蛋白质 分子量 色谱

用于HPLC分离的XBridge Protein BEH SEC色谱柱■■■■■用于SEC HPLC分离10-1,500 kDa范围内的蛋白质，具有更高的通量卓越的SEC色谱柱寿命与硅胶基质SEC色谱柱相比，显著减少不希望发生的蛋白与色谱柱之间的相互作用全面的测试可保证无可比拟的柱间一致性，并提高了已验证方法的可靠性互补ACQUITY UPLC® SEC色谱柱系列，可根据不同的应用需求实现方法的无缝转换[ 产品解决方案 ]沃特世XBridge® Protein BEH SEC 200Å和450Å, 3.5 µm色谱柱设计用于HPLC仪器，互补现有的用于蛋白分离的小粒径UPLC®体积排阻色谱柱(SEC)系列。这类新型HPLC SEC色谱柱基于相同的沃特世亚乙基桥杂化颗粒(BEH)和稳定的二醇基键合技术，与传统100%硅胶基质SEC产品相比性能更佳。因此，色谱工作者现在能够根据实验室仪器、所需蛋白组分分离度和样品通量的要求，轻松地开发和/或转换SEC方法。

2适用于蛋白质分离的HPLC型SEC色谱柱

图1. XBridge Protein BEH SEC 200Å(绿色)和450Å(蓝色)，3.5 µm粒径SEC色谱柱上所得的各种蛋白质、多肽和尿嘧啶的校准曲线。Uracil(112 Da) 抑肽酶(6.5 KDa)核糖核酸酶A (14 KDa)肌红蛋白(17 KDa)卵清蛋白(44 KDa)伴清蛋白(75KDa)淀粉转葡糖苷酶(97 KDa)IgG(150 KDa)甲状腺球蛋白(669KDa)IgM(900 KDa)101001,00010,000100,0001,000,00010,000,0000.30.40.50.60.70.80.91蛋白质分子量 (KDa)归一化保留体积 (Vr/VC)XBridge Protein BEH SEC 450Å, 3.5 µm, 100K –1,500K DaltonsXBridge Protein BEH SEC 200Å, 3.5 µm, 10K –450K DaltonsAU0.000.020.040.068.012.016.020.024.028.032.0AU0.000.020.040.060.088.012.016.020.024.028.032.0123456712357XBridge Protein BEH SEC 450Å, 3.5 µm注：BEH450测试混合物中不含有下列标准品4和6XBridge Protein BEH SEC 200Å, 3.5 µm化合物：1.甲状腺球蛋白(670K)2.BSA (66K)3.卵清蛋白(44K)4.碳酸酐酶(29K)5.肌红蛋白(17K)6.血管紧张素碎片离子1-7 (899)7.尿嘧啶(112)图2. XBridge Protein BEH SEC 450Å(上图)和200Å(下图)，3.5 µm粒径SEC色谱柱上各种蛋白质、多肽和尿嘧啶的曲线分离结果的比较。 UV 吸收 (280 nm)时间 (min)412350.00.07.018.0流速= 1.0 mL/minute流速= 2.0 mL/minuteAB图3. 沃特世BEH200 SEC蛋白质标准品混合物(部件号：186006518)在(A)其它品牌的250Å, 5 µm SEC硅胶基质色谱柱，流速为1.0 mL/min和(B)XBridge Protein BEH SEC 200Å, 3.5 µm色谱柱，流速为2.0 mL/min，100 mM磷酸钠缓冲液，流动相pH 6.8条件下分离结果的比较。两根色谱柱规格均为7.8 mm x 300 mm，且载样量相同。已对主色谱图的时间轴进行了归一化处理。色谱图A和B的谱峰识别结果为：1)甲状腺球蛋白(669 kDa), 2) IgG(150 kDa), 3)BSA (67 kDa), 4)肌红蛋白(14 kDa)以及尿嘧啶(112 Da)。XBridge Protein BEH SEC 200Å和450Å, 3.5 µm色谱柱上的蛋白质和多肽标准品的分离采用XBridge Protein BEH SEC 3.5 µm色谱柱可获得更高的样品通量 化合物：1.甲状腺球蛋白(669 kDa)2.IgG (150 kDa)3.BSA (67 kDa)4.肌红蛋白(14 kDa)5.尿嘧啶(112 Da)XBridge Protein BEH SEC 200Å和450Å, 3.5 µm色谱柱上的蛋白质和多肽校准曲线[ 产品解决方案 ]蛋白类生物治疗药物的发现、研发和质量评估时常用到可靠、高分离度的SEC方法。沃特世XBridge Protein BEH SEC 200Å和450Å, 3.5 µm色谱柱可分离大小在10 – 1,500 kDa范围内的蛋白质。与使用大于5 ìm颗粒的传统硅胶基质SEC色谱柱相比，XBridge Protein BEH SEC 3.5 µm二醇基键合色谱柱能承受较高的流速和压力条件，可提高HPLC系统的样品通量。注：与200Å, 3.5 µm BEH色谱柱的结果相比，较大孔径的250Å, 5 µm硅胶基质颗粒对甲状腺球蛋白二聚体峰(1.3 MDa)具有较高的分离度，其它分子量标准谱图相当。沃特世推荐使用XBridge Protein BEH SEC 450Å, 3.5 µm柱分析如甲状腺球蛋白及其二聚体，这种分子量超出XBridge Protein BEH SEC 200Å, 3.5 µm色谱柱推荐分子量分析范围的蛋白。

浅谈蛋白质质谱分析方法及应用

董义龙

(单位：毕节学院，化学与化学工程学院，2009级化学教育本科三班,学号:06320904031）

摘要：随着科学的不断发展，运用质谱法进行蛋白质的分析日益增多，本文简要的综

述了肽和蛋白质等生物大分子质谱分析的特点，方法及蛋白质质谱分析的原理，方式

和应用，并对其发展前景着出展望。

关键词：蛋白质 质谱分析 原理与方法

蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，约占细胞干质量的50%以上。作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行，调节代谢，抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此，蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家极为关注的问题，其研究的内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立体化学分析等。随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。

1 蛋白质组学研究的背景和意义

1．1蛋白质组学的产生

20世纪90年代开始的人类基因组计划(}Iuman Genome Project，HGP)是人类有史以来最伟大的认识自身的世纪工程，旨在阐明人类基因组DNA3×109核苷酸序列，希望在分子水平上破译人类所有的遗传信息。经过各国科学家十几年的努力，HGP已取得了巨大的成绩。在揭示基因组精细结构的同时，也凸现了基因数量有限性和基因结构的相对稳定性，这与生命现象的复杂和多交性之间存在着巨大的反差。这种反差促使人们认识到：基因只是遗传信息的载体。要研究生命现象，阐释生命活动的规律，只了解基因组的结构是远远不够的。对于生命活动的主要体现者——蛋白质进行更全面和深入的研究是目前生命科学研究的迫切需要和重要任务。后因组时代中功能基因组(Functional Genomics)的研究采用一些新的技术，如微阵列，DNA芯片对成千上万的基因表达进行分析比较，并从基因整体水平上对基因的活动规律进行阐述。它摒弃经典分子生物学零敲碎打地研究个别基因的习惯，力求从细胞水平上解决基因组问题以建立对生命现象的整体认识。但是，生命现象的主要体现者是蛋白质，而蛋白质有其自身的特定活规律仅仅从基因的角度来研究是远远不够的l 31。因此，产生了一门在整体水平上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律的新兴学科——蛋白质组学(Proteomics)。

实验 蛋白质的定量测定方法

【实验预习】

1.试比较Folin酚法与考马斯亮蓝染料结合比色法的优缺点。

2.试比较二喹啉甲酸法与Folin酚法的优缺点。

3.凯氏定氮法中在消化样品时，加入浓硫酸，硫酸钾和硫酸铜粉末的目的是什麽？

4.紫外吸收法测定蛋白质含量的原理是什麽？

一、Folin酚试剂法(Lowry法)

【实验目的】

1.学习Folin酚试剂法测定蛋白质含量的原理。

2.掌握Folin酚试剂法测定蛋白质含量的方法和操作。

【实验原理】

蛋白质中含有酪氨酸和色氨酸残基，能与Folin酚试剂起氧化还原反应。反应过程分为两步，第一步：在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成蛋白质Cu2+复合物；第二步：蛋白质Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。

该呈色反应在30分钟内即接近极限，并且在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故可用比色的方法确定蛋白质的含量。进行测定时要根据蛋白质浓度的不同选用不同的测定波长：若蛋白质含量高时（25100μg）在500nm波长处进行测定，含量低时(525μg)在755nm波长处进行测定。最后根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。

Folin酚试剂法操作简便，灵敏度高，样品中蛋白质含量高于5μg即可测得，是测定蛋白质含量应用得最广泛的方法之一。

【实验用品】

1.实验器材

100毫升容量瓶2只；移液管1毫升4支，5毫升2支；分光光度计。

2.实验试剂

(1)Fo1in酚试剂甲：将lg碳酸钠溶于50mL0.lmol／L氢氧化钠溶液中，再把0.5g硫酸铜(CuSO4∙5H2O)溶于100mL1％酒石酸钾(或酒石酸钠)溶液，然后将前者50mL与后者lmL混合。混合后1日内使用有效。

(2)Folin酚试剂乙：在1.5L容积的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(Na2WO4∙2H2O)、25g钼酸钠(Na2MoO4∙2H2O)、700mL蒸馏水、50mL85％磷酸及100mL浓盐酸，充分混匀后回流10h。回流完毕，再加150g硫酸锂、50mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴，冷却后定容到1000mL。过滤，如显绿色，可加溴水数滴使氧化至溶液呈淡黄色。置于棕色瓶中暗处保存。使用前用标准氢氧化钠溶液滴定，酚酞为指示剂，以标定该试剂的酸度，一般为2mol／L左右(由于滤液为浅黄色，滴定时滤液需稀释100倍，以免影响滴定终点的观察)。使用时适当稀释(约1倍)，使最后浓度为lmol／L酸。

蛋白质分析中的液相色谱技术

蛋白质是生物体内非常重要的一种生物大分子，其具有重要的生理和生化功能。在现代生物学中，对蛋白质的研究已经成为一个非常活跃的领域。蛋白质分析技术的发展也得到了极大的推动，其中，液相色谱技术已经成为了蛋白质分析的一种重要的手段。

液相色谱技术（Liquid Chromatography，LC）是基于物质在流动液相中因理化性质的差异而发生分离的一种分离技术。利用固定相、流动相及它们与样品相互作用的物理、化学参数，将混合物中的化合物分离并测定。流动相可以是气体或液体，其中最常见的是液体。与其他分离方法相比，液相色谱技术有着具有很多优点，如分离效果好、分离剂用量低、操作简单快捷、可靠性高等，因此被广泛应用在生化、制药、食品、环境等领域。

目前，液相色谱技术被广泛应用于蛋白质分析之中。其主要包括以下几个方面：

一、蛋白质分离纯化

液相色谱技术可以实现对蛋白质的快速高效分离纯化。根据蛋白质的理化性质，液相色谱可以对蛋白质进行不同方式的分离。例如，按照蛋白质的相对大小进行分离的凝胶过滤色谱，按照蛋白质的电荷性质进行分离的离子交换色谱与电泳；按照蛋白质的疏水性进行分离的反相色谱与亲水色谱等。通过液相色谱技术，不仅可以获得纯净的蛋白质，还可以对混杂物进行有效的去除。这为后续的蛋白质分析打下了坚实的基础。

二、蛋白质定量

液相色谱技术也可以用于蛋白质的定量。对于蛋白质的定量需要了解蛋白质的含量、结构、各种功能配体的亲和性，从而推断其生物学性质和功能特点。目前，蛋白质定量的方法有很多种，其中液相色谱技术是最具有前景的技术之一。例如，用高效液相色谱分离定量蛋白质配体复合物的方法可以测定点钴原激活因子等的生物活性物质的蛋白质含量，用毛细管电泳定量可以测定血清白蛋白，糖化血红蛋白等各种蛋白质。

三、蛋白质序列分析

液相色谱技术也可以实现蛋白质序列的解析。对于蛋白质的序列分析，通常采用色谱方法和质谱法等多种方法。其中，液相色谱方法是最常用的技术之一。利用高效液相色谱技术可以实现蛋白质中特定氨基酸残基的定量和分离，并根据这些氨基酸的分离顺序分析蛋白质的结构。