农药登记毒理学细菌回复突变1 范围GB/T 15670的本部分规定了细菌回复突变试验的基本原则、方法和要求。
本部分适用于为农药登记而进行的细菌回复突变试验。
2 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。
2.1回复突变试验reverse mutation test利用一组鼠伤寒沙门氏菌和/或大肠杆菌检测引起细菌碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的需要某种氨基酸的菌株（分别为组氨酸或色氨酸）成为不需要外源性供应氨基酸的菌株的突变，即是由营养缺陷型回变到野生型。
2.2碱基置换型致突变物base pair substitution mutagens引起DNA分子中一个或多个碱基对置换的物质。
在回复突变试验，此改变可能发生在细菌基因组的原突变部位或另一个部位。
2.3移码型致突变物frameshift mutagens引起DNA分子增加或丢失一个或多个碱基对的物质。
3 试验目的检测受试物的诱变性，预测其遗传危害和潜在致癌作用的可能性。
4 试验概述细菌回复突变试验利用鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌来检测点突变，涉及DNA的一个或几个碱基对的置换、插入或缺失。
原理是通过观察试验菌株在缺乏所需要氨基酸的培养基上的生长情况，检测试验菌株是否恢复合成必需氨基酸的能力，评价受试物诱发突变的能力。
5 培养基和试剂注：培养基成分或试剂至少应是化学纯，无诱变性。
避免重复高温处理，选择适当保存温度和期限，如肉汤保存于4℃不超过6个月，其他详见下述各培养基及溶液说明。
5.1 营养肉汤培养基牛肉浸膏 5 g氯化钠 5 g胰胨10 g磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O） 2.6 g加蒸馏水至1000 mL加热溶解，调节pH至7.4，分装后0.103 Mpa，20 min灭菌，保存期不超过6个月。
5.2 营养肉汤琼脂培养基琼脂粉 1.5 g加营养肉汤培养基至100 mL加热溶解，调节pH至7.4，0.103 Mpa，20 min灭菌。
5.3 底层培养基（即最低营养培养基）5.3.1 Vogel-Bonner（V-B）培养基柠檬酸（C6H8O7·H2O） 2.0 g磷酸氢二钾（K2HPO4）10.0 g磷酸氢铵钠（NaNH4HPO4·4H2O） 3.5 g硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.2 g加蒸馏水至200 mL逐个将化学物在少量蒸馏水中单独溶解后，硫酸镁水溶液在最后缓慢加入，加蒸馏水至200 mL。
0.103 MPa，20 min灭菌，4℃保存备用。
5.3.2 20%葡萄糖溶液葡萄糖20.0 g加蒸馏水至100 mL，0.055 MPa，20 min灭菌。
5.3.3 1.5%底层琼脂培养基琼脂粉15 g加蒸馏水至700 mLV-B培养基200 mL20%葡萄糖溶液100 mL配制：首先将前两种成分于0.103 MPa下高压灭菌20 min后，再加入后两种成分，充分混匀倒底层平板。
按每皿25 mL（相对于90 mm平皿）制备平板，冷凝固化后倒置于37℃培养箱中24 h，备用。
5.4 顶层培养基5.4.1 顶层琼脂琼脂粉 3.0 g氯化钠 2.5 g加蒸馏水至500 mL0.103 MPa，20 min高压灭菌。
5.4.2 0.5 mmol/L组氨酸-生物素溶液D-生物素（分子量244）12.2 mgL-组氨酸（分子量155）7.8 mg[或L-盐酸组氨酸（分子量192）9.6 mg]加蒸馏水至100 mL，贮于4℃冰箱中。
5.4.3 顶层培养基制备加热融化顶层琼脂，临用时每100 mL顶层琼脂中加10 mL 0.5 mmol/L组氨酸-生物素溶液（大肠杆菌则需配制0.5 mmol/L色氨酸-组氨酸-生物素溶液），分装在三角烧瓶中，0.103 MPa，20 min灭菌。
用时融化分装小试管，每管2 mL，在45℃水浴中保温。
5.5 S9辅助因子（混合液试剂）的配制5.5.1 盐溶液[1.65 mol/L氯化钾（KCl）+0.4 mol/L氯化镁（MgCl2）]氯化钾（KCl） 6.15 g氯化镁（MgCl2·6H2O） 4.07 g蒸馏水50 mL0.103 MPa，20 min高压灭菌或滤菌。
5.5.2 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）磷酸氢二钠（Na2HPO4）（14.2 g/500 mL）440 mL磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O）（13.8 g/500 mL）60 mL0.103 MPa，20 min高压灭菌或滤菌。
5.5.3 辅酶-II（氧化型）溶液准确称取辅酶-II，用无菌蒸馏水溶解配制成0.025 mol/L溶液，低温保存（-20℃以下）。
5.5.4 葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液称取葡萄糖-6-磷酸钠盐，用无菌蒸馏水溶解配制成0.05 mol/L，低温保存（-20℃以下）。
5.6 10% S9混合液配制每10 mL由以下成分组成，临用时配制。
磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH7.4） 6.0 mLMgCl2-KCl盐溶液0.2 mL葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液（0.05 mol/L）1.0 mL辅酶-II溶液（0.025 mol/L） 1.6 mL肝S9 1.0 mL无菌蒸馏水0.2 mL混匀，置冰浴中待用。
5.7 活化系统（大鼠肝S9）的诱导和制备选健康雄性成年SD大鼠或Wistar大鼠，体重200 g左右。
将多氯联苯（Aroclor1254或国产PCB-五氯）溶于玉米油中，按500 mg/kg体重一次腹腔注射，5 d后处死动物，处死前12 h禁食，但可自由饮水。
苯巴比妥钠和β-萘黄酮结合也可做为诱导剂，健康雄性大鼠体重200 g左右，经口或腹腔注射80 mg/kg体重苯巴比妥钠和80 mg/kg体重β-萘黄酮，连续3 d。
处死前16 h停止饮食，但可自由饮水。
由于化学物质经腹腔注射，容易引起肝脏形成外膜，不易剥离，推荐使用经口灌胃的方式。
处死动物后取出肝脏称重，用新鲜冰浴的0.15 mol/L氯化钾溶液连续冲洗肝脏数次，以去除抑制微粒体酶活性的血红蛋白。
每克肝（湿重）加0.15 mol/L氯化钾溶液3 mL，连同烧杯移入冰浴中，用消毒剪刀剪碎肝脏，在玻璃匀浆器（低于4000 r/min，往复1 min～2 min）或组织匀浆器（20000 r/min，1 min）中制成肝匀浆。
以上操作需注意无菌和局部冷环境。
将制成的肝匀浆在低温（0℃～4℃）高速离心机上，以9000 g离心10 min，吸出上清液为S9组分，分装于无菌冷冻管或安瓿中，每安瓿2 mL左右，最好用液氮或干冰速冻后置-80℃低温保存。
上述全部操作均在冰水浴中和无菌条件下进行。
制备肝S9所用一切手术器械、器皿等，均经灭菌消毒。
S9制备后，其活力需经诊断性诱变剂进行鉴定。
S9制成后，经无菌检查，蛋白含量测定（Lowry法），每毫升蛋白含量应不超过40 mg，因过量蛋白将会抑制回复突变率，并经间接致癌物（诱变剂）鉴定其生物活性合格后贮存于深低温或冰冻干燥，保存期不超过一年。
5.8 特殊试剂和培养基的配制5.8.1 氨苄青霉素溶液（8 mg/mL）：称取三羟氨苄青霉素80 mg，加入0.02 mol/L氢氧化钠溶液10 mL，无菌配制，保存于4℃冰箱。
5.8.2 0.1%结晶紫溶液：称取结晶紫10 mg，加10 mL无菌水。
5.8.3 四环素溶液（8 mg/mL）：称取四环素40 mg，加入0.02 mol/L盐酸溶液5 mL，保存于4℃冰箱，用于四环素抗性试验和氨苄青霉素-四环素平板。
5.8.4 L-组氨酸溶液和0.5 mmol/L D-生物素溶液：称取L-组氨酸404.3 mg和D-生物素12.2 mg，分别溶于100 mL蒸馏水，0.103 Mpa，20 min灭菌，保存于4℃冰箱。
5.8.5 氨苄青霉素平板（用作TA97、TA98、TA100菌株的主平板）和氨苄青霉素-四环素平板（用作TA102菌株的主平板），每1000 mL由以下成分组成：底层培养基980 mL组氨酸水溶液10 mL0.5 mmol/L生物素 6 mL0.8%氨苄青霉素溶液 3.15 mL0.8%四环素溶液0.25 mL四环素仅在使用对四环素有抗性的TA102时加入。
以上成分均已分别灭菌或无菌制备。
5.8.6 组氨酸-生物素平板（组氨酸试验用），每1000 mL由以下成分组成：底层培养基984 mL组氨酸水溶液10 mL0.5 mmol/L生物素 6 mL以上成分均已分别灭菌。
5.8.7 二甲基亚砜（DMSO）：0.103 Mpa，20 min灭菌。
6 菌株及其鉴定与保存6.1 试验菌株6.1.1 推荐使用鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA97、TA98、TA100、TA102作为四株标准测试菌株。
TA97和TA98可以检测各种移码型致突变物；TA100可检测碱基置换型致突变物；TA102能检测出其他测试菌株不能检出或极少检出的某些诱变剂，如甲醛、各种过氧化氢化合物和丝裂霉素C等交联剂。
一般用来测试受试物诱变性时，应通过上述四个菌株的检测。
必要时可增加TA1535、TA1537、TA97a、大肠杆菌WP2uvrA或大肠杆菌WP2uvrA（PKM101）任一菌株。
试验菌株的基因型和检测类型见附录A.1。
6.1.2 也可采用下列的菌株组合：鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535，其中TA97可用TA97a或TA1537替换，TA102可用大肠杆菌WP2uvrA（PKM101）或WP2uvrA替换。
6.2 菌株的鉴定6.2.1 应进行菌株鉴定的情况菌株特性应符合细菌回复突变试验的要求，见附录A.2。
突变型菌株的某些特性易丢失或变异，遇到下列情况应鉴定菌株的基因型：a)在收到培养菌株后；b)当制备一套新的冷冻保存株或冷冻干燥菌株时；c)当每皿自发回变数不在正常范围时；d)当对标准诱变剂丧失敏感性时；e)初次投入使用前。
6.2.2 增菌培养在营养肉汤培养基中接种贮存菌株培养物，于37℃振荡（100次/min）培养10 h或静置培养16 h备用。
6.2.3 组氨酸缺陷型和色氨酸缺陷型的鉴定6.2.3.1 加热融化底层培养基两瓶（一瓶不加组氨酸，一瓶加组氨酸），不加组氨酸者每100 mL培养基中加0.5 mmol/L D-生物素0.6 mL；加组氨酸者每100 mL培养基中加入L-组氨酸（每100 mL中含404.3 mg）1 mL和0.5 mmol/L D-生物素0.6 mL，冷却至50℃左右，各倒两个平皿。
6.2.3.2 接种：取有组氨酸和无组氨酸培养基各一皿，按菌株号顺序各取一白金耳菌液划线（直线），接种在培养基表面，37℃培养48 h。
6.2.3.3 结果：所有菌株（TA97、TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535、TA1537）在有组氨酸培养基平皿表面各长出一条菌膜，无组氨酸培养基上除自发回变菌落外无菌膜，说明受试菌株确为组氨酸缺陷型。
