色谱技术的引入为氨基酸分析打开了一扇新的大门。 1941年,Martin等运用色层法分析氨基酸,主要采用乙酰 化氨基酸在硅胶柱上或滤纸上半定量;随后,Moore、 Stein应用离子交换柱直接分离游离的氨基酸,在1958年, Spackman、Stein、Moore制造了自动化的氨基酸分析 仪,使氨基酸定量分析进入了一个崭新的阶段,至今仍是 经典的方法。
以下是几种常见的氨基酸分析方法。
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(1)茚三酮法 Spackman等人最早将茚三酮试剂运用到氨基酸组成分
析上。离子交换层析后,各种氨基酸与茚三酮反应形成紫色 化合物,最大光吸收在570nm,摩尔消光系数2X104,茚 三酮和二级胺(脯氨酸和羟脯氨酸)形成黄色产物,在 440nm检出,摩尔消光系数3X103。目前此法的灵敏度可 达100pmol,但茚三酮试剂易氧化,必须隔绝空气避光保 存,试剂本身黏性大,需要有个柱后混合器才能与氨基酸充 分反应,对仪器要求较高。
氧化反应被用来转化半胱氨酸和胱氨酸成为半胱磺酸,过 甲酸氧化反应的缺点是它会影响其他氨基酸特别是甲硫氨酸 会转变成甲硫氨酸砜,酪氨酸会降解。为克服这一 缺点,必 须准备能分析两次的样品量,一次提供半胱氨酸数据,另一 次则提供其他氨基酸的组成数据。
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第四节 氨基酸组成原位分析
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第一节 氨基酸组成分析的目的
现代分离提纯技术的发展使蛋白质操作微量化,但也给 定量带来了困难,一般很难通过常规的称量或测蛋白质溶液 在280nm的光吸收值来准确定量蛋白质。所以如果在蛋白 质酶解或测序前,取蛋白质样品的一部分进行氨基酸组成分 析,根据结果便可以推算出蛋白量的可靠值。 另外,在蛋白质测序中有时遇到测不出结果的情况, 一种可能是蛋白质的N端封闭, 另一种可能则是样品本身不是蛋白质或绝大部分是非蛋白质 物质, 解决这个问题的很好途径便是做氨基酸组成分析以确定样品 的成分。