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致突变试验：根据受试物的化学结构、理化性质及对遗传物质作用终点（基因突变和染色体畸变）的不同。
要求新药必须做下列三项试验。
（１）微生物回复突变试验菌株：组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌（Ｓｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）四株（ＴＡ９７、ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１０２），亦可采用大肠杆菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＷＰ２若干株（大肠杆菌试验）。
剂量：决定受试物最高剂量的标准是细菌毒性和溶解度。
一般最大剂量可达５ｍｇ／皿。
受试物至少应有五种不同剂量否则应说明选定剂量的理由。
代谢活化：应用诱导剂处理后的哺乳动物肝脏微粒体酶（Ｓ９）进行体外代谢活化试验，即在加Ｓ９混合物和不加Ｓ９混合物平行的条件下测试。
对照组：用溶媒作阴性对照，用已知突变原作阳性对照。
结果判定：受试物的回复突变菌落数的增加与剂量相关并有统计学意义，或至少某一测试点呈现可重复的并有统计学意义的阳性反应时记为阳性。
（２）哺乳动物培养细胞染色体畸变试验细胞：哺乳动物原代或传代培养细胞。
剂量：至少应用三种不同剂量，高剂量以５０％细胞生长抑制浓度为基准，否则应说明选定剂量的理由。
标本制作时间：药物与细胞接触后应有适当时间最好包括整个细胞周期，通常在药物处理后２４和４８小时制作染色体标本。
代谢活化：应用适当的代谢活化法。
对照组：用溶媒作阴性对照，已知突变原作阳性对照。
镜检：每种浓度至少观察１００个中期分裂相细胞的染色体结构的异常及多倍体的出现率。
结果判定：受试物诱发的染色体畸变的出现率较阴性对照有统计学意义的增加，并有剂量反应关系时记为阳性，同时标明异常细胞出现的频度和种类。
（３）体内试验一般选用微核试验，但作用于生殖系统的药物进行显性致死试验等。
ａ．啮齿类动物微核试验动物：一般用小鼠，每组１０只性成熟动物（雌雄各半）或至少６只性成熟雄性动物。
给药剂量及途径：至少采用三种剂量，最高剂量从１／２ＬＤ５０为基准，腹腔和／或口服一次给药，必要时可连续给药。
否则应说明选定剂量的理由。
细菌回复突变试验目的和原理
目的：
细菌回复突变试验旨在研究细菌在不同环境条件下的突变现象，以及突变对细菌生存和适应能力的影响。
通过该实验，我们可以更好地了解细菌的遗传变异机制，揭示突变对细菌进化和抗药性的重要作用，为抗菌药物研发和感染疾病治疗提供理论依据。
原理：
细菌回复突变试验是基于细菌的遗传可变性原理进行的。
细菌具有高度的遗传可变性，这是由于细菌的DNA复制过程中容易发生突变。
在实验中，我们通过给予细菌一定的诱变剂（如紫外线辐射或化学物质），诱发细菌的DNA发生突变。
随后，我们将突变后的细菌分成不同的组，分别培养在不同环境条件下。
这些环境条件可以是高温、低温、高盐、低氧等。
通过对各组细菌生长情况的观察和比较，我们可以发现突变对细菌生存和适应能力的影响。
在实验过程中，我们还可以进一步提取突变菌株的DNA，通过测序技术确定其突变位点和突变类型。
这有助于我们深入研究细菌的遗传变异机制，以及突变对细菌代谢途径、信号传导等方面的影响。
通过细菌回复突变试验，我们可以揭示细菌的遗传可变性和适应性演化的机制，为抗菌药物研发和感染疾病治疗提供理论指导。
此外，
该试验还为研究细菌的进化机制、环境适应性等方面提供了重要的实验手段和依据。
总结：
细菌回复突变试验通过诱发细菌的DNA突变，研究突变对细菌生存和适应能力的影响，以及突变的遗传机制。
该实验为我们深入了解细菌的遗传可变性和适应性演化提供了重要手段，对抗菌药物研发和感染疾病治疗具有重要意义。
通过这一实验，我们可以更好地理解细菌的进化机制，为解决抗菌药物耐药性和感染疾病的挑战提供理论指导。
oecd化学品测试准则,第4部分,细菌回复突变试验”1. 引言1.1 概述在化学品安全评估领域，确保人类和环境的健康至关重要。
为了评估化学品对生物体的影响，国际上采用了一系列的标准测试方法来确定其毒性和潜在风险。
其中，OECD（经济合作与发展组织）化学品测试准则是行业内广泛认可的标准之一。
1.2 目的本文的目的是详细介绍OECD化学品测试准则中第4部分的内容，即"细菌回复突变试验"。
通过这个试验方法，我们可以评估化学品对细菌群体的遗传突变能力，从而判断潜在的基因毒性。
1.3 重要性基因突变是化学物质对生物体产生毒性作用的主要机制之一，也是判断其潜在危害程度的关键指标。
通过该试验可以获得有关某种特定化学物质与细菌反应后引起遗传突变的信息，进而为该化学物质是否具有潜在致癌性等基因毒性提供判断依据。
此外，在法律法规和标准制定方面，这一试验方法也被广泛应用，以确保化学品的合规性及人类和环境的安全。
综上所述，本文将深入探讨OECD化学品测试准则第4部分中的"细菌回复突变试验"，包括其原理、实施方式与条件、评价标准以及应用范围与限制。
希望通过该文的阐述，读者能够更全面地了解和认识这一重要试验方法，并对化学品的基因毒性评估有更深入的认识和理解。
2. oecd化学品测试准则概述2.1 什么是oecd化学品测试准则oecd化学品测试准则是指由经济合作与发展组织（OECD）制定的规定化学品评估和测试方法的指导原则和标准。
这些准则旨在提供全球范围内评估化学品在环境和人体健康方面的潜在风险所需的科学数据，并确保这些数据具有可比性和可靠性。
2.2 oecd的背景与目标经济合作与发展组织（OECD）是一个由36个成员国组成的国际组织，致力于推动经济增长、就业、社会发展和环境可持续性。
oecd的目标之一是促进在成员国之间协调安全、健康和环境方面相关政策的制定。
对于化学品风险评估和测试方法，oecd通过制定统一的准则来实现这一目标。
471 472 细菌回复突变试验（Bacterial Reverse Mutation Test）1受试物必备受试物的化学鉴定纯度（杂质）溶解特性pH（必要时）稳定性（包括受试物在赋形剂中的稳定性）熔点／沸点2 试验目的2.1目的和意义细菌回复突变试验利用鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌需要某种氨基酸的菌株来检测点突变，涉及DNA的一个或几个碱基对的置换，插入或缺失。
此试验的原理是检测试验菌株已存在突变的回复，细菌恢复合成必需氨基酸的能力。
通过在缺乏受试菌株所需氨基酸的培养基上的生长来检测回复突变的细菌。
点突变是很多人类遗传病的原因，有很多证据表明在人类和试验动物肿瘤形成涉及体细胞癌基因和肿瘤抑制基因的点突变。
细菌回复突变试验是快速的、费用较低和较易进行的试验。
试验菌株具有一些使其对检测突变更为敏感的特征，如回复突变部位的反应性DNA 序列，增强细菌对大分子的通透性，DNA修复系统缺失或DNA易误修复过程增强。
试验菌株的特异性可为诱发突变的种类提供某些有用的信息。
2.2定义回复突变试验（reverse mutation test）：利用鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌检测需要某种氨基酸的菌株（分别为组氨酸或色氨酸）成为不需要外源性供应氨基酸的菌株的突变。
碱基置换型致突变物（base pair substitution mutagens）：引起DNA中碱基改变的因子。
在回复突变试验此改变可能发生在细菌基因组的原突变部位或另一个部位。
移码型致突变物（frameshift mutagens）：引起DNA中一个或多个碱基对增加或缺失，故改变RNA的读码框。
3测试原理细菌回复突变试验是利用原核生物（细菌）作指示生物的体外遗传毒理学试验，遗传学终点为基因突变。
（1）在有或无外源性代谢活化系统条件下，细菌悬浮液暴露于受试物。
在平板掺入法，细菌悬浮液与顶层琼脂混合，再立即铺至最低培养基上。
在预保温法，处理混合物经预保温后，与顶层琼脂混合，再立即铺至最低培养基上。
埃姆斯试验[编辑]
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埃姆斯试验（英语：Ames test，又称为细菌回复突变试验或安氏突变试验）为美国人布鲁斯·埃姆斯博士于1983年所提出的突变物测试方法。
此法检测出175已知之致癌物，并发现其中有超过90%者皆显示为阳性(具突变性)，因此，埃姆斯试验也被做为先期测试方法之一。
而现在正以埃姆斯试验为模式系统，进行各式化学物可能的毒性及致突变性之安全评估，但仍需其它的测试辅助测试而进一步确认。
试验特点及方法[编辑]
埃姆斯试验具简易、快速、经济等特点，此方法目前被广泛的使用在突变物之测试。
此法将经逆转菌种(revertant)之沙门氏菌暴露于待测物中；由于此逆转菌种(revertant)无法存活于缺乏组氨酸之培养液中。
将逆转菌培养于含待测物但无组氨酸试液中，该菌却能利用培养液中葡萄糖合成组氨酸而存活并生长出菌落时，表示该带测物具有基因突变之作用，而能将逆转菌回复为原菌种。
细菌回复突变试验的原理“细菌回复突变试验”是一种常用的实验方法，主要用来研究细菌的基因突变和遗传特性。
这种方法的原理主要是利用细菌在恶劣环境下突变产生的抗性和适应性来进行研究和寻找新的治疗方法。
下面我们来分步骤介绍细菌回复突变试验的原理。
第一步：选取适宜的细菌在进行细菌回复突变试验时，首先需要挑选一种适合的细菌。
比如，对于革兰氏阳性细菌（如金黄色葡萄球菌）而言，其表面覆盖有较厚的多糖、多肽层，这种层可阻挡许多从外部进入的化合物、物质等。
因而，要用某些能穿透这层屏障的化合物及药物，以确定其是否能够刺激革兰氏阳性细菌的突变。
不同种类的细菌对不同物质的反应和敏感度也不尽相同，在实验前需要对细菌种类进行严格筛选和检测。
第二步：制造突变株在毒性或恶劣环境下，细菌可能会出现基因变异，从而产生适应性。
比如，细菌在感受到某些特定的讯息（如耐盐、耐药性）时，就可能对抗这些讯息并产生变异获得更好的适应性。
因此，在实验中，研究者会使细菌在高浓度药物或高温等环境下进行繁殖，从而制造出具有突变基因的细菌株。
第三步：筛选突变株制作突变株后，需要将其进行筛选，以挑选具有理想特性的突变株。
这通常需要对突变株进行一定的筛选和筛查。
比如利用药物抗性、生长速度和代谢等特性进行筛选，以得到具有良好繁殖性和抵抗力的突变细菌。
第四步：鉴定变异位点通过突变细菌的扩散和筛选，可以得到具有特定基因变异的细菌。
随后研究者可以使用基因测序技术，进行变异位点的鉴定和确认。
同时，也可以通过比较突变株和野生株之间的生物学和生化特性等方面进行分析和比对，从而得到突变基因的相关信息。
通过以上几个步骤，就可以成功进行细菌回复突变试验。
通过这种方法，研究者可以深入了解细菌的基因和生物学特性，进而为疾病治疗和预防提供一定的科学基础和参考依据。
同时，该方法也在一定程度上促进了细菌学和基因工程等相关领域的研究发展。
rgd测试标准-回复什么是rgd测试标准？RGD（Reverse Genetic Design）测试标准是基因编辑技术中的一种重要方法，用于评估基因编辑所引起的细胞、组织和整个生物体中的突变效果。
该标准通过对编辑后的基因组进行系统性的分析和比较，以确定编辑结果的稳定性、有效性和安全性。
在RGD测试中，主要有以下几个步骤：步骤一：设计基因编辑试验在进行RGD测试之前，首先要设计和选择适当的基因编辑方法。
常用的编辑技术包括CRISPR/Cas9系统、TALENs（转录活性核酸酶效子）和ZFNs（锌指核酸酶）。
根据目标基因的特征和研究目的，确定编辑方法和修饰策略。
步骤二：细胞培养和基因编辑选择合适的细胞系或模式生物进行基因编辑试验。
细胞系通常是体外培养的动植物细胞，模式生物可以是小鼠、斑马鱼等。
将编辑工具导入细胞或生物体内，使其与目标DNA序列互作，引发基因组的突变和修饰。
步骤三：筛选编辑细胞/生物编辑后的细胞/生物需要经过筛选，以确定哪些个体或群体具有预期的基因修饰效果。
通常可利用荧光素酶染色或PCR检测方法等进行筛选，选择具有修饰效果的细胞或个体进行后续分析。
步骤四：分析编辑效果对编辑后的细胞/生物进行全面的分析，以评估编辑效果和突变稳定性。
这些分析可能包括基因测序、蛋白质表达检测、表型分析和细胞/生物体功能检测等。
通过这些分析，可以了解编辑引起的突变类型、突变频率和对细胞/生物体的影响程度。
步骤五：验证和验证结果验证编辑效果和突变位点的可靠性和准确性。
这可以通过再次进行基因测序、PCR扩增和测序、Southern blot等方法来完成。
与编辑前的基因组进行比较和分析，验证编辑是否达到预期的目标，并排除任何误操作或非特异性突变。
步骤六：评估安全性和稳定性最后一步是评估编辑结果的安全性和稳定性。
这包括评估编辑细胞/生物的生存能力、繁殖能力、发育和生长状态等。
还需要评估基因编辑引起的潜在副作用和不良影响，例如突变导致的细胞功能改变、生物适应性下降等。
大肠杆菌回复突变试验Escherichia coli Reverse Mutation Assay1 范围本规范规定了大肠杆菌回复突变试验的基本原理、要求和方法。
本规范适用于检测化学品的遗传毒性。
2 规范性引用文件OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No.472,1983)USEPA OPPTS Health Effects Test Guidelines (Series 870.5100 June 1996)3 试验目的检测化学物质的诱变性，预测其遗传危害和潜在致癌作用的可能性。
4 定义回复突变（Reverse Mutation）：细菌在化学突变物质作用下由营养缺陷型回变到野生型这一过程。
5 试验基本原理大肠杆菌色氨酸和乳糖营养缺陷型突变株（Trp-/Lac-）在低限营养培养基上，利用补充微量色氨酸或乳糖和硫胺素后长成很薄尚可见的菌苔。
经诱变剂处理，色氨酸及硫胺素耗尽后发生回复性突变，即回复突变为野生型（Trp+/Lac+）菌落，能继续生长，穿破菌苔，增殖成明显可见的菌落。
6 试验方法6.1 受试样品配制用水、二甲基亚砜(DMSO)、乙醇或氯仿等做溶剂。
乙醇和DMSO至少应在培养基、水或0.1mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）中稀释20倍（≤5%,V/V）。
氯仿只在点试验中用作溶剂。
将一定量溶液加在纸片上，使氯仿挥发后才可放到试验用的平板上。
所有的受试样品在未配成溶液时，均应放于4℃冰箱。
先用最适溶剂配成贮存液。
贮液应在溶解度许可下做成最高浓度，并置低温冰箱避光保存。
用于平板掺入法时，应对受试样品进行毒性预测试。
根据需要可做成几个不同浓度的稀释样品。
对于化学性质不稳定的受试样品应在每次试验时新鲜配制。
6.2 剂量设计测定受试样品的毒性或有效浓度的预备试验方法：取2×108细菌／ml的生长培养物，在生长培养基中稀释，制成107细菌/ml的稀释菌液约30ml，分装在8支试管中，第1管4ml 其余每管3ml。
附件8《细菌回复突变试验技术指导原则（征求意见稿）》起草说明为规范开展化妆品和化妆品新原料的安全评价工作，保障消费者用妆安全，促进化妆品行业高质量发展，指导注册人、备案人开展化妆品以及化妆品新原料的研究，根据《化妆品监督管理条例》《化妆品注册备案管理办法》《化妆品注册备案资料管理规定》《化妆品新原料注册备案资料管理规定》及相关法律法规、强制性国家标准和技术规范的要求，中国食品药品检定研究院（以下简称中检院）组织起草了《细菌回复突变试验技术指导原则（征求意见稿）》（以下简称《技术指导原则（征求意见稿）》）。
现将起草的有关情况说明如下：一、起草的必要性2021年5月1日，《化妆品监督管理条例》和相关配套法规已正式施行。
《化妆品注册备案资料管理规定》《化妆品注册和备案检验工作规范》规定“细菌回复突变试验”为防脱发类和染发类特殊化妆品的一项注册检验项目；《化妆品新原料注册备案资料管理规定》中关于新原料是否具有致突变性评价时可应用该项试验进行检测或评估；另外,化妆品安全评估报告中，关于化妆品原料致突变性的评估也通常采用该项试验的数据作为原料评估的证据。
在对该项试验的检验报告或毒理学试验资料进行审评时，发现存在试验中受试物最高浓度设置错误或试验结果判定不合理等情况。
因此，中检院制定《技术指导原则》（征求意见稿），以规范应用细菌回复突变试验评价化妆品和新原料的致突变性。
二、制定原则（一）依法依规原则。
《技术指导原则（征求意见稿）》遵循依法依规原则，贯彻落实《化妆品监督管理条例》及配套法规文件中关于化妆品和新原料的法规要求，研究细菌回复突变试验的具体要求，切实为化妆品和新原料的安全评价提供技术指导，也为技术审评以及监管提供依据。
（二）公开透明原则。
《技术指导原则（征求意见稿）》起草过程中，坚持“公开透明、广泛参与”原则，充分参考国内外相关法规和技术标准，积极征求监管部门、专家、行业协会意见，同时根据意见反馈情况科学合理地进行修改完善。
鼠伤寒沙门氏菌／回复突变试验Salmonella Typhimurium / Reverse Mutation Assay1 范围本规范确定了鼠伤寒沙门氏菌／回复突变试验的基本原则、要求和方法。
本规范适用于化妆品原料及其产品的基因突变检测。
2 规范性引用文件OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No.471,Adopted:21,July 1997)。
3 定义3.1回复突变（Reverse mutation）细菌在化学致突变物作用下由营养缺陷型回变到原养型(prototroph)。
3.2基因突变（Gene mutation）在化学致突变物作用下细胞DNA中碱基对的排列顺序发生变化。
3.3碱基置换突变（Base substitution mutation）引起DNA链上一个或几个碱基对的置换。
碱基置换有转换(transition)和颠换(transversion)两种形式。
转换是DNA链上的一个嘧啶被另一嘧啶所替代，或一个嘌呤被另一嘌呤所代替。
颠换是DNA链上的一个嘧啶被另一嘌呤所替代，或一个嘌呤被另一嘧啶所代替。
3.4 移码突变（Frameshift mutation）引起DNA链上增加或缺失一个或多个碱基对。
3.5 鼠伤寒沙门氏菌/回复突变试验（Salmonella typhimurium/reverse mutation assay）利用一组鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型试验菌株测定引起沙门氏菌碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的组氨酸缺陷型(his-)→原养型(his+)回复突变的试验方法。
3.6 S9经多氯联苯(PCB混合物)或苯巴比妥钠和β-萘黄酮结合诱导的大鼠制备肝匀浆，在9000g 下离心10min后的肝匀浆上清液。
4 原理鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长。
假如有致突变物存在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型，因而能生长形成菌落，据此判断受试物是否为致突变物。
第四节化学致突变物的检测一、致突变试验(一) 基因突变试验1.鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验又称Ames试验，检测受试物诱发鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株(his-)回复突变成野生型(his+)的能力。
试验菌株都有组氨酸突变(his-)，不能自行合成组氨酸，在不含组氨酸的最低营养平皿上不能生长，回复突变成野生型后能自行合成组氨酸，可在最低营养平皿上生长成可见菌落。
计数最低营养平皿上的回变菌落数来判定受试物是否有致突变性。
标准试验菌株有四种：TA97和TA98检测移码突变、TA100检测硷基置换突变、TA102对醛、过氧化物及DNA交联剂较敏感。
这四个试验菌株除了含有his-突变，还有一些附加突变，以提高敏感性。
试验方法有点试验(预试验)和掺入试验(标准试验)两种。
在掺入试验中，受试物最高剂量为5mg/皿或出现毒性及沉降的剂量，至少有五个剂量点，并有阴性(溶剂)对照和阳性对照。
将受试物、试验菌株培养物和S9混合液加到顶层培养基中，混匀后铺在最低营养平皿上，37℃培养48小时，计数可见菌落数。
判断阳性结果的标准是，如每皿回变菌落数为阴性对照的每皿回变菌落数的两倍以上，并有剂量－反应关系，即认为此受试物为鼠伤寒沙门氏菌的致突变物。
S9混合液是用多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆9000Xg上清液(S9)加上NADP及葡萄糖－6－磷酸等辅助因子，作为代谢活化系统。
如不加S9混合液得到阳性结果，说明受试物是直接致突变物；加S9混合液才得到阳性结果，说明该受试物是间接致突变物。
只要在一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物；仅当四种试验菌株均得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物。
2.哺乳动物细胞基因突变试验哺乳动物体外培养细胞的基因正向突变试验常用的测试系统有小鼠淋巴瘤L5178Y细胞，中国仓鼠肺V79细胞和卵巢CHO细胞的三个基因位点的突变，即次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)、胸苷激酶(TK)及Na+／K+ATP酶(OUA)位点。
(AMES)细菌回复突变试验中采用的基本菌株——上海宝录在(AMES)细菌回复突变试验中至少应采用5种菌株，包括用于检测组氨酸靶基因中鸟嘌呤-胞嘧啶（G-C）位点碱基置换或移码突变的4种鼠伤寒沙门氏菌（TA1535；TA1537/TA97/ TA97a；TA98和TA100），以及用于检测组氨酸或色氨酸基因中腺嘌呤-胸腺嘧啶（A-T）位点碱基置换或移码突变的鼠伤寒沙门氏菌TA102或埃希氏大肠杆菌WP2 uvrA（注释1）。
由于检测G-C位点突变的4种菌株无法检测交联剂，因此检测交联剂时最好采用TA102菌株或增加埃希氏大肠杆菌WP2 uvrA，要注意这类化合物在检测染色体损伤的试验中可被检测出。
因此，推荐的标准菌株组合如下（除特殊注明外，均为鼠伤寒沙门氏菌）：1．TA982．TA1003．TA15354．TA1537或TA97或TA97a（注释2）5．TA102或埃希氏大肠杆菌WP2 uvrA或埃希氏大肠杆菌WP2 uvrA（pKM101）。
注释1：有将A-T靶位点突变的菌株包括在测试组合中检测一些遗传毒性致癌剂的相关文献报道（如Levin等，1983；Wilcox等，1990）。
日本劳务省对5525种化合物的数据库进行分析（以及由各个制药公司对较小的数据库进行分析）的结果表明，约7.5%的细菌诱变剂是由大肠杆菌WP2 uvrA而非4种鼠伤寒沙门菌株标准组合检出。
尽管尚未获得这些化合物对动物致癌性的资料，但很可能它们具有与诱导鼠伤寒沙门菌株标准组合变化的诱变剂同样的潜在致癌性。
注释2：TA1537、TA97和TA97a均含有胞嘧啶的重复序列，其位于相应的组氨酸靶位点内的突变敏感部位，它们对导致这些移码热点中碱基缺失的移码诱变剂的敏感性相似，因此该三种菌株可相互代替。
细菌回复突变试验报告
检验受理编号：第页/ 共页
样品中文名称检验开始日期
检验项目细菌回复突变试验检验完成日期
一、材料和方法
1. 试验菌株：
2. 代谢物活化系统：
3. 阳性物：名称，批号，生产厂家，溶剂，浓度及用量。
4. 受试物：物态，溶剂、溶解度、配制方法，前处理（灭菌）方法。
剂量设计及最高剂量设计依据：提供最低抑菌浓度或最大溶解度的预试验数据。
5. 试验方法：简述操作步骤，除受试物剂量分组外，还应说明空白对照、溶剂对照和阳性对照，阳性结果判断标准。
二、试验结果：以列表方式报告试验结果，参见下表。
Ames试验菌株回变菌落数（平均值±标准差）
组别
剂量
(mg/皿）
TA97或
TA97a或
TA1537
TA98 TA100
TA102或
WP2uvrA或
WP2uvrA
（pKM101）
TA1535 ＋S9－S9＋S9－S9＋S9－S9＋S9－S9＋S9－S9
空白对照
溶剂对照
阳性对照
受试物
三、试验结论
细菌回复突变试验试验结果：
（本页以下空白）。
农药登记毒理学细菌回复突变范围GB/T 15670的本部分规定了细菌回复突变试验的基本原则、方法和要求。
本部分适用于为农药登记而进行的细菌回复突变试验。
2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。
2.1回复突变试验reverse mutation test利用一组鼠伤寒沙门氏菌和/或大肠杆菌检测引起细菌碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的需要某种氨基酸的菌株（分别为组氨酸或色氨酸）成为不需要外源性供应氨基酸的菌株的突变，即是由营养缺陷型回变到野生型。
2.2碱基置换型致突变物base pair substitution mutagens引起DNA分子中一个或多个碱基对置换的物质。
在回复突变试验，此改变可能发生在细菌基因组的原突变部位或另一个部位。
2.3移码型致突变物frameshift mutagens引起DNA分子增加或丢失一个或多个碱基对的物质。
3试验目的检测受试物的诱变性，预测其遗传危害和潜在致癌作用的可能性。
4试验概述细菌回复突变试验利用鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌来检测点突变，涉及DNA的一个或几个碱基对的置换、插入或缺失。
原理是通过观察试验菌株在缺乏所需要氨基酸的培养基上的生长情况，检测试验菌株是否恢复合成必需氨基酸的能力，评价受试物诱发突变的能力。
5培养基和试剂注：培养基成分或试剂至少应是化学纯，无诱变性。
避免重复高温处理，选择适当保存温度和期限，如肉汤保存于4℃不超过6个月，其他详见下述各培养基及溶液说明。
5.1营养肉汤培养基牛肉浸膏5g氯化钠 5 g胰胨10 g磷酸氢二钾(K2HPO4-3H2O) 2.6 g加蒸馏水至1000 mL加热溶解，调节pH至7.4,分装后0.103 Mpa, 20 min灭菌，保存期不超过6个月。
5.2营养肉汤琼脂培养基琼脂粉 1.5 g加营养肉汤培养基至100 mL加热溶解，调节pH至7.4，0.103 Mpa，20 min灭菌。
5.3底层培养基(即最低营养培养基)5.3.1Vogel-Bonner (V-B)培养基柠檬酸(C6H8O7-H2O) 2.0 g磷酸氢二钾(K2HpO4) 10.0 g磷酸氢铵钠(NaNH4HPO4-4H2O) 3.5 g硫酸镁(MgSO4-7H2O) 0.2 g加蒸馏水至200 mL逐个将化学物在少量蒸馏水中单独溶解后，硫酸镁水溶液在最后缓慢加入，加蒸馏水至200 mL。
功能互补突变体基因回复突变体
功能互补突变体指的是不同基因突变所产生的不同功能互补的
变异体，而基因回复突变体则是指在突变后恢复了原有基因的表达和功能的变异体。
这两种变异体都是基因组研究中常见的现象。
对于功能互补突变体，研究人员可以通过将两个不同的突变体进行交叉杂交，得到具有双重突变的变异体。
这些变异体可能会出现新的表型特征，这有助于我们更好地理解基因的功能和调控机制。
相比之下，基因回复突变体的发现更加困难，通常需要通过大量筛选和鉴定才能发现。
不过，一旦发现了这种变异体，就能够更加深入地研究基因的表达和功能调控机制。
研究功能互补突变体和基因回复突变体对于理解基因组的功能
和调控机制非常重要，可以为生物技术和医学研究提供有价值的参考。
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附件9细菌回复突变试验Bacterial Reverse Mutation Assay1 范围本规范确定了细菌回复突变试验的基本原则、要求和方法。
本规范适用于化妆品原料及其产品的基因突变检测。
2 定义2.1 回复突变 reverse mutation细菌在化学致突变物作用下由营养缺陷型回变到原养型(prototroph)。
2.2 基因突变 gene mutation在化学致突变物作用下细胞DNA中碱基对的排列顺序发生变化。
2.3 碱基置换突变 base substitution mutation引起DNA链上一个或几个碱基对的置换。
碱基置换有转换(transition)和颠换(transversion)两种形式。
转换是DNA链上的一个嘧啶被另一嘧啶所替代，或一个嘌呤被另一嘌呤所代替。
颠换是DNA链上的一个嘧啶被另一嘌呤所替代，或一个嘌呤被另一嘧啶所代替。
2.4 移码突变 frameshift mutation引起DNA链上增加或缺失一个或多个碱基对。
2.5 细菌回复突变试验bacterial reverse mutation assay利用一组组氨酸或者色氨酸缺陷型试验菌株测定引起细菌碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的氨基酸缺陷型→原养型回复突变的试验方法。
2.6 S9经多氯联苯(PCB混合物)或苯巴比妥钠和β-萘黄酮结合诱导的大鼠制备肝匀浆，在9000g下离心10min后的肝匀浆上清液。
3 原理鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长；大肠杆菌色氨酸营养缺陷型菌株不能合成色氨酸，故在缺乏色氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长。
假如有致突变物存在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型，因而能生长形成菌落，据此判断受试物是否为致突变物。
某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变，故需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备的S9混合液。
4 仪器和设备培养箱、恒温水浴、振荡水浴摇床、压力蒸汽消毒器、干热烤箱、低温冰箱（－80℃）或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、混匀振荡器、匀浆器、菌落计数器、低温高速离心机，玻璃器皿、生物安全柜等。
鼠伤寒沙门氏菌／回复突变试验Salmonella Typhimurium / Reverse Mutation Assay1 范围本规范确定了鼠伤寒沙门氏菌／回复突变试验的基本原则、要求和方法。
本规范适用于化妆品原料及其产品的基因突变检测。
2 规范性引用文件OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No.471,Adopted:21,July 1997)。
3 定义3.1回复突变（Reverse mutation）细菌在化学致突变物作用下由营养缺陷型回变到原养型(prototroph)。
3.2基因突变（Gene mutation）在化学致突变物作用下细胞DNA中碱基对的排列顺序发生变化。
3.3碱基置换突变（Base substitution mutation）引起DNA链上一个或几个碱基对的置换。
碱基置换有转换(transition)和颠换(transversion)两种形式。
转换是DNA链上的一个嘧啶被另一嘧啶所替代，或一个嘌呤被另一嘌呤所代替。
颠换是DNA链上的一个嘧啶被另一嘌呤所替代，或一个嘌呤被另一嘧啶所代替。
3.4 移码突变（Frameshift mutation）引起DNA链上增加或缺失一个或多个碱基对。
3.5 鼠伤寒沙门氏菌/回复突变试验（Salmonella typhimurium/reverse mutation assay）利用一组鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型试验菌株测定引起沙门氏菌碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的组氨酸缺陷型(his-)→原养型(his+)回复突变的试验方法。
3.6 S9经多氯联苯(PCB混合物)或苯巴比妥钠和β-萘黄酮结合诱导的大鼠制备肝匀浆，在9000g 下离心10min后的肝匀浆上清液。
4 原理鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长。
假如有致突变物存在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型，因而能生长形成菌落，据此判断受试物是否为致突变物。
某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变，故需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备的S9混合液。
5 仪器和设备培养箱、恒温水浴、振荡水浴摇床、压力蒸汽消毒器、干热烤箱、低温冰箱(-80℃) 或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、混匀振荡器、匀浆器、菌落计数器、低温高速离心机，玻璃器皿等。
6 培养基和试剂6.1 0.5mmol/L组氨酸-0.5mmol/L生物素溶液成分：L-组氨酸(MW 155) 78mgD-生物素(MW 244) 122mg加蒸馏水至1000mL 配制：将上述成分加热，以溶解生物素，然后在0.068MPa下高压灭菌20min。
贮于4℃冰箱。
6.2 顶层琼脂培养基成分：琼脂粉 1.2g氯化钠 1.0g加蒸馏水至200mL 配制：上述成分混合后，于0.103MPa下高压灭菌30min。
实验时，加入0.5mmol/L组氨酸—0.5mmol/L生物素溶液20mL。
6.3 V ogel-Bonner (V-B) 培养基E成分：枸椽酸(C6H8O7·H2O) 100g磷酸氢二钾(K2HPO4) 500g磷酸氢铵钠(NaNH4HPO4·4H2O) 175g硫酸镁(MgSO4·7H2O) 10g加蒸馏水至1000mL 配制：先将前三种成分加热溶解后，再将溶解的硫酸镁缓缓倒入容量瓶中，加蒸馏水至1000mL。
于0.103MPa下高压灭菌30min。
储于4℃冰箱。
6.4 20%葡萄糖溶液成分：葡萄糖200g加蒸馏水至1000mL 配制：加少量蒸馏水加温溶解葡萄糖，再加蒸馏水至1000mL。
于0.068MPa下高压灭菌20min。
储于4℃冰箱。
6.5 底层琼脂培养基成分：琼脂粉7.5g蒸馏水480mLV-B培养基E 10mL20%葡萄糖溶液10mL 配制：首先将前两种成分于0.103MPa下高压灭菌30min后，再加入后两种成分，充分混匀倒底层平板。
按每皿25mL制备平板，冷凝固化后倒置于37℃培养箱中24h，备用。
6.6 营养肉汤培养基成分：牛肉膏 2.5g胰胨 5.0g磷酸氢二钾(K2HPO4) 1.0g加蒸馏水至500mL 配制：将上述成分混合后，于0.103MPa下高压灭菌30min。
储于4℃冰箱。
6.7 盐溶液(1.65mol/L KCl+0.4mol/L MgCl2)成分：氯化钾(KCl) 61.5g氯化镁(MgCl2·6H2O) 40.7g加蒸馏水至500mL配制：在水中溶解上述成分后，于0.103MPa下高压灭菌30min。
储于4℃冰箱。
6.8 0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)成分：磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O) 2.965g磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 29.015g加蒸馏水至500mL 配制：溶解上述成分后，于0.103MPa下高压灭菌30min。
储于4℃冰箱。
6.9 S9混合液成分每毫升S9混合液肝S9 100μl盐溶液20μl灭菌蒸馏水380μl0.2mol/L磷酸盐缓冲液500μl辅酶II(NADP) 4μmol6-磷酸葡萄糖(G-6-P) 5μmol配制：将辅酶II和6-磷酸葡萄糖置于灭菌三角瓶内称重，然后按上述相反的次序加入各种成分，使肝S9加到已有缓冲液的溶液中。
该混合液必须临用现配，并保存于冰水浴中。
实验结束，剩余S9混合液应该丢弃。
6.10菌株鉴定用和特殊用途试剂6.10.1组氨酸—生物素平板成分：琼脂粉15g蒸馏水944mL(V-B)培养基E 20mL20%葡萄糖20mL灭菌盐酸组氨酸水溶液(0.5g/100mL) 10mL灭菌0.5mmol/L生物素溶液6mL 配制：高压灭菌琼脂和水后，将灭菌20%葡萄糖，V-B培养基和组氨酸溶液加进热的琼脂溶液中。
待溶液稍为冷却后，加入灭菌生物素，混匀，浇制平板。
6.10.2 氨苄青霉素平板和氨苄青霉素/四环素平板成分：琼脂粉15g蒸馏水940mL(V-B)盐溶液20mL20%葡萄糖20mL灭菌盐酸组氨酸溶液（0.5g/100mL）10mL灭菌0.5mmol/L生物素溶液6mL氨苄青霉素溶液(8mg/mL于0.02mol/LNaOH中) 3.15mL四环素溶液(8mg/mL于0.02mol/L HCl中) 0.25mL 配制：琼脂和水高压灭菌20min，将无菌的葡萄糖、VB盐溶液和组氨酸—生物素溶液加进热的溶液中去，混匀。
冷却至大约50℃，无菌条件下加入四环素溶液和/或氨苄青霉素溶液。
应该在倾注琼脂平板后几天内，制备主平板。
6.10.3 营养琼脂平板成份：琼脂粉7.5g营养肉汤培养基500mL配制：于0.103MPa下高压灭菌30min后倾注平板。
7 试验菌株及其生物学特性鉴定7.1 试验菌株采用TA97、TA98、TA100和TA102一组标准测试菌株。
7.2生物学特性鉴定新获得的或长期保存的菌种，在试验前必须进行菌株的生物特性鉴定。
菌株鉴定的判断标准，如表1所示。
表1 试验菌株鉴定的判断标准7.2.1组氨酸缺陷原理：组氨酸缺陷型试验菌株本身不能合成组氨酸，只能在补充组氨酸的培养基上生长，而在缺乏组氨酸的培养基上，则不能生长。
鉴定方法：将测试菌株增菌液分别于含组氨酸培养基平板和无组氨酸平板上划线，于37℃下培养24h后观察结果。
结果判断：组氨酸缺陷型菌株在含组氨酸平板上生长，而在无组氨酸平板上则不能生长。
7.2.2 脂多糖屏障缺损原理：具有深粗糙（rfa）的菌株，其表面一层脂多糖屏障缺损，因此一些大分子物质如结晶紫能穿透菌膜进入菌体，从而抑制其生长，而野生型菌株则不受其影响。
鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL于营养琼脂平板上划线，然后将浸湿的0.1%结晶紫溶液滤纸条与划线处交叉放置。
37℃下培养24h后观察结果。
结果判断：假若待测菌在滤纸条与划线交叉处出现一透明菌带，说明该待测菌株具有rfa 突变。
7.2.3 氨苄青霉素抗性原理：含R因子的试验菌株对氨苄青霉素有抗性。
因为R因子不太稳定，容易丢失，故用氨苄青霉素确定该质粒存在与否。
鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL，在氨苄青霉素平板上划线，37℃下培养24h后观察结果。
结果判断；假若测试菌在氨苄青霉素平板上生长，说明该测试菌具有抗氨苄青霉素作用，表示含R因子，否则，表示测试菌不含R因子或R因子丢失。
7.2.4 紫外线敏感性原理：具有△uvrB突变的菌株对紫外线敏感，当受到紫外线照射后，不能生长，而具有野生型切除修复酶的菌株，则能照常生长。
鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL于营养琼脂平板上划线，用黑纸盖住平板的一半，置紫外灯下照射（15W，距离33cm）8秒钟。
置37℃下孵育24h后观察结果。
结果判断：具有△uvrB突变的菌株对紫外线敏感，经辐射后细菌不生长，而具有完整的切除修复系统的菌株，则照常生长。
7.2.5 四环素抗性原理：具有pAQI的菌株对四环素有抗性。
鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL于氨苄青霉素/四环素平板上划线，置37℃下孵育24h后观察结果。
结果判断：假若测试菌照常在氨苄青霉素/四环素平板上生长，表明该测试菌株对氨苄青霉素和四环素两者有抗性，具有pAQI质粒，否则，说明测试菌株不含pAQI质粒。
7.2.6 自发回变原理：每种试验菌株都以一定的频率自发地产生回变，称为自发回变。
这种自发回变是每种试验菌株的一项特性。
鉴定方法：将待测菌株增菌液0.1mL加到2mL含组氨酸—生物素的顶层琼脂培养基的试管内，混匀后铺到于底层琼脂平板上，待琼脂固化后，置37℃培养箱中孵育48h后记数每皿回变菌落数。
结果判断：每种标准测试菌株的自发回变菌落数应符合表1要求。
经体外代谢活化后的自发回变菌落数，要比直接作用下的略高。
7.2.7 回变特性—诊断性试验原理：每种试验菌株对诊断性诱变剂回变作用的性质以及S9混合液的效应不一。
鉴定方法：按照平板掺入试验的操作步骤进行。
将受试物换成诊断性诱变剂。
结果判断：标准菌株对某些诊断性诱变剂特有的回变结果参见表2。
表2 测试菌株的回变性诱变剂剂量( g) S9TA97 TA98 TA100 TA102柔毛霉素叠氮化钠ICR—191链霉黑素丝裂霉素C2,4,7-三硝基-9-芴酮4-硝基-O-次苯二胺4-硝基喹啉-N-氧化物甲基磺酸甲酯2-氨基芴苯并（a）芘6.01.51.00.250.50.20200.51.0101.0---------++124761640inhinh8377216052817417423373123363inhinh82441599292236194143473000185inhinh40079842202730302693759218822302772162876586261255注：inh表示抑菌。
