第四章：酶分子修饰

（6）分子结合修饰
定义 分子结合修饰：采用水溶性分子，与酶蛋白的侧 分子结合修饰：采用水溶性分子，与酶蛋白的侧 链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变， 从而改变酶的特性与功能的方法。 大分子结合修饰：对酶蛋白侧链基团的修饰反应 大分子结合修饰：对酶蛋白侧链基团的修饰反应 不仅可以使用小分子物质，也可使用大分子物质。 其中利用水溶性大分子与酶分子的侧链基团共价 结合，使酶分子的空间结构发生某些精细的改变， 从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结合 修饰法。
(1)肽链的水解引起酶活性中心的破坏，酶将丧失其 肽链的水解引起酶活性中心的破坏， 催化功能。 催化功能。 (2)肽链的一部分被水解后，仍然可以维持酶活性中 肽链的一部分被水解后， 心的空间构象， 心的空间构象，则酶的催化功能仍可以保持不变或 损失不多，但是其抗原性等特性将发生改变。 损失不多，但是其抗原性等特性将发生改变。这将 提高某些酶特别是药用酶的使用价值。 提高某些酶特别是药用酶的使用价值。 (3)肽链的一部分水解除去以后，有利于酶活性中心 肽链的一部分水解除去以后， 与底物的结合并且形成准确的催化部位， 与底物的结合并且形成准确的催化部位，则酶可显 示出其催化功能或使酶活性提高。 示出其催化功能或使酶活性提高。
+
O2N OOC S S NO2 COO
ENZ
SH
pH﹥ 6.8
DTNB
NO2 COO
ENZ
S S
+
S
NO2
+
COO
H+
（5）分子内交联修饰
定义：利用含有双功能基团的化合物， 与酶分子中两个侧链基团反应，形成共 价交联，可使酶分子的空间构象更为稳 定，提高酶的稳定性。 修饰剂：二氨基丁烷，戊二醛，己二胺 用途：在蛋白和酶的结构与功能的基础 研究，酶的催化机制等酶学研究方面有 重要作用。
修饰剂的选择
修饰剂的种类虽然很多，但在选择修饰 剂的时候需要考虑的以下几个方面： ①修饰剂的分子量，修饰剂的链长度对 蛋白质的吸附性；修饰剂上反应基团的 数目及位置 ②修饰剂上反应基团的活化方法及条件。
修饰剂的活化
右旋糖酐修饰 酶分子的过程
应用： 3. 应用：
如：PEG－超氧化物歧化酶（SOD） PEG－超氧化物歧化酶（SOD） PEG－溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等） PEG－溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等） PEG－天门冬酰胺酶（ASNase） PEG－天门冬酰胺酶（ASNase） • 消除了抗原性 • 延长了酶在体内的半衰期 又如： Dextran修饰α 淀粉酶， β－淀粉酶， 又如：用Dextran修饰α-淀粉酶， β－淀粉酶，胰 修饰 蛋白酶、过氧化氢酶，提高了酶的热稳定性。 蛋白酶、过氧化氢酶，提高了酶的热稳定性。
3.酶分子的主链修饰 3.酶分子的主链修饰
3.1定义 3.1定义 利用酶分子主链的切断和连接，使酶分 子的化学结构及空间结构发生某些改变， 从而改变酶的特性和功能的方法。
3.2主链切断 3.2主链切断
3.2.1修饰剂 3.2.1修饰剂 专一性强的蛋白酶或肽酶。
3.2.2肽链被水解以后，可能出 3.2.2肽链被水解以后，可能出 现三种情况
2.3方法 2.3方法
纯酶 加入金属离子的螯合剂 除去金属螯合物
测酶活力变化
分别加入不同的金属离子， 使其与酶蛋白结合
确定较优的离子
2.4 作用
1.阐明金属离子对酶催化作用的影响 1.阐明金属离子对酶催化作用的影响 2.提高酶的催化效率 2.提高酶的催化效率 3.增强酶的稳定性 3.增强酶的稳定性 4.改变酶的动力学特征 4.改变酶的动力学特征
1 酶原激活 切去N 胰蛋白酶原 切去N端的六肽 有些酶的活性较低， 2 有些酶的活性较低，通过酶分子主链修饰可 以显著提高酶的催化活性 天冬氨酸酶经过胰蛋白酶修饰， 天冬氨酸酶经过胰蛋白酶修饰，切去羧基末端 的10个氨基酸残基，其催化效率提高5倍。 10个氨基酸残基，其催化效率提高5 个氨基酸残基 3 采用适当的方法使酶分子的肽链在特定的位 点断裂Байду номын сангаас其分子质量减少， 点断裂，其分子质量减少，就可以在基本保持 酶活性的同时使酶的抗原性降低或消失。 酶活性的同时使酶的抗原性降低或消失。
第四章：酶分子修饰
酶分子是具有完整的化学结构和空间结 构的生物大分子。酶分子的结构决定了 构的生物大分子。酶分子的结构决定了 酶的性质和功能。当酶分子的结构发生 酶的性质和功能。当酶分子的结构发生 改变时，将会引起酶的性质和功能的改 变。 通过各种方法使酶分子的结构发生某些 改变，从而改变酶的某些特性和功能的 技术过程称为酶分子修饰。 技术过程称为酶分子修饰。
复习思考题
1 2
3
4
酶分子修饰的概念和作用。 酶分子修饰的概念和作用。 何谓金属离子置换修饰？ 何谓金属离子置换修饰？简述其主要修 饰过程和作用？ 饰过程和作用？ 何谓大分子结合修饰、 何谓大分子结合修饰、肽链有限水解修 氨基酸置换修饰和核苷酸置换修饰？ 饰、氨基酸置换修饰和核苷酸置换修饰？ 简述定点突变技术的主要技术过程。 简述定点突变技术的主要技术过程。
化学法 化学修饰法难度大，成本高，专一性差， 而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复 杂，难以工业化生产。 蛋白质定点突变技术 是指在DNA序列中的某一特定位点上进行 是指在DNA序列中的某一特定位点上进行 碱基的改变从而获得突变基因的操作技 术。
定位突变技术用于酶分子修饰的主要过程
1)新的酶分子结构的设计 新的酶分子结构的设计 2）突变基因碱基序列的确定 突变基因的获得： 3）突变基因的获得：根据欲获得的突变基因 的碱基序列及其需要置换的碱基位置，首先 的碱基序列及其需要置换的碱基位置， DNA合成仪合成有 合成仪合成有1 用DNA合成仪合成有1～2个碱基被置换了的 寡核苷酸， 寡核苷酸，再用此寡核苷酸为引物通过聚合 酶链反应（PCR） 酶链反应（PCR）或M13质粒等定位突变技术 获得所需的大量突变基因， 获得所需的大量突变基因，这称为寡核苷酸 诱导的定位突变。 诱导的定位突变。
5.4 核苷酸置换修饰
核酸类酶 将酶分子上核苷酸链上的某一个核苷酸置 换成另一个核苷酸，从而改变酶的催化 换成另一个核苷酸， 特征的修饰方法称为核苷酸置换修饰。 特征的修饰方法称为核苷酸置换修饰。 方法： 方法：定位突变技术
6.物理修饰 6.物理修饰
定义：通过各种物理方法，使酶分子的空间构 象发生某些改变, 象发生某些改变,从而改变酶的催化特性的方法。 手段：不同的物理条件，特别是高温、高压、 高盐、低温、真空、失重、极端pH、有毒环境 高盐、低温、真空、失重、极端pH、有毒环境 等极端条件下。 特点；不改变酶的组成单位及其基团，分子中 共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下， 副键发生某些变化和重排，使酶分子的空间构 象发生某些变化。
第九章 酶分子修饰的应用
通过酶分子修饰可以探索酶的结构和功 能的关系，并可以提高酶的催化效率， 能的关系，并可以提高酶的催化效率， 增强酶的稳定性， 增强酶的稳定性，降低或者消除酶的抗 原性，改变酶的动力学特征等， 原性，改变酶的动力学特征等，从而提 高酶在医药和食品、轻工、化工、环保、 高酶在医药和食品、轻工、化工、环保、 能源等领域的应用价值。 能源等领域的应用价值。
1.修饰方法分类 1.修饰方法分类
对酶分子的修饰方法分为化学法、生物法和物理 法。 化学法：金属离子置换法、大分子修饰法、肽链 化学法：金属离子置换法、大分子修饰法、肽链 有限水解法、蛋白侧链基团的小分子修饰法等。 生物法：通过基因工程的手段改变蛋白质，即基 生物法：通过基因工程的手段改变蛋白质，即基 于核酸水平对蛋白质进行改造，利用基因操作技 术对DNA或mRNA进行改造和修饰以期获得化学 术对DNA或mRNA进行改造和修饰以期获得化学 结构更为合理的蛋白质。 物理修饰法：不改变酶的组成和基团，酶分子的 物理修饰法：不改变酶的组成和基团，酶分子的 共价键不发生变化。
（2）羧基修饰
定义：各种羧基修饰剂与酶蛋白侧链的 羧基进行酯化、酰基化反应，使酶蛋白 的空间构象发生改变的方法。 修饰剂：乙醇－盐酸试剂，碳化二亚胺， 异噁唑盐等。
（3）胍基修饰
定义：采用二羰基化合物与胍基反应生成稳 定的杂环，从而改变酶分子的空间构象。 修饰剂：环己二酮，丙二醛，苯乙二醛
HO
O
2.金属离子置换法 2.金属离子置换法
2.1定义和原理 2.1定义和原理 ①定义 改变酶分子中的金属离子，使酶的特性和 功能改变的方法。 ②原理 对于某些含金属离子的酶，金属离子的有、 无或更换会使其失活，活性降低或提高
2.2用于酶分子修饰的金属离子 2.2用于酶分子修饰的金属离子
Ca2＋，Mg2＋，Mn2＋，Zn2＋，Cu2＋，Fe2＋ 等。
OH B O
NH2 ENZ N C NH2
+
O O
pH7～9 25℃
OH
OH
HN NH C N ENZ
硼酸盐
HN NH C N ENZ
（4）巯基修饰
定义: 定义:使酶分子侧链上巯基改变，从而改变酶的空间 构象、特征及功能。 修饰剂：5 5′－二硫代－双（2 修饰剂：5，5′－二硫代－双（2－硝基苯甲酸） DTNB，巯基乙醇，硫带硫酸盐，硼氢化钠等。 DTNB，巯基乙醇，硫带硫酸盐，硼氢化钠等。
5.酶分子的组成单位置换修饰 5.酶分子的组成单位置换修饰
5.1定义 5.1定义 氨基酸置换修饰：将酶分子肽链的某一 个氨基酸换成另一个氨基酸的方法。 核苷酸置换修饰：将酶分子的某一个核 苷酸换成另一个核苷酸的方法。
5.2作用 5.2作用
提高酶活力 增加稳定性 使酶的专一性改变
5.3氨基酸置换修饰方法 5.3氨基酸置换修饰方法
3.2.3肽链有限水解修饰 3.2.3肽链有限水解修饰
肽链的水解在限定的肽键上进行，称为肽 链有限水解。 利用肽链的有限水解，其分子质量减少， 既可以在基本保持酶活力的同时使酶的抗 原性降低或消失，又可以使酶的空间结构 发生某些精细的改变，从而改变酶的特性 和功能的方法，称为肽链有限水解修饰。