各种培养基的配置及注意事1

各种培养基的配置及注意事项6-BA配置：配置时要加入少量稀酸或97%酒精，再加入蒸馏水，可适当加热。

IBA配置：配置时要加入少量稀碱，再加入蒸馏水。

注意：配这两种溶液时，若直接加蒸馏水，则不溶。

（注：溶解生长素时，可用少量0.5~1N 的NaOH或95%酒精溶解；溶解分裂素类用0.5~1N的HCl加热溶解，如再加蒸馏水，易产生白色沉淀，此时再加热水。

）MS固体培养基：以配1LMS固体培养基为准：MS固体干粉41.5g蒸馏水1L2g/l的6-BA 2.5ml2g/l的IBA 0.25ml注意：待溶液配好后，用pH计将溶液的pH值调到5.8~ 6.0，煮沸至均匀无沉淀后，分装20小瓶（即50mL/瓶），灭菌之前盖子不要拧太紧，出锅后再拧紧盖子。

MS液体培养基：以配1LMS液体培养基为准：母液1①5ml母液1② 10ml母液1③ 5ml母液2 1ml母液3 5ml母液4 1ml2g/l的6-BA 0.5ml2g/l的IBA 0.1ml蔗糖30g注意：待溶液在烧杯中混匀之后，转移到1000ml的容量瓶中定容。

LB液体培养基：以配1LLB液体培养基为准：蛋白胨（TRYPTONE）10g酵母提取液（YEASTExTrACT）5gNaCl 10g注意：粉末在烧杯中溶解完全之后，转移到1000ml的容量瓶中定容。

待灭菌结束后，温度降至55℃左右（不烫手）时，加入Kana(50mg/L)1000Ul(在超净台内进行)。

LB固体培养基：以配1LLB固体培养基为准：蛋白胨（TRYPTONE）10g酵母提取液（YEASTExTrACT）5gNaCl 10g琼脂粉15g注意：粉末在烧杯中溶解完全之后，转移到1000ml的容量瓶中定容。

待灭菌结束后，温度降至55℃左右（不烫手）时，加入Kana(50mg/L)1000Ul(在超净台内进行)。

在进行到平板。

组织培养体系的建立外植体获得具体操作：1．将外植体（用镊子）夹到其中一个空培养罐中2．倒入75%的酒精消毒30S，重复三次。

3．倒入升汞消毒4min，一次。

4．倒入蒸馏水清洗，重复三次。

5．盖上盖子，备用。

6．点燃酒精灯，在另一只空的培养罐中倒入些75%的酒精（用于铁制仪器消毒）。

7．将铁架子在酒精灯上进行消毒，镊子和手术刀浸入培养罐中，然后放在酒精灯上灼烧，起杀菌作用。

8．用镊子夹住一培养皿在酒精灯上稍微烫下，灭菌。

9．在培养皿中倒入少量的蒸馏水。

10．用经冷却的镊子将外植体夹到带少量蒸馏水的培养皿中，用刀切取其腋芽，将腋芽外的壳小心剥去，再在腋芽的尖端切一刀，使其暴露生长点。

11．打开培养基瓶子之前在酒精灯上稍微烫下，打开瓶盖后，瓶口在酒精灯上灼烧下，以防污染。

12．用镊子将腋芽植入培养基中，瓶口灼烧下，旋紧盖子。

注意：镊子和手术刀要经常灼烧，必要时可将镊子和刀柄进行高压灭菌，以防污染。

1)组织培养诱导芽再生具体操作：1.点燃酒精灯，从装有酒精的培养罐中拿出刀和镊子在酒精灯上灼烧。

2.用镊子夹住一培养皿在酒精灯上稍微烫下，灭菌。

3.待刀和镊子冷却后，从一培养瓶中取出芽丛放在准备好的培养皿上。

4.用刀切取其嫩芽，并把老芽切短。

5.将嫩芽植入培养基中，通常是每瓶培养瓶中接6颗老芽或7颗嫩芽。

注意点同上。

2)组织培养诱导根再生具体操作和注意点同上，不同是此过程只需要用到健壮的幼芽。

3)植物移栽、驯化具体操作：1.从瓶中取出竹苗，洗净培养基，2.寄栽于育苗箱的基质上(珍珠岩∶砂壤土=1∶1)，浇足定根水，定期喷洒营养液（MS培养液），3.用塑料膜调节温度、湿度和光照，4.统计成活率及竹苗生长状况，待新发健壮根系后移往大棚。

转基因体系的建立农杆菌培养具体操作：1.挑取携带植物表达载体质粒的农杆菌单菌落。

2.接种在50mg/LKana 的LB 液体培养基中，28℃，160rpm 振荡培养过夜。

3.活化过夜的农杆菌按1:50的比例接种在相同的LB液体培养基中。

4.继续培养至对数生长期至OD=0.3～0.6，测量时使用波长为600nm，准备感染用。

农杆菌浸染预培养材料具体操作：1.5000rpm离心20min，收集菌体。

2.用1/2MS液体培养基（含有50mg/L乙酰丁香酮）悬浮准备感染用。

3.将事先培养好的芦竹嫩芽浸入含有农杆菌菌液的液体MS液体培养基中。

4.感染20min～30min，取出芦竹嫩芽用无菌滤纸吸去附着的菌液。

共培养具体操作：将浸染过的芦竹嫩芽接种在含有50mg/L乙酰丁香酮（AS）的固体MS培养基上，进行共培养。

去除农杆菌具体操作：5.若干天后，将芦竹从培养基中取出放入无菌水中冲洗，直至无菌水澄清。

6.再将芦竹加到500mg/L羧苄青霉素（Carb）的液体MS培养基，洗5-10min。

7.取出芦竹嫩芽用无菌滤纸吸去附着的液体。

8.将芦竹接到500mg/L羧苄青霉素(Carb)和10mg/L潮霉素（Hygr）固体MS培养基上。

培养具体操作：1.数天后，将芦竹从500mg/L羧苄青霉素和10mg/L潮霉素固体MS培养中取出。

2.将其转接到只含有激素的固体MS培养基中中去。

选择具体操作：通过观察，选择出抗性芽。

根诱导及植株再生9.待培养筛选的抗性芽长至1～1.5cm 时。

10.切下并转入含有500mg/L羧苄青霉素和10mg/L潮霉素的生根培养基上诱导生根。

11.获得具有潮霉素素抗性的转基因植株。

鉴定PCR, Southern blot 分析基本按照Sam brook 等的方法。

植物DNA 经Eco R I 或H ind B am H I 酶切后, 在018% 琼脂糖凝胶上电泳过夜.电泳缓冲液为1×TA E。

DNA 片段分离开后通过毛细作用转移缓冲液为10×SSC。

Southern N分子杂交所用探针为H ind B am H I 酶切pROA 93 产生的1 kb 片段, 此片段为N PT基因的一段编码顺序。

生物鉴定将芦竹放入含有磷的水中通过鉴定水中磷含量的变化来测定芦竹的聚磷效果。

配置各种不同浓度培养基：注：表格中分别表示的是6-BA与IBA之间的比值，以及每一瓶（即每瓶40ml）培养基中所要加的激素的量。

羧苄青霉素（Carb）和潮霉素（Hygr）的配制：羧苄青霉素（Carb）的作用：杀菌，杀死植株体外的农杆菌。

潮霉素（Hygr）的作用：选择性，杀死体内没有农杆菌侵入的植株。

1.称取固体粉末。

2.可用蒸馏水配置。

3.定容。

4.在超净台内用滤膜过滤，并将其分装入EP管中，用封口膜封口，放于－20℃下冷藏，备用。

Kana的配置：卡那霉素的作用：筛选出抗性株。

1.先计算出所要配置的溶液浓度。

2.称好Kana，用蒸馏水溶解，然后定容。

3.在操净台上用滤膜过滤，并将其分装入EP管中并放于－20℃下冷藏。

乙酰丁香酮（AS）的配置：乙酰丁香酮的作用：加速农杆菌侵染植株。

1 称取固体粉末。

2 先用甲醇或二甲基亚砜溶解，后加蒸馏水配置。

3 定容。

4 在操净台上用滤膜过滤，并将其分装入EP管中并放于－20℃下冷藏。

注意：如果用甲醇配置时需加热。

加Kana的MS培养基配置方法：1.先配好培养基。

2.分装入培养瓶中，每个培养瓶中加40ml培养基。

3.培养基进行高压灭菌。

4.灭好菌后，等到温度降到50~60℃到操净台上加Kana。

5.事先算好每瓶所要加的抗生素的量。

6.在加抗生素的过程中，速度要快，防止培养基凝固而影响实验的结果。

关于PCR：1.引物（VP-6-F-1，VP-6-R-1）稀释于TE（10mMTris-HCl PH8.0，1mMEDTA）溶液中，并于－20℃储存。

2，PCR反应液配置：从冰上将以下各成分加入PCR反应管中模板DNA 1ulPrimer1（20um） 1ulPrimer2（20um） 1uldNTPs(10mMeach) 1ul10×Taq Buffer 5ulTaq DNA polymerase 1uldi H2O（无菌水）补充至50ul注意：⑴模板DNA分为1/1000,1/100大肠杆菌悬液以及空白对照；⑵dNTPs A、T、G、C各加10ul，再加入360uldi H2O；⑶反应管中溶液由多至少加入，TaqDNA polymerase最后加入。

3.手指轻弹反应管，使其混匀，简短离心，迅速放入PCR.4.PCR反应循环设置①T=94℃ 2min②30个循环T=94℃ 40ST=52℃ 1minT=72℃ 2.5min③T=72℃ 7min关于制胶和跑胶：5.制胶：琼脂糖1g溶于100ml水中，再加入100ulEB，融三次倒胶再加梳子。

6.跑胶：EB母液25mg/ml 放置于冰箱中储存液0.5mg/ml 需避光保存使用液0.5mg/ml 加入胶中使用7.跑电泳：电压120V。

电流自己调节，电流不断升高，知道设备部叫为止；若还不行则降低电压。

注意：制胶于跑胶半个小时前进行。

关于仪器使用PH计的使用方法：1.调试：打开开关，温度计测缓冲溶液的温度，按‘温度’按钮调节温度与温度计显示相同，先pH计放入定位缓冲液中，待读数稳定后，按定位键（pH灯光闪烁），调到6.86，按确定键，即可。

用蒸馏水清洗干净pH计，再将pH计放入斜率缓冲液中，待读数稳定后，按斜率键（pH灯），调到4.00，按确定键，调试完成。

2.使用：调试完成后，先用温度计测量待测溶液的温度，按温度键，调节温度至温度计显示的度数，按‘确定键’，用蒸馏水清洗pH计后，把pH计放入待测溶液中，调节pH到所需pH值，即可。

3.注意：使用前后都要用蒸馏水清洗pH计；不用时，要保持pH计笔头湿润，在笔套里放一定量的KCl外参比补充液。

分光光度计使用方法：（主要用于测量农杆菌液的OD值，使用波长为600nm）打开开关，转动波长转钮至所需波长，按MODE至T灯亮，按“0%T”，度数显示为000.0，放入待测溶液，盖盖，拉动拉环至参考溶液管，按“100%T”，度数显示为100.0，按MODE至ABS灯亮，拉动拉环至所测溶液管，此时显示度数即为溶液OD值。

摇床的使用方法：温度28摄氏度，转速160高压灭菌锅的使用方法：1.先加蒸馏到灭菌锅里，直至水位灯显示高水位。

2.再将要灭菌的东西放入灭菌锅中。

3.旋紧灭菌锅盖，打开放气气阀，关闭安全气阀。

4.调节灭菌温度为121℃，调节灭菌时间为25min。

5.其温度达到100℃以上，放气一段时间后，关闭放气气阀。

6.灭菌结束会有一次鸣叫提醒，但不用急着打开灭菌锅盖。

7.等温度降至90℃-100℃的时候，打开安全气阀放气，取出东西。