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蛋白质分子量测定

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蛋白质分子量测定方法

目前，蛋白质分子量测定的常用方法主要有四种：年度法、凝胶过滤层析法、凝胶电泳法和凝胶渗透色谱(GPC)法。

一、粘度法

一定温度条件下，高聚物稀溶液的粘度与其分子量之间呈正相关性，随着分子量的增大，聚合物溶液的粘度增大。通过测定高聚物稀溶液粘度随浓度的变化，即可计算出其平均分子量(粘均分子量)。

该方法操作简单、设备价格较低，通常不需要标准样品，但无法测定聚合物的分子量分布。

粘度法所需设备：恒温槽、乌倍路德粘度计。

二、凝胶过滤层析法

在凝胶色谱柱中，分子量不同的聚合物分子，由于其渗入凝胶微孔的能力不同而在柱中得以分离。分子量较大的分子，渗入凝胶微孔较浅，随洗脱液流动速度较快，因而先流出色谱柱；相反，分子量较小的聚合物分子后流出。通过测定从进样到聚合物分子流出色谱柱期间流过凝胶柱的洗脱液的体积，并与标准样品比较，即可计算聚合物的分子量，并估算其分子量分布。

凝胶层析技术操作方便，设备简单，样品用量少，而且有时不需要纯物质，用一粗制品即可，目前已得到相当广泛的应用。凝胶层析法测定分子量也有一定的局限性，在pH6—8的范围内，线性关系比较好，但在极端pH时，一般蛋白质有可能因变性而偏离。糖蛋白在含糖量超过5%时，测得分子量比真实的要大，铁蛋白则与此相反，测得的分子量比真实的要小。 凝胶过滤层析法所需设备：层析柱、紫外分光光度计。

三、SDS-凝胶电泳法

SDS是十二烷基硫酸钠的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而使其电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。

SDS-凝胶电泳法是目前蛋白质分子量测定中使用最广泛的方法，实验成本较低，仪器设备也相对很简单，一套电泳装置即可。一般涉及到蛋白质纯化的实验室基本都具备。但是精确程度相对较低，好的电泳图谱需要一定的技术。

SDS-凝胶电泳法所需设备：微型凝胶电泳装置、电源（电压200V，电流500mA）。

四、凝胶渗透色谱法

凝胶渗透色谱法的分离原理与凝胶过滤层析法相同，只是利用高校液相色谱技术实现凝胶层析法分离和测定过程。

与凝胶过滤层析法相比凝胶渗透色谱法分离速度快、分析时间短、重现性好，但设备投入较大，价格较高。

凝胶渗透色谱法所需设备：高效液相色谱仪、溶剂脱气设备、溶剂过滤器、样品过滤器件。

其中高效液相色谱仪可选用如下两种系统之一；

溶剂脱气设备可选用超声波清洗器：江苏昆山KQ-100E。

两种备选高效液相色谱系统

大连伊利特P230型等度系统

基本配置：

P230型高压恒流输液泵：1台

UV230+型紫外可见检测器：1台

Rheodyne 7725i高压六通进样阀：1只

EC2000单通道色谱数据处理工作站：1套

色谱柱：

根据测定蛋白质的分子量不同选取(可咨询色谱仪器公司)。

岛津高效液相色谱仪LC-10Avp plus(苏州岛津)

基本配置

LC-10ATVP Plus输液泵：1台

SPD-10AVP Plus紫外可见双波长检测器：1台

LCsolution Lite 中文化LC工作站：1套

CBM-10AVP Plus系统控制器：1台

高压六通进样阀：1只

色谱柱：

根据测定蛋白质的分子量不同选取(可咨询色谱仪器公司)。

一、粘度法

1. 原理

分子量是表征化合物特征的基本参数之一。但高聚物分子量大小不一，参差不齐，一般在103～107 之间，所以通常所测高聚物的分子量是平均分子量。

高聚物在稀溶液中的粘度，主要反映了液体在流动时存在着内摩擦。在测高聚物溶液粘度求分子量时，常用到下面一些名词。

如果高聚物分子的分子量愈大，则它与溶剂间的接触表面也愈大，摩擦就大，表现出的特性粘度也大。特性粘度和分子量之间的经验关系式为：

式中，M 为粘均分子量；K为比例常数；是与分子形状有关的经验参数。K和值与温度、聚合物、溶剂性质有关，也和分子量大小有关。K值受温度的影响较明显，而值主要取决于高分子线团在某温度下，某溶剂中舒展的程度，其数值解在0.5～1

之间。K与的数值可通过其他绝对方法确定，例如渗透压法、光散射法等，从粘度法只能测定[η]。

在无限稀释条件下

获得[η]的方法有二种：一种是以ηsp/C对C作图，外推到C→0的截距值；另一种是以lnηr/C对C作图，也外推到C→0 的截距，两根线会合于一点。方程为：

测定粘度的方法主要有毛细管法、转筒法和落球法。在测定高聚物分子的特性粘度时，以毛细管流出法的粘度计最为方便。若液体在毛细管粘度计中，因重力作用流出时，可通过泊肃叶公式计算粘度。

(m=1)。

对于某一只指定的粘度计而言，（4）可以写成下式

省略忽略相关值，可写成：

式中，t为溶液的流出时间；t0为纯溶剂的流出时间。

可以通过溶剂和溶液在毛细管中的流出时间，从(6)式求得ηr，再由图求得[η]。

2. 仪器

恒温槽1 套；乌倍路德粘度计1 只；移液管（10mL）2 只，（5mL）1 只；秒表，吸耳球，螺旋夹；橡皮管；

3. 步骤（以聚丙烯酰胺分子量测定为例）

测定所用的乌倍路德粘度计，又叫气承悬柱式粘度计。他的最大优点是可以在粘度计里逐渐稀释从而节省许多操作手续。

(1)． 先用洗液将仪器洗净，再用自来水、蒸馏水分别冲洗几次，每次都要注意反复流洗毛细管部分，洗好后烘干备用。

(2)． 调节恒温槽温度至30.00℃，在粘度计的B管和C管上都套上橡皮管，然后将其垂直放入恒温槽，使水面完全浸没G球。 (3)． 溶液流出时间的测定。用移液管分别吸取已知浓度的聚丙烯酰胺溶液10mL 和硝酸钠溶液（3 mol·dm-3）5mL，由A 管注入粘度计中，在C 管处用洗耳球打气，使溶液混合均匀，浓度记为C1，恒温10min，进行测定。测定方法如下：将C管用夹子夹紧使之不通气，在B管用吸耳球将溶液从F球经D球、毛细管、E球抽至G球2/3 处，解去夹子，让C管通大气，此时D球内的溶液即回入F球，使毛细管以上的液体悬空。毛细管以上的液体下落，当液面流经a刻度时，立即开始计时，当液面降至b刻度时，停止计时，测得刻度a,b之间的液体流经毛细管所需时间。重复这一操作三次，它们间相差不大于0.3s，取三次的平均值为t1。

然后依次由A管用移液管加入5mL,5mL,5mL,5mL硝酸钠溶液（1 mol·dm-3），将溶液稀释，使溶液浓度分别为C2,C3,C4,C5，用同法测定每份溶液流经毛细管的时间t2,t3,t4,t5。应注意每次加入硝酸钠溶液后，要充分混合均匀，并抽洗粘度计的E球和G球，使粘度计内溶液各处的浓度相等。

(4)．溶剂流出时间的测定

用蒸馏水洗净粘度计，尤其要反复流洗粘度计的毛细管部分。用1 mol·dm-3的硝酸钠洗1～2次，然后由A管加入约15mL 1 mol·dm-3硝酸钠溶液。用同法测定溶剂流出的时间t0。

4. 数据记录

(1)．数据记录

(2)．作图

由回归直线截矩得 [η]＝

(3)． 由公式代入数据得

表 高聚物溶剂体系的［η］--- M关系式

高聚物 溶剂 t/℃ 103K

dm3·kg-1 α 分子量范围M×10-4

聚丙烯酰胺

聚丙烯腈

聚甲基丙烯酸甲酯

聚乙烯醇

聚苯乙烯

聚己内酰胺

聚醋酸乙烯酯 水

水

1mol·dm-3 NaNO3

二甲基甲酰胺

苯

丙酮

水

水

甲苯

40%H2SO4

丙酮 30

30

30

25

25

25

25

30

25

25

25 6.31

68

37.5

16.6

3.8

7.5

20

66.6

17

59.2

10.8 0.80

0.66

0.66

0.81

0.79

0.70

0.76

0.64

0.69

0.69

0.72 2～50

1～20

5～27

24～450

3～93

0.6～2.1

0.6～16

1～160

0.3～1.3

0.9～2.5

摘自:印永嘉主编.大学化学手册.山东科学技术出版社.1985:692

二、凝胶过滤层析法

1. 原理：

凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又叫做分子筛层析法（molecular sieve chromatography），排阻层析法（exclusion chromatography）。凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离，好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。

凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose），人工合成凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel-P）和葡聚糖（dextran）凝胶，后者的商品名称为Sephadex型的各种交联葡聚糖凝胶，它是个有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。

这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。

为了说明凝胶层析的原理，将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt（total volume）表示。实际上Vt是由Vo，Vi与Vg三部分组成，即：

Vt=Vo+Vi+Vg

Vo称为“孔隙体积”或“外体积”（outer volume）又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积（inner volume），又称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，相应于一般层析法中的固定相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的

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测定蛋白质分子质量的常用方法

测定蛋白质分子质量的常用方法

测定蛋白质分子质量的常用方法

测定蛋白质分子质量是化学实验的重要环节，对于蛋白质的结构、功能及关联分子的组成、绝对结构等化学过程均有重要意义。测定蛋白质分子质量的常用方法主要有氨基酸含量分析、蒸馏法、双杂质定量法、穆斯堡定律、电泳法、电晶体谱法、气相色谱法等。

1、氨基酸含量分析是分析蛋白质分子量最常用的方法，其原理是依靠氨基酸构成蛋白质，根据其组成比例结合穆斯堡定律，来计算蛋白质分子量的大小。

2、蒸馏法的原理是依靠蛋白质的分子量与其溶解度成反比，通过改变溶解度进行测定蛋白质分子量的大小

3、双杂质定量法是指利用双重折射定量痕量并加上溶解度分析，来测定蛋白质分子质量的大小

4、穆斯堡定律指的是将蛋白质结合其底物、激素等特定分子特定比例共存时，通过蛋白质分子质量计算法或重量法，得到蛋白质分子质量的大小

5、电泳法是指用可吸收光谱法来测定蛋白质的分子量，利用穆斯堡定律的原理，对蛋白质的分子量在空间形状上进行分析

6、电晶体谱法是通过电晶体技术分析实施蛋白质质量测量，在电晶体条件下，分子会向模式堆叠成固体，并通过电晶定质量的测定方法，得到蛋白质分子质量的大小

7、最后，气相色谱法是指通过批处理和连续样品处理结合色谱技术，来分析蛋白质大小并计算其质量。

以上就是几种常用测定蛋白质分子质量的方法，此类方法大多利用一定原理来实现，在蛋白质研究中起着不可替代的作用。

蛋白分子量和检测条带

蛋白分子量和检测条带

蛋白分子量和检测条带

蛋白分子量是指蛋白质分子的质量大小，通常以千道尔顿（kDa）为单位。蛋白质的分子量可以通过凝胶电泳等方法进行测定。在凝胶电泳中，可以根据蛋白质在电场中的迁移速率来估算其分子量。另一种常用的方法是质谱分析，通过质谱仪可以准确测定蛋白质的分子量。

而检测条带通常是指在蛋白质凝胶电泳或者免疫印迹等实验中观察到的蛋白条带。这些条带可以代表不同分子量的蛋白质，通过与标准蛋白质分子量标记物进行比较，可以确定待测蛋白的分子量。此外，检测条带的强度和位置也可以提供关于蛋白质表达水平和其他特性的信息。

从实验角度来看，测定蛋白质分子量和观察检测条带是蛋白质研究中非常重要的步骤。这些数据可以帮助研究人员了解蛋白质的结构和功能，以及在不同生理或病理条件下的变化。同时，这些信息也对于药物研发、疾病诊断和治疗等方面具有重要意义。

从应用角度来看，蛋白质分子量和检测条带的信息在许多领域都有广泛的应用。比如在生物医学研究中，可以通过测定蛋白质分子量和观察检测条带来研究疾病机制、筛选药物靶点等。在生物工程和生物制药领域，这些数据也可以用于优化蛋白质表达和纯化工艺。总之，蛋白质分子量和检测条带的研究对于推动生命科学领域的发展具有重要意义。

综上所述，蛋白质分子量和检测条带在蛋白质研究中扮演着重要角色，从实验和应用两个角度来看，这些数据对于我们深入了解蛋白质的结构、功能和应用具有重要意义。

蛋白质的定量测定方法

蛋白质的定量测定方法

实验 蛋白质的定量测定方法

【实验预习】

1.试比较Folin酚法与考马斯亮蓝染料结合比色法的优缺点。

2.试比较二喹啉甲酸法与Folin酚法的优缺点。

3.凯氏定氮法中在消化样品时，加入浓硫酸，硫酸钾和硫酸铜粉末的目的是什麽？

4.紫外吸收法测定蛋白质含量的原理是什麽？

一、Folin酚试剂法(Lowry法)

【实验目的】

1.学习Folin酚试剂法测定蛋白质含量的原理。

2.掌握Folin酚试剂法测定蛋白质含量的方法和操作。

【实验原理】

蛋白质中含有酪氨酸和色氨酸残基，能与Folin酚试剂起氧化还原反应。反应过程分为两步，第一步：在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成蛋白质Cu2+复合物；第二步：蛋白质Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。

该呈色反应在30分钟内即接近极限，并且在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故可用比色的方法确定蛋白质的含量。进行测定时要根据蛋白质浓度的不同选用不同的测定波长：若蛋白质含量高时（25100μg）在500nm波长处进行测定，含量低时(525μg)在755nm波长处进行测定。最后根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。

Folin酚试剂法操作简便，灵敏度高，样品中蛋白质含量高于5μg即可测得，是测定蛋白质含量应用得最广泛的方法之一。

【实验用品】

1.实验器材

100毫升容量瓶2只；移液管1毫升4支，5毫升2支；分光光度计。

2.实验试剂

(1)Fo1in酚试剂甲：将lg碳酸钠溶于50mL0.lmol／L氢氧化钠溶液中，再把0.5g硫酸铜(CuSO4∙5H2O)溶于100mL1％酒石酸钾(或酒石酸钠)溶液，然后将前者50mL与后者lmL混合。混合后1日内使用有效。

(2)Folin酚试剂乙：在1.5L容积的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(Na2WO4∙2H2O)、25g钼酸钠(Na2MoO4∙2H2O)、700mL蒸馏水、50mL85％磷酸及100mL浓盐酸，充分混匀后回流10h。回流完毕，再加150g硫酸锂、50mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴，冷却后定容到1000mL。过滤，如显绿色，可加溴水数滴使氧化至溶液呈淡黄色。置于棕色瓶中暗处保存。使用前用标准氢氧化钠溶液滴定，酚酞为指示剂，以标定该试剂的酸度，一般为2mol／L左右(由于滤液为浅黄色，滴定时滤液需稀释100倍，以免影响滴定终点的观察)。使用时适当稀释(约1倍)，使最后浓度为lmol／L酸。

SDS-PAGE测定蛋白质分子量及蛋白质的纯度鉴定

SDS-PAGE测定蛋白质分子量及蛋白质的纯度鉴定

宝枫林 SDS-PAGE测定蛋白质分子量及蛋白质的纯度鉴定 一、实验目的与原理 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移取决于它所带电荷以及分子大小和形状等因素。1967年Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（SDS），大多数蛋白质能与SDS按一定比例结合，即每克蛋白质结合1.4g的SDS－复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而消除了蛋白质原有的电荷差别，使蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于本身的分子量，而与蛋白质所带的电荷无关，在一定条件下，蛋白质的分子量的对数与电泳迁移率间呈负相关。 本实验的目的是对多酚氧化酶的纯化度鉴定及分子量的测定，通过实验，学习和掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法蛋白质纯度和分子量的鉴定。 二、仪器与试剂 1、材料： 硫酸铵盐析沉淀的多酚氧化酶粗酶样品、DEAE-纤维素DE52柱层析的样品，Sephadex G-100柱层析的样品。 2、试剂： （1）丙稀酰胺（Acr母液）：30%Acr （Acr/Bis） （2）10%的SDS溶液 （3）10%的过硫酸铵溶液 （4）四甲基乙二胺（TEMED） （5）分离胶缓冲液：1.5M Tris，PH8.8 （6）浓缩胶缓冲液：1.0M Tris，PH6.8 （7）电极缓冲液：10×30g Tris，125g 甘氨酸和5g SDS，加水溶解定容至1000ml，pH8.3 （8）样品缓冲液：0.2M Tris，PH6.8，1%SDS，30%甘油，巯基乙醇及溴酚兰 （9）染色液：0.15%考马斯亮蓝R250，溶于脱色液 宝枫林 （10）脱色液：50%的甲醇，7%的冰醋酸的水溶液 （11）标准分子量蛋白。 3、仪器设备： 电泳仪、垂直电泳槽等。 三、操作步骤 1、凝胶制备： 用两块电泳玻璃板制成垂直板槽（不能漏胶），垂直放置。将配制好的分离胶溶液倒入，滴加入无离子水，待凝胶聚集后，倒出无离子水，用吸水纸吸干，倒入浓缩胶，再插入梳子。 2、上样： 分别取样品若干ml于离心管中，按1/1～1/5比例加入5×样品缓冲液，再沸水浴中加热3～5min，取出待用。用微量注射器分别吸取不超过30μl不同浓度的标准蛋白样品和试验样品注入样品槽。点样结束后，调节电泳仪电流到10mA（2～3mA/em），保持电流稳定不变，当溴酚蓝迁移到离分离胶底1～2cm时，即可停止电泳。 3、染色： 电泳完毕后，取出凝胶板，浸入染色液中，在37℃温箱中保温过夜。倒掉染色液，24h后，即可看到清晰的蛋白质条带。 四、结果 （略） 五、注意事项 1、SDS与蛋白质的结合按质量成比例（即：1.4gSDS/g蛋白质），如果比例不当，就不能得到准确的数据。 2、用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线。不能利用这次的标准曲线作为下次用。 3、有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。 4、有的蛋白质（如：电荷异常或结构异常的蛋白质；带有较大辅基的蛋白质）不能采用该法测相对分子量。 5、如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清晰等现象，可能是SDS不纯引起。