美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分及测定小鼠的脑卒中病灶体积,同时检测血清白细胞介素(IL)-1β及IL-6的含量并分析其与脑卒中病灶体积的相关性㊂结果:与对照组及生理盐水组比较,建模成功后2周,产气柯林斯菌悬液组㊁丁酸梭菌悬液组㊁混合菌悬液组NIHSS评分及IL-1β㊁IL-6水平均降低(P<0.05);与对照组及生理盐水组比较,在建模成功后1周,混合菌悬液组小鼠脑卒中病灶体积就已开始减小(P<0.05),建模成功后2周,产气柯林斯菌悬液组㊁丁酸梭菌悬液组㊁混合菌悬液组小鼠脑卒中病灶体积均减小(P<0.05)㊂IL-1β㊁IL-6浓度与小鼠脑卒中病灶体积呈正相关(r值分别为0.547,0.795,P<0.001)㊂结论:产气柯林斯菌及丁酸梭菌联合干预后可保护局灶性缺血性脑卒中小鼠的神经功能㊁缓解小鼠脑部炎症㊁减小小鼠脑卒中病灶体积㊂关键词局灶性缺血性脑卒中;产气柯林斯菌;丁酸梭菌;实验研究d o i:10.12102/j.i s s n.1672-1349.2023.11.012缺血性脑卒中是由于脑部血管发生暂时或永久性阻塞从而引发的组织损伤,具有致残率高及致死率高的特点,缺血性脑卒中的发生与高血压㊁糖尿病㊁心脏病㊁肥胖㊁血脂异常㊁代谢异常等因素有关[1-4]㊂脑梗死体积大小和神经系统功能受损程度与疾病发生后侧支血流循环的建立㊁血压灌注及药物的使用密切相关㊂目前,缺血性脑卒中的治疗手段主要以组织型纤溶酶原激活物溶栓为主,其中药物治疗以改善脑部血循环的抗血栓药物及脑神经保护药物为主[5-6]㊂但是,使用抗凝药时,要充分考虑药物之间的相互作用及其疗效等,而脑神经保护药物的疗效及安全性也有待进一步的观察与研究[6]㊂脑卒中后可引起肠道菌群失调,而肠道菌群的失调又可影响脑卒中的预后,研究表明,脑卒中发生前后相关生化指标浓度会发生变化[7-8]㊂改变肠道菌群结构特征可改善病人生理功能,延缓疾病进展[9]㊂因此,本研究拟通过建立局灶性缺血性脑卒中小鼠模型,观察经产气柯林斯菌及丁酸梭菌联合干预后,小鼠神经行为学㊁脑卒中后脑组织梗死体积及相关炎性指标的变化,探讨该特定菌群对缺血性脑卒中基金项目广东省医学科学技术研究基金项目(No.B2021146)作者单位广东药科大学附属第一医院(广州510080),E-mail:103300755@ 引用信息徐晓松,蔡祥胜,周辉,等.产气柯林斯菌联合丁酸梭菌干预局灶性缺血性脑卒中小鼠的实验研究[J].中西医结合心脑血管病杂志, 2023,21(11):1997-2002.的疗效㊂1材料与方法1.1实验材料1.1.1实验动物及分组无特定病原体(SPF)级8~ 10周龄C57BL/6J雄性小鼠48只,购自珠海百试通生物科技有限公司[生产许可证号:SCXK(粤)2020-0051]㊂所有小鼠均在SPF级动物房中分笼适应性饲养1周,室温(24ʃ2)ħ,每12h昼夜交替,自由饮水进食㊂随机分为对照组(12只)㊁生理盐水组(9只)㊁产气柯林斯菌悬液组(9只)㊁丁酸梭菌悬液组(9只)㊁混合菌悬液组(9只),生理盐水组㊁产气柯林斯菌悬液组㊁丁酸梭菌悬液组㊁混合菌悬液组每日分别给予生理盐水㊁产气柯林斯菌悬液㊁丁酸梭菌悬液㊁混合菌悬液灌胃1次,灌胃容积为10g(0.1~0.2mL),最大容积不超过0.8mL㊂1.1.2实验仪器及试剂生物安全柜(苏州安泰空气技术有限公司,BSC-1304ⅡB2)㊁低温冰箱(青岛海尔特种电器有限公司,海尔DW-25L262)㊁灌胃器(自制)㊁小鼠实验模型造模呼吸机(卡尔文公司,KW-10)㊁麻醉机(Matrx,7025)等㊂小鼠白细胞介素(IL)-1β㊁IL-6检测试剂盒(合肥莱尔生物科技有限公司),无菌生理盐水(购自石家庄四药有限公司),2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染液(Sigma公司)等㊂1.1.3实验菌种获取及配制将缺血性脑卒中病人粪便进行厌氧培养,筛选后进行多次增菌培养,获得产气柯林斯菌和丁酸梭菌并留取菌种备用,分别将产气柯林斯菌菌悬液和丁酸梭菌菌悬液按1ʒ1混合配制成含菌个数约为1ˑ1010菌落形成单位(cfu )/mL 的混合菌悬液㊂1.2 实验动物模型制备 采用吸入异氟烷诱导麻醉的方法对小鼠进行麻醉处理㊂采用颈外动脉插线法建立局灶性缺血性脑卒中小鼠模型[10],小鼠缺血2h 后抽出线栓形成脑部血管再灌注,期间保持小鼠肛温为(37.0ʃ0.5)ħ㊂1.3 实验方法1.3.1 IL -1β㊁IL -6检测 采用尾尖取血法采集各组小鼠建模成功后2h ㊁1周㊁2周0.3mL 血后离心,检测IL -1β㊁IL -6浓度㊂1.3.2 神经行为学评分及模型成功判定标准 对建模成功后2h ㊁1周㊁2周,根据Longa 神经行为学评分标准对相应模型进行美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS )评分㊂Longa 神经行为学评分标准如下:无神经功能损伤,小鼠表现正常计0分;提尾时,小鼠右前肢屈曲,伸直不完全计1分;小鼠向对侧转圈计2分;小鼠向右侧倾倒计3分;小鼠不能自发行走,意识丧失计4分㊂1~3分表明造模成功㊂1.3.3 脑卒中病灶体积测定 在上述相应实验时间段处死实验小鼠(对照组每次处死4只,其他各组每次处死3只)并取新鲜脑组织,低温冰冻后行冠状面连续切片并进行TTC 染色,采用Image J 软件测定脑卒中病灶体积㊂1.4 统计学处理 采用SPSS 26.0软件进行数据分析㊂符合正态分布的定量资料以均数ʃ标准差(x ʃs )表示,采用单因素方差分析㊂采用Pearson 相关分析性法进行相关性分析㊂以P <0.05为差异有统计学意义㊂2 结 果2.1 各组小鼠NIHSS 评分比较 与对照组及生理盐水组比较,产气柯林斯菌悬液组㊁丁酸梭菌悬液组㊁混合菌悬液组建模成功后2周NIHSS 评分降低,差异均有统计学意义(P <0.05)㊂详见表1㊂表1 各组小鼠NIHSS 评分比较(x ʃs )单位:分 组别只数2h 1周2周对照组12 3.00ʃ0.71 2.50ʃ0.50 2.25ʃ0.43生理盐水组9 3.00ʃ0.82 2.67ʃ0.47 2.00ʃ0.00产气柯林斯菌悬液组9 2.67ʃ0.47 2.33ʃ0.47 1.00ʃ0.00①②丁酸梭菌悬液组9 3.00ʃ0.00 2.00ʃ0.82 1.00ʃ0.00①②混合菌悬液组93.00ʃ0.822.00ʃ0.000.67ʃ0.47①②与对照组同时间点比较,①P <0.05;与生理盐水组同时间点比较,②P <0.05㊂2.2 各组小鼠IL -1β㊁IL -6比较 与对照组及生理盐水组比较,产气柯林斯菌悬液组㊁丁酸梭菌悬液组㊁混合菌悬液组建模成功后2周L -1β㊁IL -6降低,差异均有统计学意义(P <0.05)㊂详见表2㊂表2 各组小鼠IL -1β㊁IL -6水平比较(x ʃs )单位:pg/mL组别只数 IL -1β 2h1周2周IL -6 2h1周2周对照组1237.90ʃ1.1938.09ʃ1.7632.30ʃ2.3926.39ʃ1.7833.49ʃ1.7225.42ʃ1.92生理盐水组937.85ʃ1.8538.11ʃ2.0731.70ʃ2.0626.73ʃ0.8231.12ʃ3.0024.61ʃ1.12产气柯林斯菌悬液组937.94ʃ2.2438.62ʃ1.5727.43ʃ1.04①②27.79ʃ2.2829.83ʃ3.9121.50ʃ1.86①②丁酸梭菌悬液组937.68ʃ1.0739.48ʃ1.4126.66ʃ1.03①②28.77ʃ2.6830.67ʃ1.8221.35ʃ1.71①②混合菌悬液组935.80ʃ2.3336.23ʃ2.2325.20ʃ1.68①②25.97ʃ1.5129.61ʃ2.1520.89ʃ1.82①②与对照组同时间点比较,①P <0.05;与生理盐水组同时间点比较,②P <0.05㊂2.3 各组小鼠脑卒中病灶体积比较 与对照组及生理盐水组比较,在建模成功后1周,混合菌悬液组小鼠脑卒中病灶体积已开始减少(P <0.05);建模成功后2周,产气柯林斯菌悬液组㊁丁酸梭菌悬液组㊁混合菌悬液组小鼠相对脑卒中病灶体积减小,差异均有统计学意义(P <0.05)㊂详见图1~图3及表3㊂图1各组小鼠建模成功后2h脑组织TTC染色图(白色为脑缺血组织,红色为正常脑组织)图2各组小鼠建模成功后1周脑组织TTC染色图(白色为脑缺血组织,红色为正常脑组织)图3各组小鼠建模成功后2周脑组织TTC染色图(白色为脑缺血组织,红色为正常脑组织)表3各组小鼠脑卒中病灶体积比较(xʃs)单位:%组别只数2h1周2周对照组442.08ʃ2.0459.45ʃ3.3446.12ʃ2.34生理盐水组341.30ʃ2.8654.50ʃ4.2042.57ʃ3.33产气柯林斯菌悬液组344.36ʃ4.6054.53ʃ2.2435.13ʃ2.84①②丁酸梭菌悬液组344.20ʃ3.3054.43ʃ1.5534.83ʃ3.48①②混合菌悬液组341.87ʃ2.5652.63ʃ3.23①27.13ʃ2.85①②③④与对照组同时间点比较,①P<0.05;与生理盐水组同时间点比较,②P<0.05;与产气柯林斯菌悬液组同时间点比较,③P< 0.05;与丁酸梭菌悬液组同时间点比较,④P<0.05㊂2.4各组小鼠不同时间点脑组织相对缺血体积与非缺血体积百分比比较与建模成功后2h比较,建模成功后1周,各组小鼠脑组织相对缺血体积均发生了增大的趋势,且差异有统计学意义(P<0.05);建模成功后2周,产气柯林斯菌悬液组㊁丁酸梭菌悬液组㊁混合菌悬液组小鼠脑组织相对缺血体积降低,差异均有统计学意义(P<0.05)㊂详见图4㊂图4各组小鼠脑组织相对缺血体积与非缺血体积百分比直方图2.5IL-1β㊁IL-6与小鼠脑卒中病灶体积的相关性IL-1β㊁IL-6与小鼠脑卒中病灶体积呈正相关㊂详见图5㊁图6㊂图5IL-1β与小鼠脑卒中病灶体积相关性的散点图图6IL-6与小鼠脑卒中病灶体积相关性的散点图3讨论研究显示,益生菌活菌制剂联合肠内营养可提升重症脑卒中病人的治疗效果㊁调节菌群平衡㊁降低不良反应发生率,具有较高的临床应用价值[11]㊂Liu等[12]采用灌胃的方法将多形拟杆菌移植到小鼠肠道内,发现小鼠的体重发生了变化,同时代谢途径及机体炎症状态得到显著改善㊂肠道微生物群中的丁酸梭菌可减少中枢神经功能损伤[13]㊂柯林斯菌为代谢产物,与中枢神经及免疫系统显著相关,可增强机体的抗氧化能力[14]㊂本研究结果显示,与对照组及生理盐水组比较,建模成功后2周,产气柯林斯菌悬液组㊁丁酸梭菌悬液组㊁混合菌悬液组NIHSS评分降低,差异均有统计学意义(P<0.05),表明产气柯林斯菌及丁酸梭菌单独或联合干预一定时间后均可对局灶性缺血性脑卒中小鼠的神经功能起保护作用㊂局灶性缺血性脑卒中是由于小鼠脑组织缺血㊁缺氧及缺血再灌注损伤导致相关区域神经组织细胞的部分死亡,从而表现出脑神经损伤及神经功能缺失等症状[15]㊂研究显示,丁酸梭菌可通过激活与细胞生长㊁凋亡密切相关的蛋白激酶B(AKT)通路,降低促凋亡相关蛋白含量及提高抗凋亡相关蛋白浓度,具有保护脑部神经组织细胞㊁减轻脑组织损伤的作用[16]㊂在一项动物研究中,经过相关药物有效治疗后的大鼠肠道中的短链脂肪酸(SCFA)产生菌-产气柯林斯菌的比例明显升高,且炎症显著改善[17]㊂SCFA是肠道细菌发酵纤维素产生的溶于水的游离脂肪酸,主要包括乙酸㊁丙酸㊁丁酸㊁异丁酸[18]㊂研究表明,SCFA产生菌可减轻缺血性脑卒中小鼠脑卒中后的神经功能障碍和炎症,同时也可提高肠道㊁大脑和血浆中的SCFA浓度[19]㊂本研究结果显示,与对照组比较,混合菌悬液组小鼠无论是在建模成功后1周或2周的时间点上,脑卒中病灶体积增大趋势均明显减缓(P<0.05),而产气柯林斯菌组及丁酸梭菌组建模成功后1周脑卒中病灶体积增大趋势暂未发现有明显减缓趋势(P>0.05)㊂进一步分析各组小鼠的脑卒中病灶体积百分比,相较于建模成功后2h,在建模成功后1周,各组小鼠脑卒中病灶体积均增大(P<0.05),但在建模成功后2周,与相应的建模成功后1周比较,各组小鼠脑卒中病灶体积缩小(P<0.05)㊂动物研究表明,缺血脑卒中大鼠缺血再灌注后第7天梗死灶体积最严重,第14天梗死灶有自发缩小趋势[20],这与本研究结果基本一致㊂然而,本研究发现,与对照组比较,产气柯林斯菌悬液组㊁丁酸梭菌悬液组㊁混合菌悬液组建模成功后2周小鼠脑卒中病灶体积明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05),但对照组和生理盐水组比较差异无统计学意义(P>0.05)㊂本研究表明,产气柯林斯菌及丁酸梭菌联合干预对局灶性缺血性脑卒中小鼠的脑部神经组织损伤具有一定的保护作用㊂宿主的免疫炎性因子与肠道菌群结构特征相关, IL-1β㊁IL-6等相关因子具有神经保护作用,且与缺血性脑卒中的脑损伤程度相关[21-22]㊂丁酸梭菌可通过其代谢产物SCFA改善宿主的肠道通透性,减少炎性因子IL-1β及IL-6的分泌从而发挥抗炎㊁抗氧化的作用[23]㊂另有研究指出,柯林斯菌属可通过其代谢产物促进宿主体内的酶合成脱氧熊胆酸,从而提高宿主物质及能量代谢,发挥抗炎㊁抗氧化的作用[24]㊂减少缺血性脑卒中病人炎性因子IL-1β㊁IL-6的分泌,可改善病人的预后[25]㊂本研究结果显示,混合菌悬液组在混合菌悬液干预2周后,与对照组㊁生理盐水组比较,差异均有统计学意义(P<0.05),且IL-1β㊁IL-6水平与小鼠脑卒中病灶体积呈正相关㊂综上所述,本研究结果表明,产气柯林斯菌及丁酸梭菌联合干预2周后,对保护局灶性缺血性脑卒中小鼠的神经功能㊁缓解小鼠脑部炎症㊁减小小鼠脑卒中病灶体积均具有一定的作用㊂参考文献:[1]顾淑玮,李芬,万晓文.脑卒中发生与预后危险因素研究综述[J].中国初级卫生保健,2020,34(10):66-68.[2]LACKLAND D T,WEBER M A.Global burden of cardiovasculardisease and stroke:hypertension at the core[J].Can J 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第60卷 第1期2024年02月青岛大学学报(医学版)J O U R N A LO FQ I N G D A O U N I V E R S I T Y (M E D I C A LS C I E N C E S)V o l .60,N o .1F e b r u a r y2024[收稿日期]2023-06-01; [修订日期]2023-08-21[基金项目]国家重点研发计划项目(2018Y F C 1315200);山东省自然科学基金项目(Z R 2020Q H 099)[第一作者]满旭(1995-),女,硕士研究生㊂[通信作者]孙锦平(1969-),女,博士,主任医师,博士生导师㊂E -m a i l :s u n j i n p i n g@q d u .e d u .c n ㊂替罗非班对急性缺血性卒中小鼠的神经保护作用满旭1,韩滨2,汪青青3,孙锦平3(青岛大学,山东青岛 266021 1 医学部中西医结合中心; 2 附属医院神经内科; 3 附属医院急诊内科)[摘要] 目的 探讨替罗非班对急性缺血性卒中(A I S )小鼠脑梗死体积及神经元凋亡的影响㊂方法 将65只雄性C 57B L /6小鼠随机分为假手术组㊁模型组及替罗非班低㊁中㊁高剂量组,每组13只㊂采用光化学脑卒中法建立小鼠脑缺血模型㊂模型组尾静脉注射相同体积的生理盐水,替罗非班各剂量组尾静脉注射不同剂量的替罗非班㊂采用神经行为学评分(m N S S 评分)评估小鼠神经功能缺损,2,3,5氯化三苯基四氮唑(T T C )测定小鼠脑梗死体积,T U N E L 染色与N e u N 染色检测小鼠神经元凋亡情况㊂结果 5组的m N S S 评分㊁脑梗死体积㊁T U N E L 阳性细胞数量和N e u N 阳性细胞数量差异有统计学意义(F =9.630~124.927,P <0.05)㊂与模型组相比,替罗非班中剂量组神经行为损伤明显改善㊁脑梗死体积下降㊁T U N E L 阳性细胞数量减少㊁N e u N 阳性细胞数量增加,差异均有统计学意义(P <0.05)㊂结论 中剂量替罗非班可降低A I S 小鼠神经功能缺损评分㊁减小脑梗死体积及减轻神经元凋亡,从而发挥神经保护作用㊂[关键词] 替罗非班;缺血性脑卒中;神经行为学表现;脑梗死;神经细胞凋亡抑制蛋白[中图分类号] R 972.7;R 743.3 [文献标志码] A [文章编号] 2096-5532(2024)01-0017-06d o i :10.11712/jm s .2096-5532.2024.60.021[开放科学(资源服务)标识码(O S I D )][网络出版] h t t ps ://l i n k .c n k i .n e t /u r l i d /37.1517.R.20240319.1459.004;2024-03-21 17:37:49N e u r o p r o t e c t i v e e f f e c t s o f t i r o f i b a n i nm i c ew i t ha c u t e i s c h e m i c s t r o k e MA N X u ,HA N B i n ,WA N G Q i n g q i n g ,S U N J i n p i n g (C e n t e r f o r I n t e g r a t e dT r a d i t i o n a l C h i n e s e a n dW e s t e r nM e d i c i n e ,D e p a r t m e n t o fM e d i c i n e ,Q i n g d a oU n i v e r s i t y ,Q i n gd a o 266021,C h i n a)[A b s t r a c t ] O b je c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h eef f e c t so f t i r o f i b a no nb r a i n i n f a r c tv o l u m ea n dn e u r o n a l a p o p t o s i s i n m i c ew i t h a c u t e i s c h e m i c s t r o k e (A I S ). M e t h o d s S i x t y -f i v e C 57B L /6m i c ew e r e r a n d o m l y d i v i d e d i n t os h a mg r o u p ,m o d e l g r o u p,a n d l o w -d o s e ,m e d i u m -d o s e ,a n dh i g h -d o s e t i r o f i b a n g r o u p s ,w i t h13m i c e i ne a c h g r o u p .A m o u s em o d e l o f c e r e b r a l i s c h e m i aw a s e s -t a b l i s h e d t h r o u g h p h o t o c h e m i c a l t h r o m b o s i s .T h em o d e l g r o u p r e c e i v e d i n j e c t i o no f t h e s a m ev o l u m eo f n o r m a l s a l i n ev i a t h e t a i l v e i n ,w h i l e t h e t i r o f i b a n g r o u p s r e c e i v e d i n j e c t i o no f d i f f e r e n t d o s e so f t i r o f i b a n i n t o t h e t a i l v e i n .T h en e u r o l o g i c a l d e f i c i t so fm i c e w e r e e v a l u a t e du s i n g t h em o d i f i e dn e u r o l o g i c a l s e v e r i t y s c a l e (m N S S ).T h e b r a i n i n f a r c t v o l u m ew a sm e a s u r e d w i t h2,3,5-t r i p h e -n y l t e t r a z o l i u mc h l o r i d e s t a i n i n g .N e u r o n a l a p o p t o s i sw a s d e t e r m i n e dw i t hT U N E Ls t a i n i n g a n dN e u Ns t a i n i n g . R e s u l t s T h e r e w e r e s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s i n t h em N S S s c o r e ,c e r e b r a l i n f a r c t i o nv o l u m e ,t h e n u m b e r o fT U N E L -po s i t i v e c e l l s ,a n d t h e n u m b e r o fN e u N -p o s i t i v e c e l l s b e t w e e n t h e f i v e g r o u p s (F =9.630-124.927,P <0.05).C o m p a r e dw i t h t h em o d e l g r o u p,t h em e d i u m -d o s e t i r o f i b a n g r o u p s h o w e d s i g n i f i c a n t l y r e s o l v e dn e u r o b e h a v i o r a l d a m a g e ,a s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d c e r e b r a l i n f a r c t i o nv o l u m e ,a s i gn i -f i c a n t l y d e c r e a s e d n u m b e r o f T U N E L -p o s i t i v e c e l l s ,a n d a s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d n u m b e r o fN e u N -po s i t i v e c e l l s (P <0.05). C o n -c l u s i o n A m e d i u md o s e o f t i r o f i b a n c a n p l a y a n e u r o p r o t e c t i v e r o l e i nm i c ew i t hA I S ,d e c r e a s i n g n e u r o l o g i c a l d e f i c i t s c o r e ,i n f a r c t v o l u m e ,a n dn e u r o n a l a p o pt o s i s .[K e y wo r d s ] t i r o f i b a n ;i s c h e m i c s t r o k e ;n e u r o b e h a v i o r a lm a n i f e s t a t i o n s ;b r a i n i n f a r c t i o n ;n e u r o n a l a p o p t o s i s -i n h i b i t o r y p r o -t e i n急性缺血性卒中(A I S )病人约占所有卒中的80%[1]㊂A I S 的病理过程涉及炎症㊁细胞凋亡和神经元损伤[2]㊂对于A I S 病人,在发病后4.5h 内,静脉溶栓是标准治疗方法[3],可改善临床预后并降低死亡率[4]㊂目前针对A I S 的治疗方法十分有限,迫切需要开发新疗法㊂A I S 治疗的主要目标是保护正常脑组织,促进梗死区附近缺血半暗带区域的功能恢复[5]㊂有研究表明,抗血小板药物的使用对于A I S 治疗是必要的[6-7]㊂替罗非班是一种半衰期短的速效糖蛋白(G P )Ⅱb /Ⅲa 抑制剂,可通过可逆阻断纤维蛋白结合受体来抑制血小板聚集的最终共同途径[8]㊂替罗非班在未接受早期再通治疗的A I S病人中是安全有效的[9]㊂本研究探讨不同剂量替罗18青岛大学学报(医学版)60卷非班对小鼠脑梗死体积以及缺血半暗带区神经元凋亡的影响,为替罗非班用于A I S病人提供依据㊂现报告如下㊂1材料与方法1.1实验材料雄性C57B L/6小鼠65只,体质量为(26ʃ2)g,由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供㊂2,3, 5氯化三苯基四氮唑(T T C)购自美国S i g m a公司㊂T U N E L细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司㊂N e u N抗体购自英国A b c a m公司㊂驴抗兔I g G二抗购自美国T h e r m oS c i e n t i f i c公司㊂40g/L多聚甲醛购自北京索莱宝科技有限公司㊂盐酸替罗非班氯化钠注射液由鲁南贝特制药有限公司提供㊂制备光化学模型所需光纤冷光源仪器购自德国S c h o t t公司㊂冷冻超薄切片机购自德国L e i c a 公司㊂荧光显微镜购自日本O l y m p u s公司㊂1.2实验方法1.2.1光化学卒中模型制备及实验分组采用光化学方法诱导血栓形成脑缺血模型[10]㊂将所有小鼠随机分为假手术组㊁模型组㊁替罗非班低剂量组(2.5m g/k g)㊁替罗非班中剂量组(7.5m g/k g)和替罗非班高剂量组(12.5m g/k g),每组13只㊂光化学卒中模型建立后,假手术组注射孟加拉玫瑰红后不光照,其余手术步骤同模型组㊂模型组小鼠尾静脉注射相应体积的生理盐水,其余各组小鼠分别尾静脉注射低㊁中㊁高剂量替罗非班㊂24h后,每组随机选取10只小鼠进行神经行为学评分(m N S S评分),之后处死小鼠,测量脑梗死体积㊂随后,每组取剩余的3只小鼠进行冷冻切片标本采集,进行免疫荧光实验㊂1.2.2 m N S S评分 m N S S评分范围为0~18分,内容主要包括运动测试㊁感觉测试㊁平衡木测试和反射测试[10]㊂m N S S评分越高,表示神经系统损伤越严重㊂1.2.3脑梗死体积的测定在光化学所致的脑缺血模型形成后24h后采用T T C染色法对小鼠脑组织进行染色㊂白色区域的体积即为脑梗死体积㊂具体步骤如下:腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠,去除小鼠颅骨后,取出脑组织放置在载玻片上,之后迅速置于-20ħ冰箱中速冻10m i n㊂将冷冻过的脑组织取出,沿冠状面切成约2mm厚的脑片㊂将切片置于20g/LT T C溶液中,37ħ下避光孵育30m i n㊂切片每5m i n翻转一次,最后将染色完成后的脑片放置在40g/L多聚甲醛中固定1h,将固定好的脑片旁边放置直尺,并进行拍照㊂利用I m a g e-P r o-P l u s 软件对梗死区域进行体积的测量,计算脑梗死体积比例㊂脑梗死体积比例=(总梗死体积/各脑切片体积之和)ˑ100%㊂1.2.4 T U N E L法检测小鼠脑缺血半暗带区凋亡细胞数光化学致脑缺血模型建立成功后24h,麻醉小鼠后分离脑组织,脑组织在40g/L多聚甲醛中固定24h,将脑组织转移到含有150g/L蔗糖水的离心管中进行脱水,待脑组织沉入到离心管管底后,将脑组织转移到含有300g/L蔗糖水的离心管中进行进一步脱水,直至脑组织沉入管底,进行下一步包埋㊂脱水后的脑组织嵌入O C T包埋,干冰快速冷冻后,使用温度为-20ħ的冷冻切片机将脑组织沿冠状面切成厚度为8μm的脑片,之后用40g/L多聚甲醛固定脑片30m i n,磷酸缓冲盐溶液(P B S)洗涤2次,每次10m i n㊂加入含体积分数0.005聚乙二醇辛基苯基醚(T r i t o nX-100)的P B S,待破膜完毕后,将脑片用P B S清洗3次㊂使用T U N E L检测试剂盒进行T U N E L测定㊂加入50μLT U N E L反应混合物(5μLT d T酶溶液和45μL标记溶液),并将所得混合物在黑暗潮湿的环境中在37ħ下孵育1h㊂用P B S洗涤3次㊂最后,细胞核使用4,6-二氨基-2-苯基吲哚(D A P I)染色㊂用荧光显微镜观察呈现绿色的凋亡细胞㊂1.2.5免疫荧光染色方法检测小鼠脑缺血半暗带区N e u N的表达将-20ħ冰箱中的脑冷冻切片复温至室温,多聚甲醛固定10m i n,磷酸盐吐温缓冲液洗3次,每次5m i n㊂之后利用体积分数0.003 T r i t o nX-100室温通透10m i n,破膜完毕后,将脑片清洗3次㊂用P B S配制30g/L的牛血清清蛋白进行室温封闭1h㊂封闭完成后,加入N e u N一抗(1ʒ500),并置于4ħ的冰箱中孵育过夜㊂一抗孵育完毕之后,用P B S清洗3次,每次5m i n㊂加入荧光二抗(1ʒ500)后室温避光孵育40m i n㊂二抗孵育完成后,加入D A P I染色,抽选3个荧光显微镜下的视野进行图像分析并计算N e u N阳性细胞数㊂1.3统计学处理应用G r a p hP a dP r i s m9.0软件进行统计学分析㊂计量资料以 xʃs表示,多组数据组间均数的比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用B o n-f e r r o n i检验㊂以P<0.05为差异有统计学意义㊂1期满旭,等.替罗非班对急性缺血性卒中小鼠的神经保护作用192结果2.1各组小鼠m N S S评分比较m N S S评分结果显示,5组小鼠m N S S评分差异有统计学意义(F=97.234,P<0.05)㊂与假手术组相比,模型组小鼠出现神经功能损伤(P<0.05);与模型组相比,替罗非班中剂量组小鼠神经行为功能损伤减轻(P<0.05)㊂见表1㊂2.2各组小鼠脑梗死体积比较T T C染色结果显示,5组小鼠脑梗死体积差异有统计学意义(F=43.080,P<0.01),与模型组相比,替罗非班中剂量组小鼠脑梗死体积减小(P< 0.05)㊂见图1和表1㊂2.3各组小鼠缺血半暗带区T U N E L阳性细胞数比较凋亡染色结果显示,5组小鼠缺血半暗带区的T U N E L阳性细胞数差异具有统计学意义(F= 124.927,P<0.05)㊂与假手术组相比较,模型组小鼠缺血半暗带区的T U N E L阳性细胞数上升(P< 0.05);与模型组相比,替罗非班中剂量组的T U N E L 阳性细胞数减少(P<0.05)㊂见图2和表1㊂2.4各组小鼠缺血半暗带区N e u N阳性细胞数的比较免疫荧光结果显示,5组小鼠缺血半暗带区N e u N阳性细胞数差异有统计学意义(F=9.630, P<0.05)㊂与假手术组相比,模型组㊁低剂量替罗非班组小鼠缺血半暗带区N e u N阳性细胞数显著下降(P<0.05);与模型组相比,替罗非班中剂量组的N e u N阳性细胞数显著上升(P<0.05)㊂见图3和表1㊂表1各组小鼠m N S S评分㊁脑梗死体积比例㊁T U N E L 阳性细胞数和N e u N阳性细胞数的比较( xʃs)组别m N S S评分(分)脑梗死体积比例(χ/%)T U N E L阳性细胞数N e u N阳性细胞数假手术组00098.0ʃ4.0模型组10.00ʃ1.53*21.33ʃ1.51*141.0ʃ11.5*70.0ʃ6.2*低剂量组 9.23ʃ1.17*20.55ʃ2.01*132.3ʃ7.5*76.3ʃ7.4*中剂量组7.92ʃ1.75*# 13.04ʃ1.92*# 110.3ʃ11.5*#90.0ʃ7.0#高剂量组 8.92ʃ1.66*19.98ʃ1.90*125.3ʃ7.6*84.0ʃ5.6注:与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05㊂m N S S评分各组例数为13,脑梗死体积比例各组例数为10,T U N E L 阳性细胞数和N e u N阳性细胞数各组例数均为3㊂3讨论本研究结果显示,替罗非班可减少脑梗死体积和神经元凋亡,改善A I S小鼠神经功能缺损㊂表明替罗非班可以保护A I S后带来的神经损伤,为替罗非班在A I S中的作用提供了新的见解㊂替罗非班是一种高度特异性的非肽类血小板图1替罗非班对A I S小鼠脑梗死体积的作用20青岛大学学报(医学版)60卷放大400倍,标尺=100μm㊂图2各组小鼠缺血半暗带区T U N E L染色G PⅡb/Ⅲa受体拮抗剂,可有效阻断血小板活化和聚集的共同途径[11]㊂在脑卒中相关治疗中,给予G PⅡb/Ⅲa抑制剂可能是安全的,但是应该注意药物种类和剂量[12-13]㊂阿昔单抗可以增加症状性颅内出血的风险,替罗非班在低剂量下可以被认为是安全的[14]㊂与常见的双重抗血小板治疗相比较,替罗非班单药治疗A I S是安全的[15],替罗非班治疗作为未接受再通治疗的A I S病人的补救治疗,是安全有效的[16-17]㊂替罗非班可能是A I S治疗潜在的安全选择[18]㊂有研究表明,替罗非班在大脑中动脉阻塞24h 后可以减小小鼠脑梗死体积,但对小鼠神经功能障碍无明显影响[19]㊂而本研究结果显示,7.5m g/k g 的替罗非班不仅可减小小鼠脑梗死体积,也降低了小鼠神经功能障碍㊂脑卒中发生后,主要引起神经细胞凋亡及机体炎症反应㊂N e u N被认为是一种成熟神经元标志物,是脑卒中研究中极其重要的一个指标[20]㊂本研究结果显示,替罗非班中剂量组小鼠N e u N阳性细胞数明显上升㊂表明替罗非班通过降低梗死体积㊁减轻神经功能损伤以及减少缺血半暗带区N e u N阳性神经元的丢失,在A I S中发挥神经保护作用[21]㊂本研究还发现,较高剂量(12.5m g/k g)替罗非班可能导致更大的脑梗死体积㊂有学者提出了双相剂量反应和激效的概念,即在低剂量刺激下具有有益作用,高剂量会导致抑制甚至毒性效应[22-23]㊂推测高剂量下脑梗死体积的增加可能与双相剂量反应和激效有关㊂综上所述,本研究在动物水平观察了不同剂量替罗非班对A I S小鼠的神经保护作用㊂替罗非班1期满旭,等.替罗非班对急性缺血性卒中小鼠的神经保护作用21放大400倍,标尺=100μm ㊂图3 各组小鼠缺血半暗带区N e u N 染色可通过减少脑梗死体积以及减轻缺血半暗带区神经元凋亡来发挥神经保护作用㊂本研究未能进一步检测凋亡相关蛋白的变化趋势,也未涉及替罗非班发挥神经保护作用的具体的分子机制及相关通路㊂这些内容我们将在后续研究中进行进一步的探讨㊂[参考文献][1]WA N G W Z ,J I A N G B ,S U N H X ,e t a l .P r e v a l e n c e ,i n c i -d e n c e ,a n dm o r t a l i t y o f s t r o k e i nC h i n a :r e s u l t s f r o ma n a t i o n -w i d e p o p u l a t i o n -b a s e ds u r v e y of480687a d u l t s [J ].C i r c u l a -t i o n ,2017,135(8):759-771.[2]D U A NJL ,C U I J ,Y A N GZF ,e t a l .N e u r o pr o t e c t i v e e f f e c t o fA p e l i n 13o n i s c h e m i c s t r o k e b y a c t i v a t i n g AM P K /G S K -3β/N r f 2s i g n a l i n g [J ].J o u r n a lo f N e u r o i n f l a mm a t i o n ,2019,16(1):24.[3]P OW E R S W J ,R A B I N S T E I N A A ,A C K E R S O N T ,e ta l .G u i d e l i n e s f o r t h e e a r l y m a n a g e m e n t o f p a t i e n t sw i t ha c u t e i s -c h e m i c s t r o k e :3019u p d a t e t o t h e 2018g u i d e l i n e s f o r t h e e a r l y m a n a ge m e n tof a c u t e i s c h e m i c s t r o k e :ag u i d e l i n e f o rh e a l t h -c a r e p r o f e s si o n a l s f r o m t h e A m e r i c a n H e a r t A s s o c i a t i o n /A m e r i c a nS t r o k eA s s o c i a t i o n [J ].S t r o k e ,2019,50(12):e 344-e 418.[4]WA R D L AWJM ,MU R R A Y V ,B E R G EE ,e t a l .T h r o m b o -l ys i s f o r a c u t e i s c h a e m i c s t r o k e [J ].T h eC o c h r a n eD a t a b a s eo f S ys t e m a t i cR e v i e w s ,2014,2014(7):C D 000213.[5]L E I G H R ,K N U T S S O N L ,Z HO U JY ,e ta l .I m a g i n g th e p h y s i o l o gi c a l e v o l u t i o no f t h e i s c h e m i c p e n u m b r a i na c u t e i s -c h e m i c s t r o k e [J ].J o u r n a l o f C e r e b r a l B l o o dF l o wa n dM e t a b o -l i s m :O f f i c i a l J o u r n a l o f t h e I n t e r n a t i o n a lS o c i e t y o fC e r e b r a l B l o o dF l o wa n d M e t a b o l i s m ,2018,38(9):1500-1516.[6]H O U X W ,C H E N HS .P r o p o s e d a n t i t h r o m b o t i c s t r a t e g yf o r a c u t e i s c h e m i cs t r o k ew i t hl a rg e -a r t e r y a th e r o s c l e r o si s :f o c u s o n p a t i e n t sw i t hh i g h -r i s kt r a n s i e n t i s c h e m i ca t t a c ka n d m i l d -22青岛大学学报(医学版)60卷t o-m o d e r a t es t r o k e[J].A n n a l so f T r a n s l a t i o n a l M e d i c i n e, 2020,8(1):16.[7]P H I P P S M S,C R O N I N C A.M a n a g e m e n to f a c u t e i s c h e m i cs t r o k e[J].B M J,2020,368:16983.[8]K I N GS,S H O R T M,H A R MO NC.G l y c o p r o t e i nⅡb/Ⅲa i n-h i b i t o r s:t h e r e s u r g e n c e o f t i r o f i b a n[J].V a s c u l a r P h a r m a c o l o-g y,2016,78:10-16.[9]H A NB,MA T,L I UZD,e t a l.E f f i c a c y a n d s a f e t y o f t i r o f i-b a n i nc l i n i c a l p a t i e n t sw i t h a c u t e i s c h e m i c s t r o k e[J].F r o n t i e r si nN e u r o l o g y,2021,12:785836.[10]C H E NJ,S A N B E R GPR,L IY,e t a l.I n t r a v e n o u s a d m i n i s-t r a t i o no f h u m a nu m b i l i c a l c o r db l o o dr e d u 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线粒体功能障碍与神经退行性疾病实验报告绪论神经退行性疾病是一类引起神经系统慢性进行性退化的疾病，包括帕金森病、阿尔茨海默病和亨廷顿舞蹈病等多种疾病。
近年来的研究表明，线粒体功能障碍可能是神经退行性疾病发生和发展的重要机制之一。
本实验旨在探究线粒体功能障碍与神经退行性疾病之间的相关关系。
材料与方法实验组选取10只小鼠，对其进行线粒体功能抑制处理；对照组选取10只小鼠，给予正常饮食和生活环境。
实验组小鼠经过线粒体功能抑制处理后，分别进行行为学测试、免疫组化检测和染色体核酸提取实验。
结果1. 行为学测试实验组小鼠在行为学测试中表现出明显的异常。
与对照组相比，实验组小鼠的运动能力明显受损，出现明显的僵硬和无力。
此外，实验组小鼠的学习和记忆能力也较弱，表现出明显的认知和记忆障碍。
2. 免疫组化检测实验组小鼠的脑组织中出现线粒体功能受损的迹象。
免疫组化检测结果显示，实验组小鼠的脑组织中线粒体呼吸链相关蛋白表达水平下降，线粒体DNA损伤程度增加。
这些结果进一步验证了线粒体功能障碍在神经退行性疾病发生中的重要作用。
3. 染色体核酸提取实验实验组小鼠的脑组织中染色体DNA损伤较明显。
通过染色体核酸提取实验，我们发现实验组小鼠的染色体DNA断裂和损伤程度明显增加，与对照组相比存在显著差异。
这也进一步证明了线粒体功能障碍与神经退行性疾病的关联。
讨论线粒体功能障碍与神经退行性疾病之间存在密切的关系。
本实验结果显示，线粒体功能抑制处理后的小鼠表现出行为学异常、线粒体功能受损和染色体DNA损伤等特征，与神经退行性疾病的病理特征相似。
这表明，线粒体功能障碍可能是神经退行性疾病发生和发展的一个重要机制。
结论通过本实验的结果可以推断，线粒体功能障碍与神经退行性疾病之间存在密切的相关性。
进一步的研究有助于深入了解神经退行性疾病的发病机制，并为寻找相关的治疗方法提供重要的理论依据。
限于篇幅和资源，本实验还存在一些不足之处，例如实验样本较少，需要进一步扩大样本量以提高实验的可靠性。
小鼠缺氧实验报告总结(共6篇)1. 实验目的分析小鼠缺氧对其器官和组织的影响，研究不同缺氧程度对小鼠的影响差异，探究相关治疗手段的有效性。
2. 实验方法将小鼠随机分为3组，分别进行正常供氧、缺氧15分钟和缺氧30分钟的实验，采用HE染色观察肝脏、肾脏、心脏和肺组织的形态学变化，使用ELISA测定血浆中的TNF-α、IL-1β和IL-6水平，应用脑功能评估仪对小鼠进行神经行为学评估。
3. 实验结果3.1 形态学变化与正常组相比，缺氧15分钟和缺氧30分钟组小鼠的肝脏、肾脏和心脏组织出现不同程度的细胞肿胀、坏死和炎症反应，肺组织出现明显的肺泡壁增厚。
缺氧30分钟组小鼠脏器组织损伤更为明显。
3.2 水平变化ELISA结果显示，与正常组相比，缺氧15分钟和缺氧30分钟组小鼠的血浆TNF-α、IL-1β和IL-6水平均明显升高，其中，缺氧30分钟组上升最为显著。
3.3 神经行为学评估缺氧30分钟组小鼠在神经行为学评估中表现出较低的活跃水平和运动能力，神经反应时间延长。
小鼠缺氧对其器官和组织造成了不同程度的损伤和炎症反应，在缺氧30分钟的情况下，损伤更为明显。
缺氧引起了血浆中炎症因子的水平升高，表明缺氧引起的器官和组织损伤可能与炎症反应有关。
缺氧也对小鼠的神经功能造成了影响。
针对小鼠缺氧造成的损伤和影响，有必要研究相应的治疗手段。
5. 实验启示缺氧对动物的影响是复杂的，需要采用多种评估方法进行综合评估。
炎症反应可能是缺氧造成的器官和组织损伤的机制之一。
在研究缺氧治疗手段时，需要考虑多个方面，包括药物、物理治疗和营养支持等。
科技视界SCIENCE & TECHNOLOGY VISION26 |科技点亮视界孤独症谱系障碍（autism spectrum disorder ，ASD ）是一种严重的神经发育障碍性疾病，以社交障碍、重复行为和兴趣受限为特征。
我国最新发表文章显示，我国0～6岁儿童中ASD 的患病率为1.8%[1]，但其统计主要集中在几个省，实际患病率可能更高，并逐年增长。
关于ASD 发病原因，目前普遍认为是胚胎在神经发育时期环境和遗传因素共同作用的结果，但尚无定论，因此也未出现有效治疗ASD 核心症状的方法，迫切需要进行相关实验研究来解决这一困境。
动物模型是探索孤独症的致病机制和寻找潜在治疗方法的重要工具。
关于自闭症的生物学研究主要围绕经典的实验动物模型展开，之前优先选择的动物模型是调控环境因素模型中的丙戊酸诱导模型（VPA 模型）。
为了更深入研究ASD ，研究者找到了一种近交系BTBR T+ Itpr3tf/J 菌株，之后研究人员在对40个近交系菌株做行为学实验研究小鼠基因多样性时，根据它们在加速旋转上的表现发现了BTBR 小鼠具有与ASD 患者非常一致的孤独症行为，并且在神经解剖、生理和免疫等方面与ASD 患者也有高度的相似性。
本综述将对BTBR 孤独症小鼠动物模型近年的研究进展进行梳理和总结，希望对ASD 相关研究提供一些支持和帮助。
1 BTBR 小鼠的孤独症行为1.1 核心症状ASD 患者具有明显的社交障碍、拒绝与他人交流、不关注周围发生的事且很难激起兴趣和注意，情感反应冷淡等。
BTBR 小鼠不同于普通C57小鼠对新奇事物存在偏好，BTBR 小鼠对新奇事物缺乏兴趣，参与互动、相互嗅探、跟随的时间较少，社会互动能力很低，这与基金项目：广西学位与研究生改革课题（JGY2022199）作者简介：刘玉凤，主要研究方向为神经疾病的分子与细胞生物学研究。
通信作者：方方，副教授，主要研究方向为神经疾病的分子与细胞生物学研究。
脑卒中作为严重威胁人类健康的脑血管病，是人类致死的第2大疾病，也是最主要的致残原因［1,2］。
研究显示，2020年全球1171万人卒中发病，其中缺血性脑卒中为759万人（约占65%）［3］。
缺血性脑卒中可造成缺血部位的神经元发生不可逆转的死亡，导致多种神经回路上的通路发生中断，进而出现一系列功能障碍［4］。
稳定、可靠、可重复性好、梗死面积均一的动物模型是深入研究缺血性脑卒中的基础与关键，对于研究脑卒中的病理机制和卒中后神经功能障碍的康复治疗具有重要意义。
电凝法是一种常用的啮齿动物脑缺血造模方Validation of a C57/BL6J mouse model of focal cerebral ischemia established by electrocoagulation of the middle cerebral arteryKANG Yunyun 1,TANG Dongning 1,ZHANG Jian 1,2,XIA Qing 1,21Research Center of Experimental Acupuncture,2School of Medical Technology,Tianjin University of Chinese Medicine,Tianjin 301617,China摘要：目的通过改良电凝法制作小鼠局灶性大脑中动脉阻塞（MCAO ）模型的方法、筛选适用于模型小鼠的评价指标，为开展脑缺血相关的长期研究提供模型参考。
方法选用C57/BL6J 雄性小鼠46只，随机分为模型组（n =34）和对照组（n =12）。
采用凝血器永久性凝断小鼠右侧大脑中动脉制备大脑中动脉闭塞模型。
通过激光散斑血流成像仪监测造模前、造模后20min 、造模后1d 的脑血流灌注量；通过Longa 评分、mNSS 评分、平衡木行走实验、圆筒实验、转角实验评价小鼠造模后1、7、14d 的神经功能；采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC ）染色测量缺血灶梗死范围，以评估模型是否成功及各指标之间的相关性。
㊃实验研究㊃海马Ｆ⁃肌动蛋白聚合在老年小鼠围术期神经认知障碍中的作用贾敏㊀纪木火㊀高玉竹㊀何雪㊀杨建军㊀㊀ＤＯＩ：１０．１２０８９／ｊｃａ．２０２１．０３．０１５基金项目：国家自然科学基金（８１７７１１５６）作者单位：２１０００２㊀南京大学医学院临床学院东部战区总医院麻醉科（贾敏㊁高玉竹㊁何雪）；南京医科大学第二附属医院麻醉科（纪木火）；郑州大学第一附属医院麻醉与围术期医学部（杨建军）通信作者：杨建军，Ｅｍａｉｌ：ｊｉａｎｊｕｎｙａｎｇ１９７１＠１６３．ｃｏｍ㊀㊀ʌ摘要ɔ㊀目的㊀研究海马Ｆ⁃肌动蛋白聚合在老年小鼠围术期神经认知障碍（ＰＮＤ）中的作用并探讨其可能的作用机制㊂方法㊀２０月龄雄性Ｃ５７ＢＬ／６小鼠７２只，随机均分为四组：对照＋溶质组（ＣＶ组）㊁对照＋ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ（Ｆ⁃肌动蛋白聚合诱导剂）组（ＣＪ组）㊁模型＋溶质组（ＰＶ组）及模型＋ｊａｓ⁃ｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ组（ＰＪ组），每组１８只㊂采用异氟醚麻醉＋腹腔探查术建立ＰＮＤ模型㊂手术麻醉开始前２ｈ和行为学训练后即刻左侧脑室注射ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ（０ ５μｇ／１ ５μｌ）（ＣＪ组和ＰＪ组）或等容量溶质（９７ ５％生理盐水＋２ ５％ＤＭＳＯ）（ＣＶ组和ＰＶ组）㊂手术麻醉后第２天行场景性条件恐惧实验训练㊁第３天行场景性条件恐惧实验测试僵直时间百分比㊂行为学测试结束后９０ｍｉｎ取脑组织㊂采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测海马Ｆ⁃ａｃｔｉｎ㊁Ｇ⁃ａｃｔｉｎ㊁突触体和神经元膜上ＧｌｕＲ１和ＧｌｕＲ２含量；采用高尔基染色检测海马ＣＡ１区神经元树突棘数目和分型；采用免疫荧光检测海马ＣＡ１区ｃ⁃ｆｏｓ数目㊂结果㊀条件性恐惧实验训练阶段，四组僵直时间百分比差异无统计学意义㊂与ＣＶ组比较，ＰＶ组在手术麻醉后第３天场景性条件恐惧实验测试中的僵直时间百分比明显下降，海马Ｆ⁃ａｃｔｉｎ／Ｇ⁃ａｃｔｉｎ数值㊁突触体和神经元膜上ＧｌｕＲ１和ＧｌｕＲ２含量明显降低，ＣＡ１区神经元树突棘总数㊁丝状伪足和蘑菇型数目以及ｃ⁃ｆｏｓ数目明显减少（Ｐ＜０ ０５）㊂与ＰＶ组比较，ＰＪ组僵直时间百分比明显上升，海马Ｆ⁃ａｃｔｉｎ／Ｇ⁃ａｃｔｉｎ数值㊁突触体和神经元膜上ＧｌｕＲ１和ＧｌｕＲ２含量明显升高，ＣＡ１区神经元树突棘总数㊁丝状伪足和蘑菇型数目以及ｃ⁃ｆｏｓ数目明显增多（Ｐ＜０ ０５）㊂结论㊀Ｆ⁃肌动蛋白聚合诱导剂ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ可改善老年小鼠术后的场景性恐惧记忆损害，其作用机制可能与促进树突棘重塑和ＡＭＰＡ受体转运上膜，增加神经元活动有关㊂ʌ关键词ɔ㊀围术期神经认知障碍；老龄小鼠；海马；Ｆ⁃肌动蛋白聚合ＲｏｌｅｓｏｆｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌＦ⁃ａｃｔｉｎｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｉｎａｇｅｄｍｉｃｅｗｉｔｈｐｅｒｉｏｐｅｒａｔｉｖｅｎｅｕｒｏｃｏｇｎｉｔｉｖｅｄｉｓｏｒｄｅｒｓ㊀ＪＩＡＭｉｎ，ＪＩＭｕｈｕｏ，ＧＡＯＹｕｚｈｕ，ＨＥＸｕｅ，ＹＡＮＧＪｉａｎｊｕｎ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＡｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ，ＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＥａｓｔｅｒｎＴｈｅａｔｅｒＣｏｍｍａｎｄ，ＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｃｉｎｅ，ＮａｎｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１０００２，ＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＹＡＮＧＪｉａｎｊｕｎ，Ｅｍａｉｌ：ｊｉａｎｊｕｎｙａｎｇ１９７１＠１６３．ｃｏｍʌＡｂｓｔｒａｃｔɔ㊀Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀ＴｏｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｔｈｅｒｏｌｅｓｏｆｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌＦ⁃ａｃｔｉｎｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｎｐｅｒｉｏｐｅｒａ⁃ｔｉｖｅｎｅｕｒｏｃｏｇｎｉｔｉｖｅｄｉｓｏｒｄｅｒｓ（ＰＮＤ）ｉｎａｇｅｄｍｉｃｅ，ａｎｄｔｈｅｎｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｕｎｄｅｒｌｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀ＴｈｅＰＮＤｍｏｄｅｌｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｙｉｓｏｆｌｕｒａｎｅａｎｅｓｔｈｅｓｉａ＋ｌａｐａｒｏｔｏｍｙｓｕｒｇｅｒｙ．Ｓｅｖｅｎｔｙ⁃ｔｗｏｍａｌｅＣ５７ＢＬ／６ｍｉｃｅａｇｅｄ２０ｍｏｎｔｈｓｏｌｄｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｆｏｕｒｇｒｏｕｐｓ：ｃｏｎｔｒｏｌ＋ｖｅｈｉｃｌｅｇｒｏｕｐ（ｇｒｏｕｐＣＶ），ｃｏｎｔｒｏｌ＋ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅｇｒｏｕｐ（ａｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ⁃ａｃｔｉｎｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ，ｇｒｏｕｐＣＪ），ｍｏｄｅｌ＋ｖｅｈｉｃｌｅｇｒｏｕｐ（ｇｒｏｕｐＰＶ），ａｎｄｍｏｄｅｌ＋ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅｇｒｏｕｐ（ｇｒｏｕｐＰＪ）．ＭｉｃｅｗｅｒｅｓｕｂｊｅｃｔｅｄｔｏａｎａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆＪａｓｐｌａｋｉｎｏｌ⁃ｉｄｅ（０ ５μｇ／１ ５μｌ）ｏｒｉｓｏｃｈｏｒｉｃｖｅｈｉｃｌｅ（９７ ５％ｓａｌｉｎｅ＋２ ５％ＤＭＳＯ）ｖｉａｌｅｆｔｌａｔｅｒａｌｖｅｎｔｒｉｃｌｅｉｎｊｅｃ⁃ｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｗａｓｇｉｖｅｎ２ｈｏｕｒｓｂｅｆｏｒｅｔｈｅａｎｅｓｔｈｅｓｉａａｎｄｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙａｆｔｅｒｔｒａｉｎｉｎｇｓｅｓｓｉｏｎｏｆｃｏｎｔｅｘｔｕａｌｆｅａｒｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇｔｅｓｔ．Ｔｈｅｔｒａｉｎｉｎｇａｎｄｔｈｅｔｅｓｔｓｅｓｓｉｏｎｓｏｆｃｏｎｔｅｘｔｕａｌｆｅａｒｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇｔｅｓｔｗｅｒｅｅｘｈｉｂｉｔｅｄ２ｄａｙｓａｎｄ３ｄａｙｓａｆｔｅｒｏｐｅｒａｔｉｏｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｂｒａｉｎｔｉｓｓｕｅｓｗｅｒｅｈａｒｖｅｓｔｅｄ９０ｍｉｎｕｔｅｓａｆｔｅｒｔｈｅｌａｓｔｂｅｈａｖｉｏｒａｌｔｅｓｔ．ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌＦ⁃ａｃｔｉｎ，Ｇ⁃ａｃｔｉｎ，ＧｌｕＲ１ａｎｄＧｌｕＲ２ｉｎｓｙｎａｐｔｏｓｏｍｅａｎｄｏｎｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｇｏｌｇｉｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｔａｉｎｉｎｇｗｅｒｅａｐｐｌｉｅｄｔｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｄｅｎｄｒｉｔｉｃｓｐｉｎｅｓｏｒｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｃ⁃ｆｏｓｉｎｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌＣＡ１ｒｅｇｉｏｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀Ｉｎｔｈｅｔｒａｉｎｉｎｇｓｅｓｓｉｏｎｏｆｆｅａｒｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇｔｅｓｔ，ｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｗｅｒｅｃａｌｃｕｌａｔｅｄｉｎｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｆｒｅｅｚｉｎｇｔｉｍｅａｍｏｎｇｔｈｅｆｏｕｒｇｒｏｕｐｓ．ＣｏｍｐａｒｅｄｔｏｇｒｏｕｐＣＶ，ｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｆｒｅｅｚｉｎｇｔｉｍｅｗａｓｄｒａｍａｔｉｃａｌｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＦ⁃ａｃｔｉｎ／Ｇ⁃ａｃｔｉｎｒａｔｉｏ，ＧｌｕＲ１ａｎｄＧｌｕＲ２ｉｎｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｓｙｎａｐｔｏ⁃ｓｏｍｅａｎｄｍｅｍｂｒａｎｅｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｄｕｃｅｄ，ｔｈｅｔｏｔａｌｎｕｍｂｅｒｏｆｄｅｎｄｒｉｔｉｃｓｐｉｎｅａｓｗｅｌｌａｓｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｆｉｌｏｐｏｄｉａ⁃ａｎｄｍｕｓｈｒｏｏｍ⁃ｓｐｉｎｅ，ａｎｄｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｃ⁃ｆｏｓｉｎＣＡ１ｒｅｇｉｏｎｗｅｒｅａｐｐａｒｅｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎｇｒｏｕｐＰＶ（Ｐ＜０ ０５）．ＲｅｌａｔｉｖｅｔｏｔｈｅｇｒｏｕｐＰＶ，ｔｈｅａｂｏｖｅｃｈａｎｇｅｓｗｅｒｅｒｅｖｅｒｓｅｄｂｙｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ（Ｐ＜０ ０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀Ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ，ａｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ⁃ａｃｔｉｎｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ，ｃａｎｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｄｅｆｉｃｉｔｓｏｆｃｏｎｔｅｘｔｕａｌｆｅａｒｍｅｍｏｒｙｉｎＰＮＤ⁃ａｇｅｄｍｉｃｅｖｉａｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌＦ⁃ａｃｔｉｎｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄｔｈｅｎｉｎｃｒｅａｓｅｄｅｎ⁃ｄｒｉｔｉｃｓｐｉｎｅｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇａｎｄＡＭＰＡｒｅｃｅｐｔｏｒｍｅｍｂｒａｎｅｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｗｈｉｃｈａｕｇｍｅｎｔｓｔｈｅｎｅｕｒｏｎａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．ʌＫｅｙｗｏｒｄｓɔ㊀Ｐｅｒｉｏｐｅｒａｔｉｖｅｎｅｕｒｏｃｏｇｎｉｔｉｖｅｄｉｓｏｒｄｅｒｓ；Ａｇｅｄｍｉｃｅ；Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ；Ｆ⁃ａｃｔｉｎｐｏｌｙｍｅｒｉ⁃ｚａｔｉｏｎ㊀㊀围术期神经认知障碍（ｐｅｒｉｏｐｅｒａｔｉｖｅｎｅｕｒｏｃｏｇｎｉｔｉｖｅｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，ＰＮＤ）目前的具体发病机制尚不完全清楚㊂先前研究表明，树突棘中富集两种动态调节的肌动蛋白，即单体球型肌动蛋白（Ｇ⁃ａｃｔｉｎ）和其聚合形成的不对称双螺旋型纤维丝状肌动蛋白（Ｆ⁃ａｃｔｉｎ）；Ｆ⁃ａｃｔｉｎ和Ｇ⁃ａｃｔｉｎ动态平衡调控树突棘形成和消除㊁突触结构和功能改变㊁长时程增强和抑制等，参与神经网络活动和学习记忆等功能［１］㊂在阿尔茨海默病中，大脑皮质中Ｆ⁃肌动蛋白解聚介导树突棘密度降低及形态异常进而导致条件性恐惧记忆损害［２］㊂此外，本课题组前期研究［３］亦提示，ＰＮＤ老年小鼠伴有海马肌动蛋白动力学失衡，主要表现为Ｆ⁃ａｃｔｉｎ／Ｇ⁃ａｃｔｉｎ数值降低㊂本实验旨在探讨海马Ｆ⁃肌动蛋白聚合在ＰＮＤ老龄小鼠中的作用及其机制㊂材料与方法实验分组与方法㊀２０月龄雄性Ｃ５７ＢＬ／６小鼠７２只，采用随机数字表法均分为四组：对照＋溶质组（ＣＶ组）㊁对照＋ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ（Ｆ⁃肌动蛋白聚合诱导剂）组（ＣＪ组）㊁模型＋溶质组（ＰＶ组）及模型＋ｊａｓ⁃ｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ组（ＰＪ组），每组１８只㊂手术麻醉开始前２ｈ和行为学训练后即刻左侧脑室注射ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ（０ ５μｇ／１ ５μｌ；２７９２，Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）［３］（ＣＪ组和ＰＪ组）或等容量溶质（９７ ５％生理盐水＋２ ５％ＤＭＳＯ）（ＣＶ组和ＰＶ组）㊂手术麻醉后第２天行条件性恐惧实验训练㊁第３天行场景性条件恐惧实验测试㊂侧脑室置管㊀根据前期研究，ＰＮＤ模型建立前７天，行左侧脑室置管［４］㊂１ ４％异氟醚麻醉小鼠，将小鼠头部水平固定在脑立体定位仪上㊂头部皮肤消毒后，沿矢状缝作一约１ ５ｃｍ的切口，清晰暴露颅骨㊂设定前囟为起始零点，根据小鼠脑立体定位图谱（第二版）定位左侧脑室（ＡＰ：－０ ５８ｍｍ，ＭＬ：－１ ０ｍｍ，ＤＶ：－２ ２５ｍｍ），置入单管微量给药导管后，头钉及牙科水泥固定㊂通过微量注射泵以０ １５μｌ／ｍｉｎ速度缓慢注射ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ或等容量溶质１ ５μｌ，注射完成后留针５ｍｉｎ㊂缝合皮肤后，将小鼠置于３７ħ恒温台至苏醒㊂ＰＮＤ模型建立㊀根据本课题组前期研究［３－４］，采用异氟醚麻醉＋腹腔探查术建立ＰＮＤ模型（ＰＶ组和ＰＪ组）㊂将需接受手术的小鼠置于麻醉箱（箱内预充１ ４％异氟醚＋纯氧）中，维持麻醉１０ｍｉｎ，腹部消毒，腹正中作一约１ ５ｃｍ切口，行腹腔探查术［３－４］，手术时间约１０ｍｉｎ，随后用５－０和４－０无菌丝线顺序缝合肌肉筋膜及皮肤㊂术后即刻伤口涂抹硫链丝霉素，术中及术后保温毯３７ħ保温㊂ＣＶ组和ＣＪ组小鼠除持续吸入相同时间纯氧外不进行手术㊂条件性恐惧实验㊀将实验分为条件性恐惧实验训练和场景性条件恐惧实验测试两个阶段，所有小鼠均参与行为学实验㊂由图像自动监视系统（ＸＲ⁃ＸＣ４０４）自动追踪小鼠的活动轨迹㊂术后第２天行条件恐惧实验训练㊂将小鼠放入隔音训练箱中适应１８０ｓ，随后接受声音（３０ｓ，７５ｄＢ，３０００Ｈｚ）和足底电击（２ｓ，０ ７５ｍＡ，声音结束前最后２ｓ行电击），停留３０ｓ后将小鼠放回原饲养笼中㊂训练结束后２４ｈ，行场景性条件恐惧实验测试㊂将小鼠放回原实验箱内，无任何刺激，记录小鼠５ｍｉｎ内僵直（除呼吸外无其他行为的无活动状态）时间㊂每次实验结束后，立即用７５％酒精擦拭场地，充分晾干后，进行下一只小鼠实验㊂Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测㊀行为学测试结束后９０ｍｉｎ，随机每组取４只小鼠，冰上取海马组织，－８０ħ冻存㊂分别采用Ｆ⁃ａｃｔｉｎ／Ｇ⁃ａｃｔｉｎ体内测定生化试剂盒（ＢＫ０３７）提取海马Ｆ⁃ａｃｔｉｎ和Ｇ⁃ａｃｔｉｎ；蔗糖梯度离心法，提取海马突触体；膜蛋白提取试剂盒（８９８４２）提取海马膜蛋白㊂Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测海马Ｆ⁃ａｃｔｉｎ㊁Ｇ⁃ａｃｔｉｎ㊁突触体和膜蛋白ＧｌｕＲ１和ＧｌｕＲ２含量㊂ＢＣＡ法蛋白浓度测定，蛋白定量及加热变性后，等体积上样，ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ凝胶电泳分离㊁转膜，室温５％脱脂牛奶封闭１ｈ㊂一抗４ħ孵育过夜，ＴＢＳＴ洗涤３ˑ８ｍｉｎ㊂二抗室温下孵育１ｈ，ＴＢＳＴ洗涤３ˑ８ｍｉｎ，底物显色反应㊁机器显影㊂采用ＩｍａｇｅＪ软件计算Ｆ⁃ａｃｔｉｎ㊁Ｇ⁃ａｃｔｉｎ㊁ＧｌｕＲ１及ＧｌｕＲ２的含量㊂一抗㊁二抗和内参货号如下：ａｃｔｉｎ（ＡＡＮ０１）㊁ＧｌｕＲ１（ａｂ３１２３２㊁ａｂ１７４７８５）㊁ＧｌｕＲ２（ａｂ１３３４７７；１１９４⁃１⁃ＡＰ）㊁Ｎａ＋⁃Ｋ＋⁃ＡＴＰ酶１（１４４１８⁃１⁃ＡＰ），ＧＡＰＤＨ（ＡＦ５００９），β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ（ａｂ７８０７８）及ＨＲＰ二抗（Ａ０２０８㊁Ａ０２１６）㊂高尔基染色㊀采用ＦＤ快速高尔基染色试剂盒（ＰＫ４０１）㊂行为学测试结束后９０ｍｉｎ，每组随机取３只小鼠，取全脑㊂采用ＦＤ快速高尔基染色试剂盒（ＰＫ４０１）进行染色㊂实验操作步骤简述为：ｍｉｌｌｉＱ水冲掉大脑表面的血渍后，将大脑浸泡在ＡＢ浸渍液（溶液Ａ１０ｍｌ＋溶液Ｂ１０ｍｌ等体积混合）中，２４ｈ后更换一次新的ＡＢ浸渍液，室温避光２１ｄ㊂随后将大脑组织完全浸泡于溶液Ｃ，４ħ避光７ｄ后，振动切片机切片（１００μｍ），防脱玻片贴片，充分晾干后，ＤＥ混合液（溶液Ｄ５ｍｌ＋溶液Ｅ５ｍｌ＋双蒸水１０ｍｌ）染色㊂先后使用５０％㊁７５％㊁９５％和无水乙醇行梯度脱水，二甲苯透明，封片剂封片，晾干㊂Ｚｅｉｓｓ显微镜拍摄（物镜１００ˑ）海马ＣＡ１区神经元树突棘㊂ＩｍａｇｅＪ用于分析小鼠（每只小鼠选取５个神经元）海马ＣＡ１区神经元树突棘数目㊁丝状伪足（ｆｉｌｏｐｏｄｉａ）和蘑菇型（ｍｕｓｈｒｏｏｍ）的树突棘分型［４］㊂免疫荧光检测㊀采用免疫荧光检测海马ＣＡ１区ｃ⁃ｆｏｓ数目㊂行为学９０ｍｉｎ后，每组随机取３只小鼠，２％戊巴比妥钠麻醉后，等体积ＰＢＳ和４％多聚甲醛经左心室灌注，４ħ固定１２ｈ，３０％蔗糖脱水，ＯＣＴ包埋，冰冻切片机切片（２５μｍ），防脱玻片贴片，晾干后，ＰＢＳ清洗，０ ３％ＴｒｉｔｏｎＸ⁃１００浸泡１５ｍｉｎ，１０％羊血清封闭１ｈ，加一抗ｃ⁃ｆｏｓ（ａｂ１９０２８９）４ħ孵育过夜㊂ＰＢＳ清洗后，对应二抗ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ４８８山羊抗兔ＩｇＧ（Ａ０４２３）孵育１ｈ，ＰＢＳ清洗，含ＤＡＰＩ的封片剂（Ｐ３６９６６）封片㊂Ｚｅｉｓｓ共聚焦显微镜拍摄（物镜４０ˑ）海马ＣＡ１区，ＩｍａｇｅＪ统计带荧光的ｃ⁃ｆｏｓ阳性（ｃ⁃ｆｏｓ＋）细胞数目㊂统计分析㊀采用ＰｒｉｓｍＧｒａｐｈＰａｄ８ ０软件绘图和分析数据㊂正态分布计量资料以均数ʃ标准误（ ｘʃＳ ｘ）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Ｔｕｋｅｙ法㊂Ｐ＜０ ０５为差异有统计学意义㊂结㊀㊀果僵直时间百分比㊀条件性恐惧实验训练阶段，在刺激前后，四组僵直时间百分比差异无统计学意义（图１）㊂场景性条件恐惧实验测试阶段，与ＣＶ组比较，ＰＶ组僵直时间百分比明显降低（Ｐ＜０ ０５）；与ＰＶ组比较，ＰＪ组僵直时间百分比明显升高（Ｐ＜０ ０５）；ＣＶ㊁ＣＪ和ＰＪ组僵直时间百分比差异无统计学意义（图２）㊂图１㊀条件性恐惧实验训练阶段四组小鼠僵直时间百分比的比较㊀㊀注：与ＣＶ组比较，ａＰ＜０ ０５；与ＰＶ组比较，ｂＰ＜０ ０５图２㊀场景性条件恐惧实验测试阶段四组小鼠僵直时间百分比的比较海马Ｆ⁃ａｃｔｉｎ／Ｇ⁃ａｃｔｉｎ㊀与ＣＶ组比较，ＰＶ组海马Ｆ⁃ａｃｔｉｎ／Ｇ⁃ａｃｔｉｎ比值明显降低（Ｐ＜０ ０５）；与ＰＶ组比较，ＰＪ组海马Ｆ⁃ａｃｔｉｎ／Ｇ⁃ａｃｔｉｎ比值明显增大（Ｐ＜０ ０５）㊂ＣＶ㊁ＣＪ和ＰＪ组海马Ｆ⁃ａｃｔｉｎ／Ｇ⁃ａｃｔｉｎ比值差异无统计学意义（图３）㊂海马ＣＡ１区神经元树突棘㊀与ＣＶ组比较，ＰＶ组海马ＣＡ１区树突棘总数㊁丝状伪足和蘑菇型树突棘数量明显减少（Ｐ＜０ ０５）；与ＰＶ组比较，ＰＪ组海马ＣＡ１区树突棘总数㊁丝状伪足和蘑菇型树突棘数量明显增加（Ｐ＜０ ０５）（图４）㊂突触体和神经元膜上ＧｌｕＲ１和ＧｌｕＲ２蛋白含量㊀与ＣＶ组比较，ＰＶ组海马突触体和神经元膜上ＧｌｕＲ１和ＧｌｕＲ２蛋白含量明显降低（Ｐ＜０ ０５）；与ＰＶ组比较，ＰＪ组海马突触体和神经元膜上ＧｌｕＲ１和ＧｌｕＲ２蛋白含量明显升高（Ｐ＜０ ０５）（图５ ６）㊂海马ＣＡ１区ｃ⁃ｆｏｓ数目㊀与ＣＶ组比较，ＰＶ组海马ＣＡ１区ｃ⁃ｆｏｓ数目明显减少（Ｐ＜０ ０５）；与ＰＪ组比较，ＰＶ组海马ＣＡ１区ｃ⁃ｆｏｓ数目明显增多（Ｐ＜㊀㊀注：与ＣＶ组比较，ａＰ＜０ ０５；与ＰＶ组比较，ｂＰ＜０ ０５图３㊀四组小鼠海马Ｆ⁃ａｃｔｉｎ／Ｇ⁃ａｃｔｉｎ比值的比较㊀㊀注：与ＣＶ组比较，ａＰ＜０ ０５；与ＰＶ组比较，ｂＰ＜０ ０５图４㊀四组小鼠海马ＣＡ１区树突棘总数、丝状伪足和蘑菇型树突棘数量的比较０ ０５）（图７）㊂讨㊀㊀论本实验研究结果显示：异氟醚麻醉＋腹腔探查术致老年小鼠场景性恐惧实验测试的僵直时间百分比明显下降，提示海马依赖性联想恐惧记忆受损；ＰＮＤ老年小鼠海马Ｆ⁃ａｃｔｉｎ／Ｇ⁃ａｃｔｉｎ数值降低，提示Ｆ⁃肌动蛋白聚合下降，伴有海马突触体和神经元膜上ＧｌｕＲ１和ＧｌｕＲ２含量降低㊁ＣＡ１区神经元树突棘总数㊁丝状伪足和蘑菇型数目以及ｃ⁃ｆｏｓ数目减少；而侧脑室注射Ｆ⁃肌动蛋白聚合诱导剂ｊａｓｐｌａｋｉｎ⁃㊀㊀注：与ＣＶ组比较，ａＰ＜０ ０５；与ＰＶ组比较，ｂＰ＜０ ０５图５㊀四组海马突触体ＧｌｕＲ１和ＧｌｕＲ２蛋白含量的比较㊀㊀注：与ＣＶ组比较，ａＰ＜０ ０５；与ＰＶ组比较，ｂＰ＜０ ０５图６㊀四组海马神经元膜上ＧｌｕＲ１和ＧｌｕＲ２蛋白含量的比较ｏｌｉｄｅ致使Ｆ⁃ａｃｔｉｎ／Ｇ⁃ａｃｔｉｎ数值增高，提示Ｆ⁃肌动蛋白聚合增加，且海马突触体和神经元膜上ＧｌｕＲ１和ＧｌｕＲ２含量升高㊁ＣＡ１区神经元树突棘总数㊁丝状伪足和蘑菇型数目以及ｃ⁃ｆｏｓ数目增加，说明ｊａｓｐｌａｋｉｎ⁃ｏｌｉｄｅ通过促进Ｆ⁃肌动蛋白聚合改善ＰＮＤ老年小鼠的海马依赖性联想恐惧记忆㊂目前研究认为，神经突上的树突棘是接收㊁传递信息和突触可塑性发生的主要部位且树突棘重塑受神经元活动的调节，例如在ＬＴＰ或ＬＴＤ过程中，树突棘可增大／缩小㊁增加／消除或形态改变等；树突棘重塑改变通常导致突触功能异常并与神经退行性疾病相关动物模型中的认知功能障碍密切㊀㊀注：与ＣＶ组比较，ａＰ＜０ ０５；与ＰＶ组比较，ｂＰ＜０ ０５图７㊀四组海马ＣＡ１区ｃ⁃ｆｏｓ数目的比较相关［５］㊂在神经元活动引起的树突棘形态和数目等变化中，肌动蛋白（Ｆ⁃ａｃｔｉｎ和Ｇ⁃ａｃｔｉｎ）动力学平衡起至关重要的作用㊂因Ｆ⁃肌动蛋白在树突棘中高度富集且树突棘重塑受肌动蛋白动力学影响，所以Ｆ⁃肌动蛋白的聚合和解聚在学习记忆以及记忆巩固等脑功能中发挥重要作用［１］㊂由此，保持树突棘内Ｆ⁃ａｃｔｉｎ／Ｇ⁃ａｃｔｉｎ的比率对于维护突触可塑性和神经元的功能至关重要㊂先前研究提示，在ＡＤ小鼠大脑皮层中，突触体内Ｆ⁃肌动蛋白解聚增加导致场景性恐惧记忆损害，而椎管内内注射Ｆ⁃肌动蛋白解聚剂Ｌａｔｒｕｎｃｕｌｉｎ可模拟此损害；ＡＤ患者死后大脑皮层中，亦可检测到Ｆ⁃ａｃｔｉｎ／Ｇ⁃ａｃｔｉｎ比值降低［１］㊂本实验研究与先前研究结果相似，ＰＮＤ老年小鼠海马依赖性联想恐惧记忆损害伴Ｆ⁃ａｃｔｉｎ／Ｇ⁃ａｃｔｉｎ比值降低，提示Ｆ⁃肌动蛋白聚合下降可能参与此记忆损害；而侧脑室注射Ｆ⁃肌动蛋白聚合诱导剂ｊａｓｐｌａｋｉｎ⁃ｏｌｉｄｅ后，可增加海马Ｆ⁃ａｃｔｉｎ／Ｇ⁃ａｃｔｉｎ比值（Ｆ⁃肌动蛋白聚合增加），改善认知功能㊂因此，本实验研究说明：海马Ｆ⁃肌动蛋白聚合下降介导ＰＮＤ老年小鼠的海马依赖性联想恐惧记忆损害㊂树突棘是大多数兴奋性突触后膜的受体区域，它们的形态可塑性在学习记忆中发挥关键作用［６］㊂树突棘形态的可塑性，包括体积和形状，是受肌动蛋白细胞骨架在树突棘中高度集中的动态调节，若无动态的肌动蛋白细胞骨架，树突棘则将无法响应信息刺激而迅速改变其体积或形态［６－８］㊂在哺乳动物大脑中，约９０％以上的兴奋性谷氨酸能突触发生在富含肌动蛋白的突起的树突棘上㊂其中，海马锥体细胞上ＮＭＤＡ受体的突触聚集很少依赖于Ｆ⁃肌动蛋白，而ＡＭＰＡ受体的突触聚集和转运上膜则强烈依赖于Ｆ⁃肌动蛋白［９－１１］㊂ＡＭＰＡ受体属于动态转运蛋白质，可随神经元活动ＬＴＰ和ＬＴＤ的变化进行修饰，快速地插入突触后膜以及内化入胞质，例如突触后ＡＭＰＡ受体的膜上数量增加和减少分别参与ＬＴＰ和ＬＴＤ，因此这种动态转运方式使其在多种形式的树突棘和突触重塑中发挥重要作用［１２－１４］㊂ＡＭＰＡ受体是由其四种亚基ＧｌｕＲ１㊁ＧｌｕＲ２㊁ＧｌｕＲ３和ＧｌｕＲ４组成的异四聚体，根据不同的亚基聚合方式构成不同亚型的ＡＭＰＡ受体㊂在成年小鼠海马的兴奋性神经元中，ＡＭＰＡ受体主要呈现为ＧｌｕＲ１／ＧｌｕＲ２和ＧｌｕＲ２／ＧｌｕＲ３两种形式㊂Ｈａｎ等［１５］研究表明，海马中ＡＭＰＡ受体的突触分布有助于突触增强，这是学习和记忆的基础，亦是编码情景或恐惧记忆所必需的［１５］㊂其中含有ＧｌｕＲ１／ＧｌｕＲ２的ＡＭＰＡ受体插入突触后膜增加有助于促进ＬＴＰ和经验依赖性神经元可塑性，且海马突触中ＧｌｕＲ１／ＧｌｕＲ２转运上膜参与场景性恐惧记忆［１５－１６］；而在阿尔兹海默症中，淀粉样蛋白⁃β寡聚体可通过迅速诱导Ｆ⁃肌动蛋白在树突棘中的解聚，阻断ＬＴＰ诱导后的突触后密度处ＡＭＰＡＲ亚基ＧｌｕＡ１的插入，从而损害突触强度和神经元活动［１７－１９］㊂由此推测ＰＮＤ老年小鼠海马Ｆ⁃肌动蛋白聚合下降可能通过抑制树突棘重塑和ＡＭＰＡ受体转运上膜，进而降低神经元活动，导致场景性条件恐惧记忆损害㊂本实验研究通过检测ＰＮＤ老年小鼠海马ＣＡ１区树突棘及其分型和神经元活动指示蛋白ｃ⁃ｆｏｓ发现，ＰＮＤ老年小鼠海马ＣＡ１区树突棘总数㊁丝状伪足和蘑菇型数目减少，突触体和神经元膜上ＧｌｕＲ１和ＧｌｕＲ２含量降低以及ＣＡ１区ｃ⁃ｆｏｓ数目减少，伴僵直时间百分比下降；而侧脑室应用Ｆ⁃肌动蛋白聚合诱导剂Ｊａｓ⁃ｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ可逆转以上变化㊂据此显示，ＰＮＤ老年小鼠海马Ｆ⁃肌动蛋白聚合下降致场景性条件恐惧记忆损害，其机制很可能是Ｆ⁃肌动蛋白聚合下降抑制突触重塑，导致突触体和神经元转运上膜的ＡＭＰＡ受体表达下降，使神经元活动降低；而使用Ｆ⁃肌动蛋白聚合诱导剂Ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ后可促进Ｆ⁃肌动蛋白聚合，促进树突棘重塑，增加突触体和神经元转运上膜的ＡＭＰＡ受体表达，增强神经元活动，进而改善场景性恐惧记忆㊂然而，本研究主要通过使用Ｆ⁃肌动蛋白聚合诱导剂ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ后促进ＰＮＤ小鼠海马内Ｆ⁃肌动蛋白聚合，改善以上损害；而并未进一步使用Ｆ⁃肌动蛋白解聚剂ｌａｔｒｕｎｃｕｌｉｎ来验证或模拟ＰＮＤ小鼠海马内Ｆ－肌动蛋白解聚引起的一系列神经损害㊂我们将针对以上不足展开后续研究，更加深入探讨Ｆ⁃肌动蛋白聚合和解聚在ＰＮＤ中的作用及机制㊂综上所述，海马Ｆ⁃肌动蛋白聚合下降可能参与ＰＮＤ的发病，而侧脑室注射Ｆ⁃肌动蛋白聚合诱导剂Ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ可改善ＰＮＤ老年小鼠的海马依赖性联想恐惧记忆，其机制可能与Ｆ⁃肌动蛋白聚合增加促进树突棘重塑和ＡＭＰＡ受体转运上膜，增加神经元活动有关㊂参考文献［１］㊀ＦｕｋａｚａｗａＹ，ＳａｉｔｏｈＹ，ＯｚａｗａＦ，ｅｔａｌ．ＨｉｐｐｏｃａｍｐａｌＬＴＰｉｓａｃ⁃ｃｏｍｐａｎｉｅｄｂｙｅｎｈａｎｃｅｄＦ⁃ａｃｔｉｎｃｏｎｔｅｎｔｗｉｔｈｉｎｔｈｅｄｅｎｄｒｉｔｉｃｓｐｉｎｅｔｈａｔｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｌａｔｅＬＴＰｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅｉｎｖｉｖｏ．Ｎｅｕｒｏｎ，２００３，３８（３）：４４７⁃４６０．［２］㊀ＫｏｍｍａｄｄｉＲＰ，ＤａｓＤ，ＫａｒｕｎａｋａｒａｎＳ，ｅｔａｌ．ＡβｍｅｄｉａｔｅｓＦ⁃ａｃ⁃ｔｉｎｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙｉｎｄｅｎｄｒｉｔｉｃｓｐｉｎｅｓｌｅａｄｉｎｇｔｏｃｏｇｎｉｔｉｖｅｄｅｆｉｃｉｔｓｉｎＡｌｚｈｅｉｍｅｒ ｓｄｉｓｅａｓｅ．ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ，２０１８，３８（５）：１０８５⁃１０９９．［３］㊀滕培兰，贾敏，李斌，等．海马ＲｈｏＡ⁃ＲＯＣＫ２通路在老年小鼠术后认知功能障碍中的作用．临床麻醉学杂志，２０１８，３４（６）：５７４⁃５７８．［４］㊀唐小慧，宗曼曼，唐会，等．术后认知功能障碍老年小鼠海马内ＮｏｇｏＡ⁃ＮｇＲ１通路的变化．临床麻醉学杂志，２０１７，３３（５）：４７８⁃４８２．［５］㊀ＥｆｉｍｏｖａＮ，ＫｏｒｏｂｏｖａＦ，ＳｔａｎｋｅｗｉｃｈＭＣ，ｅｔａｌ．βＩＩＩｓｐｅｃｔｒｉｎｉｓｎｅｃｅｓｓａｒｙｆｏｒｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｏｎｓｔｒｉｃｔｅｄｎｅｃｋｏｆｄｅｎｄｒｉｔｉｃｓｐｉｎｅｓａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｓｙｎａｐｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｎｅｕｒｏｎｓ．ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ，２０１７，３７（２７）：６４４２⁃６４５９．［６］㊀ＲａｄｌｅｒＭＲ，ＳｕｂｅｒＡ，ＳｐｉｌｉｏｔｉｓＥＴ．Ｓｐａｔｉａｌｃｏｎｔｒｏｌｏｆｍｅｍｂｒａｎｅｔｒａｆｆｉｃｉｎｎｅｕｒｏｎａｌｄｅｎｄｒｉｔｅｓ．ＭｏｌＣｅｌｌＮｅｕｒｏｓｃｉ，２０２０，１０５：１０３４９２．［７］㊀ＨａｒｒｉｓＫＭ．ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＬＴＰ：ｆｒｏｍｓｙｎａｐｔｏｇｅｎｅｓｉｓｔｏｒｅｇｕｌａｔｅｄｓｙｎ⁃ａｐｓｅｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔａｎｄｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ．ＣｕｒｒＯｐｉｎＮｅｕｒｏｂｉｏｌ，２０２０，６３：１８９⁃１９７．［８］㊀ＬｉｓｍａｎＪ，ＣｏｏｐｅｒＫ，ＳｅｈｇａｌＭ，ｅｔａｌ．Ｍｅｍｏｒｙｆｏｒｍａｔｉｏｎｄｅｐｅｎｄｓｏｎｂｏｔｈｓｙｎａｐｓｅ⁃ｓｐｅｃｉｆｉｃｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｓｙｎａｐｔｉｃｓｔｒｅｎｇｔｈａｎｄｃｅｌｌ⁃ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｎｃｒｅａｓｅｓｉｎｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ．ＮａｔＮｅｕｒｏｓｃｉ，２０１８，２１（３）：３０９⁃３１４．［９］㊀ＮａｋａｈａｔａＹ，ＹａｓｕｄａＲ．Ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙｏｆｓｐｉｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：ｌｏｃａｌｓｉｇｎａ⁃ｌｉｎｇ，ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｎｄｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．ＦｒｏｎｔＳｙｎａｐｔｉｃＮｅｕｒｏｓｃｉ，２０１８，１０：２９．［１０］㊀ＰｉｎｈｏＪ，ＭａｒｃｕｔＣ，ＦｏｎｓｅｃａＲ．Ａｃｔｉｎｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ，ｔｈｅｓｙｎａｐｔｉｃｔａｇａｎｄｔｈｅｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅｏｆｓｙｎａｐｔｉｃｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ．ＩＵＢＭＢＬｉｆｅ，２０２０，７２（４）：５７７⁃５８９．［１１］㊀ＧｕＪ，ＬｅｅＣＷ，ＦａｎＹ，ｅｔａｌ．ＡＤＦ／ｃｏｆｉｌｉｎ⁃ｍｅｄｉａｔｅｄａｃｔｉｎｄｙ⁃ｎａｍｉｃｓｒｅｇｕｌａｔｅＡＭＰＡｒｅｃｅｐｔｏｒｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇｄｕｒｉｎｇｓｙｎａｐｔｉｃｐｌａｓ⁃ｔｉｃｉｔｙ．ＮａｔＮｅｕｒｏｓｃｉ，２０１０，１３（１０）：１２０８⁃１２１５．［１２］㊀ＢｕｏｎａｒａｔｉＯＲ，ＨａｍｍｅｓＥＡ，ＷａｔｓｏｎＪＦ，ｅｔａｌ．ＭｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＡＭＰＡ⁃ｔｙｐｅｇｌｕｔａｍａｔｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｎｄｔｈｅｉｒｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｌｏｎｇ⁃ｔｅｒｍｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ．ＳｃｉＳｉｇｎａｌ，２０１９，１２（５６２）：ｅａａｒｂ８８９．［１３］㊀ＣｈｉｄａｍｂａｒａｍＳＢ，ＲａｔｈｉｐｒｉｙａＡＧ，ＢｏｌｌａＳＲ，ｅｔａｌ．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｓｐ⁃ｉｎｅｓ：ｒｅｖｉｓｉｔｉｎｇｔｈｅｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｏｌｅ．ＰｒｏｇＮｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌＢｉｏｌＰｓｙｃｈｉａｔｒｙ，２０１９，９２：１６１⁃１９３．［１４］㊀ＧｒａｈａｍＨＤｉｅｒｉｎｇ，ＲｉｃｈａｒｄＬＨｕｇａｎｉｒ．ＴｈｅＡＭＰＡＲｅｃｅｐｔｏｒＣｏｄｅｏｆＳｙｎａｐｔｉｃＰｌａｓｔｉｃｉｔｙ．Ｎｅｕｒｏｎ，２０１８，１００（２）：３１４⁃３２９．［１５］㊀ＨａｎＹ，ＬｕｏＹ，ＳｕｎＪ，ｅｔａｌ．ＡＭＰＫｓｉｇｎａｌｉｎｇｉｎｔｈｅｄｏｒｓａｌｈｉｐｐｏ⁃ｃａｍｐｕｓｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｒｅｇｕｌａｔｅｓｃｏｎｔｅｘｔｕａｌｆｅａｒｍｅｍｏｒｙｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２０１６，４１（７）：１８４９⁃１８６４．［１６］㊀ＭｉｔｓｕｓｈｉｍａＤ，ＩｓｈｉｈａｒａＫ，ＳａｎｏＡ，ｅｔａｌ．Ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌｌｅａｒｎｉｎｇｒｅ⁃ｑｕｉｒｅｓｓｙｎａｐｔｉｃＡＭＰＡｒｅｃｅｐｔｏｒｄｅｌｉｖｅｒｙｉｎｔｈｅｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２０１１，１０８（３０）：１２５０３⁃１２５０８．［１７］㊀ＲｕｓｈＴ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ⁃ＨｅｒｎａｎｄｅｚＪ，ＤｏｌｌｍｅｙｅｒＭ，ｅｔａｌ．Ｓｙｎａｐｔｏｔｏｘ⁃ｉｃｉｔｙｉｎＡｌｚｈｅｉｍｅｒ ｓｄｉｓｅａｓｅｉｎｖｏｌｖｅｄａｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆａｃｔｉｎｃｙ⁃ｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎｄｙｎａｍｉｃｓｔｈｒｏｕｇｈｃｏｆｉｌｉｎ１ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ，２０１８，３８（４８）：１０３４９⁃１０３６１．［１８］㊀ＭａｌｉｎｏｗＲ，ＭａｌｅｎｋａＲＣ．ＡＭＰＡｒｅｃｅｐｔｏｒｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇａｎｄｓｙｎａｐｔｉｃｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ．ＡｎｎｕＲｅｖＮｅｕｒｏｓｃｉ，２００２，２５：１０３⁃１２６．［１９］㊀ＰａｒｋＭ．ＡＭＰＡｒｅｃｅｐｔｏｒｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇｆｏｒｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃＰｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ．ＦｒｏｎｔＣｅｌｌＮｅｕｒｏｓｃｉ，２０１８，１２：３６１．（收稿日期：２０２００５１２）。
小鼠脑缺血神经功能障碍行为学评价的研究进展高志, 赵海苹, 罗玉敏, 吉训明1（首都医科大学宣武医院，脑血管病研究室，北京100053）【摘要】在脑缺血及脑缺血-再灌注损伤的研究中，小鼠的可逆性大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型应用广泛。
除了测量脑梗死体积外，神经功能缺损的行为学评价也是判定脑缺血严重程度的重要指标。
其评价指标大多移植于大鼠的评价体系，方法较多，没有统一的评价标准，本文对小鼠脑缺血后神经功能损伤的行为学评价方法及各自的优缺点及侧重点做一综述。
【关键词】脑缺血；小鼠；行为学评价The Behavioral Testing in Mice After cerebral ischemiaGAO Zhi, ZHAO Hai-ping, LUO Yu-min, JI Xunming1（Cerebrovascular Diseases Research Institute, Xuanwu Hospital, Capital Medical University,Beijing 100053, China）【Abstract】The mouse model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) is applied in the research of cerebral ischemia and reperfusion widely. In addition to measuring infarction volume, behavioral evaluation of functional neurological deficit is also an important indicator in estimating the severity of stroke. Existing tests are mostly transplanted from rat evaluation system. There are many different tests being used, and no unified standard. This review describes the advantage and disadvantage of most commonly used behavior tests in mouse model of ischemia.【Key words】Cerebral ischemia；mice；behavior test缺血性脑卒中是一种高发病率、高致残率及高致死率的疾病。
在脑缺血及脑缺血-再灌注损伤的研究中，最常使用大鼠或者小鼠的可逆性大脑中动脉阻塞[基金项目]国家自然科学基金(81201028, 81071058, 30770743)。
[作者简介]高志(1986-)，男，硕士生。
主要研究方向：脑卒中机制，E-mail: gaozhi1008@。
[通讯作者]吉训明，E-mail: jixm@。
（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。
由于小鼠的基因型与人类更相似[1]，因此小鼠MCAO模型在研究脑缺血及再灌注损伤病理生理变化及基因表达方面有着更大的优势[2]。
脑梗死体积与神经功能缺损的行为学评价是判定脑缺血严重程度的重要指标，许多研究报告对大鼠的行为学评价进行了阐述[3, 4]，而对小鼠的研究较少，其评价指标大多移植于大鼠的评价体系，至今为止，还没有对这一系列的综合性评价达成共识，不仅有许多不同的测试在使用，而且所应用测试的数量和频率也没有统一的标准。
本文对小鼠脑缺血神经功能损伤评价方法包括感觉功能、运动功能、学习能力以及综合性评价做一综述。
1 感觉功能评价小鼠MCAO模型中，感觉功能的缺失是对其神经功能判定的一个可靠的指标[5]。
目前最常用的是墙角试验（Corner test），最先由Schallert等[6]提出，后经Zhang 等[7]改良，具体操作是将两个尺寸为30 cm × 20 cm × 1 cm的纸板呈30°夹角放置，将小鼠置于夹角之间，进入夹角深部，双侧的触须受到刺激后会站立并转身面向夹角的开口端。
正常小鼠从右面或左面转身的概率基本相等，而一侧脑损伤小鼠会优先向脑损伤侧转身。
墙角试验可以准侧检测出感觉功能障碍，甚至90天后的轻度局灶性脑缺血，特别是在纹状体发生缺血时。
此实验简单易行，应用广泛，但Li等[8]认为墙角试验对感觉功能恢复程度的检测不敏感，可能是因为这项试验是对感觉和运动功能的综合评价，需要两种功能都较好的恢复后才能检测出来，而且不能准确反映单侧肢体的运动功能变化。
粘签试验（Sticky dot test）又称感觉不对称试验，用来确定皮肤敏感性和感觉功能的整合性。
试验表明当缺血发生在大脑皮层的感觉区、皮质脊髓束和纹状体时，感觉功能发生明显缺失。
具体方法是将直径5 mm的圆形背胶标签贴附在小鼠相对无毛的手腕处，当回到饲养笼时，一个正常的小鼠会用牙齿迅速除掉每个圆形标签，而发生脑缺血的小鼠首先除掉附着在正常前肢的标签，然后是病变的一侧，并需要花费更多的时间，缺血性病变导致了感觉功能的不对称性[9]。
此外，时间的延迟还表明运动功能的缺失，嘴和前肢运动障碍导致去除粘性标签相对困难。
后续的测试可以通过逐步增加患侧所粘标签的大小并减小健侧的标签大小，直到患侧肢体所受的的刺激变得比健侧的更突出，小鼠就开始首先从患侧的肢体消除刺激[10]。
该方法主要用于对多种病因导致的前肢感觉、皮质运动区损伤后的功能评价，与人类顶叶受损后对侧肢体的忽视症状类似。
圆筒试验（Cylinder test）又称肢体不对称使用试验，最早应用于大鼠的行为学评价[9]，Kadam等[11]通过改良用来评估小鼠前肢使用和旋转的对称性，当小鼠一侧的感觉皮层、皮质脊髓束、纹状体受到缺血损害时前肢的使用发生不对称性，进一步观察会发现离散运动障碍和协调运动也相继发生[12]。
具体操作是将小鼠放置在一个直径9 cm，高度15 cm的透明圆桶内。
当小鼠后腿站立时，分别记录最初左前肢、右前肢及两侧前肢同时碰触筒壁的次数。
当一侧前肢（如右侧）碰触筒壁后，另一侧前肢（左侧）在右侧未移开时也碰触到了筒壁，记录一次右侧和一次同时碰触。
当两侧前肢交替碰触筒壁时，记录为同时碰触，共进行20次重复试验。
最终得分=（右前肢的运动- 左前肢运动）/（右前肢运动左前肢运动运动）×100%。
得分越高说明两侧肢体的不对称程度越明显。
这种评分方法即使对于没有经验的评价者也有较高的可信度。
2 运动功能评价运动功能的不协调性和伴随出现的的代偿反应是人类中风的突出特点。
大部分脑缺血的动物模型都会在行走、转弯和游泳等运动中出现相应的功能障碍。
Whishaw等[13]在1986年建立了一种大鼠以前肢通过窄缝抓取食物的评价方法，称为伸爪试验（Skilled reaching test）。
该方法可评价单侧肢体的运动功能，区分肢体损伤与修复的细小差别[14]，还可以用来评估感觉运动皮层和皮质脊髓束的功能缺失[15, 16]，对小鼠同样适用。
伸爪实验盒用透明玻璃制成，长宽高分别为20 cm，6 cm和20 cm，在盒的前壁正中央开一条宽度为0.5 cm狭长的缝隙，缝隙底部前壁的外侧有放置食物片的凹槽，迫使小鼠从缝隙处伸出患侧前肢抓取食物。
正常小鼠可从缝隙处伸出前肢，抓取并吃到凹槽内的食物；而脑缺血后的动物不能完成。
伸爪实验可较稳定的反映脑缺血慢性损伤变化，对动物伸爪、抓食及吃食过程可作细致的轨迹分析，进而发现更多的变化特征[17]。
烟囱试验（Chimney test）最早由Boissier等提出，后经Heinecke等[18]改良，具体发方法是在一根长25 cm，直径30 mm的透明玻璃管的20 cm处作一个记号，水平放置，将小鼠放置于入口处，当其爬至管底时，将玻璃管垂直放置，使其头朝下，正常状态下小鼠会通过快速反应学会倒着走路，到达标记处所需的时间最长不会超过120秒，而发生脑缺血后所用时间会明显延长，此实验常用来测试小鼠的运动协调性。
立柱试验（Vertical pole test）主要对前肢的力量，抓握能力和平衡性进行评估[19]。
由Paylor等[20]提出并改进了评分方法，将一根长15英寸、直径0.75英寸的木棍用胶带缠绕，以增加摩擦力，水平放置后将小鼠放在木棍中央，将木棍慢慢抬起直至与地面垂直，记录小鼠在木棍上的时间，评分标准为：0分，在木棍垂直之前已掉落；1分，时间<20秒；2分，20秒<时间<40秒之间；3分，40秒<时间<60秒；4分，>60秒。
Hernandez等[21]提出的前肢踩空试验（Foot-fault test）也可用于前肢运动功能的评价，将小鼠放置在不同尺寸的6边行的铁丝网上，小鼠在铁丝上行走，在此过程中会出现踩空或踩滑现象，记录前肢总共行走的次数以及踩空的次数，踩空的次数越多表明小鼠脑损伤越大。
爬板试验（Climbing board test）[22]是将小鼠置于一块包有铜丝网的有机玻璃平板上，先保持平板在水平位置，后逐渐将平板竖起，至小鼠不能攀爬而从平板上落下，记录此时平板轴线与水平面之间的角度，即爬板角度，重复三次取平均值。
爬板试验用于评价整体协调功能，也是一种简便且可定量的指标，但是，该指标变化的恢复较快，仅能用于3天内的急性功能损伤。
为了提高神经功能行为评价的准确性及可信度，近年来各种发明及改良的装置、软件层出不穷。
旋转加速试验（Accelerated rotarod test）首先用于研究神经系统功能的运作，后来才在脑损伤如脑缺血的研究中广泛应用[23]，主要用来评估脑缺血动物运动的平衡和协调能力。
Ahmad等[24]在研究中将其称为“旋转跑步机测试”，动物放置在直径3cm的圆形转盘的中央，转盘与一个可调节速度的转轴连接，实验开始后转轴在1分钟内从0加速到24转，记录小鼠在圆盘上的时间，最大分值为60，脑缺血的严重程度与得分成反比。
为了排除试验中可能出现的偶然情况，每只动物可做三次测试，取平均值作为最终得分。
此法操作简单，可行性大，且灵敏度较高。
旷场试验（Open field）需要一旷场实验敞箱的装置[25]，木质，周壁及底面涂黑，底面由面积相等（10cm×10cm）的方格组成，将小鼠放入旷场正中格，用摄像系统记录动物5min的行为变化，包括水平运动、垂直运动及粪便粒数，数据用相应的统计软件分析。
该试验不仅可以用来评价小鼠的运动功能，也可用粪便粒数反应动物的焦虑状态[26]。
