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分子生物学第十章 RNA干扰及其它小RNA的作用 PPT课件

分子生物学第十章 RNA干扰及其它小RNA的作用 PPT课件


Mechanistic model for RNAi. dsRNA, whether endogenously produced or exogenously provided, is cleaved by the ATP-dependent RNase III-like enzyme Dicer, producing 21- to 25-bp siRNAs with 2-nt 3′ overhangs. Each siRNA recruits a RISC (RNA-induced silencing complex）, which unwinds the siRNA, exposing each strand for potential binding to complementary target sequences. When the nowactivated RISC (RISC*) binds to a target mRNA, it cleaves it at a site approx 10 bp from the 5′ end of the siRNA. This results in two cleavage products, one missing its polyA tail and the other its 5′ 7-methyl guanosine cap, making each vulnerable to additional degradation by mRNA surveillance machinery. Meanwhile, the activated RISC is free to target additional messages.
RNA干扰（RNA interference，RNAi）

常用分子生物学技术——RNA干扰技术PPT教案

常用分子生物学技术——RNA干扰技术PPT教案
miRNA主要调节内源基因 表达，在发育过程中起作用
第19页/共39页
RNA干扰技术实施策略
1、体外合成siRNA
采用化学合成法来直接合成靶向目的基因的 siRNA，再通过不同方法导入细胞。
2、siRNA表达载体介导
根据siRNA序列设计DNA片段，插入表达载体
中，导入细胞，转录出shRNA，进一步切割
1990年，在转基因牵牛花中观察到共抑制现象
第11页/共39页
RNA干扰
（RNA interference, RNAi）
1998 年 ， Andrew Fire
和 Craig Melo 首 次 将 正 义
链 和 反 义 链 RNA混 合 后 ，
注入线虫（C. elegans），
观察到更强的基因表达抑制
第20页共39页体外合成sirna第21页共39页短发卡rnashrnasirna表达载体介导正义链反义链靶mrna第22页共39页rna干扰技术特点1rna干扰技术优点1具有较高特异性2基因沉默效率较高2rna干扰技术缺点脱靶效应offtargeteffects第23页共39页rna干扰技术的应用2基因治疗基因失活性治疗1病毒感染性疾病通过rnai抑制rna病毒复制1基因功能研究功能失活策略2基因过表达引起的疾病如肿瘤sirna药物基因敲减knockdown第24页共39页第25页共39页genetargeting利用同源重组原理对细胞特定内源基因进行改造的技术
常用分子生物学技术——RNA干扰技术
会计学
1
生物芯片（biochip）
以生物、电子、机械和信息技术为基础， 在固相支持物表面建立集成、连续、微型 分析系统，形成芯片，实现对生物大分子 的准确、快速、高通量、自动化检测。

RNA干扰1

RNA干扰1

Double-stranded RNA
sense antisense
Neg. control
Uninjected
inject
Antisense RNA C. elegans
dsRNA
Mex-3 mRNA detection in embryos by in situ hybridization
Andrew Fire, SiQun Xu, Mary K,etc. Nature 1998 391(19):806-811
Mechanism :RNA-Mediated Gene Silencing
Gisela Storz, Science, 296(17):1263-1265, 2002.
Gene Silencing Factors
RDE-4 DICER DCR-1 CAF
RISC(RNA-induced silencing complex)
分解 mRNA
抑制mRNA的翻译
Grisbok,Pasquinelli.Cell ,106:23-34,2001.
Remarkable Properties of RNAi
• • • • • • • • • 21-23nt, cannot be more than 30nt Post-transcriptional gene silencing (PTGS) Need the help of ATP dsRNA (not ssRNA) is interfering agent Sequence-specific loss of mRNA and protein Effective against exons not introns Potent (few dsRNA molecules/cell effective) Persistent (affects next generation) Effects can cross cell barriers (feed, soak)

RNA干扰与肿瘤研究及治疗ppt课件

RNA干扰与肿瘤研究及治疗ppt课件

2018/11/20
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20
2018/11/20
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13
三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用
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4. siRNA 对放疗的增敏作用
MDM2 蛋白被证明在辐射应答和肿瘤放射敏感性方面发挥关键作 用, 是一个有吸引力的临床药物靶标, 利用RNA干扰技术抑制MDM2 可 以加强肿瘤对放射治疗的敏感性。
2018/11/20
2018/11/20
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19
四、问题及展望
（二） 展望
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RNA i技术已经引起了实验生物学的巨大变革, 在肿瘤治疗, 它可以单独应 用，也可以与药物等其它治疗手段联合应用。随着研究的深入， RNA干扰技 术将日渐成熟并运用于更广更多的领域。随着新的小分子RNA的不断出现及人 们对RNA干扰机制的深入研究和ＲＮＡ 干扰技术的不断完善，RNA干扰有望 成为抗肿瘤的最新方法。相信不久的将来， RNA干扰技术将会逐渐完善，必 将探索出一条攻克恶性肿瘤的新路。
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14
三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用
5.抗肿瘤新药研发
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利用RNAi特异性地抑制癌细胞内的内源性致癌基因的表达,而不影响 正常细胞的基因表达,在研究肿瘤发生发展的信号通路以及表型变化可以发 挥极大的作用,从而可以进一步为肿瘤的早期诊断和后期治疗找寻新的靶点。 siRNA从发现到现在的短十几年时间内,很多研究工作者、生物技术公司和 制药公司己经开始广泛利用siRNA药物治疗肿瘤。
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7
翻译水平
LOGO
翻译水平上的RNA i是抑制相应mRNA的翻译, 使相应的蛋白质表 达受阻, 其中起重要作用的是小时序RNA ( sm all temporal RNA,stRNA ), 它是由长度约70 nt的RNA形成的茎环样前体经dicer酶作

RNA干扰完整

RNA干扰完整
RNAi 机制作为真核生物基因组免疫系统, 抑制外源和内源有害基因 表达。利用RNAi 技术把与病毒基因具同源性的siRNA 引入感染细胞将会 抑制病毒的增殖。利用RNAi 技术抑制过度表达的癌基因将会使癌症表型 逆转或病程得以控制。 研究人员开发出使用RNAi技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。这个 研究小组设计合成的lenti病毒载体引入siRNA，激发RNAi抑制了HIV-1的 coreceptor(辅助受体)-CCR5进入人体外周Ｔ淋巴细胞，不影响另一种
RNA的干扰
RNA干扰的概念
RNA
干扰
RNA干扰的作用机制 RNA干扰的应用 RNA干扰存在的问题
什么是RNA干扰？
• 英文：RNA interference，缩写RNAi 。 • 概念：是指在进化过程中高度保守的、由 双链RNA（double-stranded RNA， dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性 降解的现象，是正常生物体内抑制特定基 因表达的一种现象
• 。利用RNAi技术来研究药物作用的特异性和机制对于加快 药物开发的研制速度大有益处，因为基因组研究成果和高 通量的筛选技术，为更好更快发现药靶和候选药物提供了
重要基础。在药物开发过程中，用RNAi技术可以对靶基因
的功能进行分析，有助于搞ห้องสมุดไป่ตู้药物的作用机制以及与基因 编码产物，及与相应化合物的相互作用，从而更正确地发 现药靶，开发更有效的候选药物
第二步（效应阶段）是 siRNA 在 ATP参与下被 解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成 诱导的沉默复合体。在ATP 酶的作用下，活化 的 RISC 以单链 siRNA 为向导识别同源性的单 链靶mRNA ，并在距离RISC 的3` 端11个碱基 位置切割靶mRNA ，导致靶基因的沉默。

RNA干扰完整

RNA干扰完整
的两个位点有内切核酸酶活性, 这两个位点在相距约22bp 的距离
切断dsRNA , 各种生物体内Dicer结构略有不同, 致使siRNA 长度存在微小差别。
第15页，共41页。
Dicer
第16页，共41页。
Models for Dicer cleavage
第17页，共41页。
启始阶段
加工酶
加工成21-23核苷酸片段
供了重要线索。
第30页，共41页。
移行RNAi
移行RNAi是指沉默信号沿特定基因的移动。即沉默信号沿特定的mRNA由
3’
5’方向移动，这就是“移行RNAi”。在移行RNAi中新生成的
siRNA并非直接来自导入的dsRNA，而是在细胞中RdRP的作用下，以初级
siRNA的反义链为引物，以靶mRNA为模板，生成dsRNA，随后在Dicer酶及
能继续反作用于靶mRNA。
RdRP不仅能增加siRNA的拷贝数，而且能将异常的单链 RNA转变为dsRNA。RdRP还是一个重要的“感应器”，它能识 别正常和异常的RNA。转基因RNA和病毒RNA都在RdRP的识别下
启动RNAi的反应过程。
第28页，共41页。
RNAi扩大效应
第29页，共41页。
目前，对这些现象的解释至少有四 种机制：
与反义RNA所形成的双链区的5’起始端下游7~10个核苷酸处切断 mRNA，起到特异地抑制基因表达的效果。
第24页，共41页。
效应阶段
解旋酶
核酸外切酶
同源性检索活性
核酸内切酶
mRNA被核酸外切酶或核酸内切酶降解
第25页，共41页。
在这些机制中，RISC是一个很灵
活的平台，在不同的情况下结合不同的

RNA干涉课件


miRISCs/miRNP
不同点/分歧点 各自的生物学功 能不同
siRNA ⅰ抵抗病毒的防御机制(Pfeffer et al., 2004; Ding et al., 2004)；ⅱ沉默那些过 分表达的mRNA；ⅲ保护基因组免受转座子的 破坏(Mello and Conte, Jr., 2004; Hannon, 2002; Tabara et al., 1999)-9； 高度特异性 单链的siRNA结合到RISC复合物中，引导复 合物与mRNA完全互补，通过其自身的解旋酶 活性，解开siRNAs，通过反义siRNA链识别 目的mRNA片段，通过内切酶活性切割目的片 段，接着再通过细胞外切酶进一步降解目的 片段。同时，siRNA也可以阻遏3′UTR具有 短片断互补的mRNA的翻译（off target）。 siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂
在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形 成所谓RNA诱导沉默复合物。激活的RISC通过碱基配对定
位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3'端12个碱基的
位置切割mRNA。
起始阶段
效应阶段

siRNA

RNAi相关术语
RNAi：（RNA interference）RNA干扰
内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的能诱导细胞内与其序列同源的特异
基因表达沉默或抑制的效应，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为 RNA干扰，它也是体内抵御外在感染的一种重要保护机制。 siRNA ：(small interfering RNAs)小干扰RNA 由长dsRNA裂解而成的一种19-25nt的短片断双链RNA分子，能够以同源互 补序列的RNA为靶目标降解特定的mRNA， RNAi的关键效应分子 shRNAs:(small hairpin RNA )小发夹RNA 是设计为能够形成发夹结构的非编码小RNA分子，shRNA需通过载体导入细 胞后，然后利用细胞内的酶切机制得到siRNA而最终发挥RNA干扰作用。

《RNAi与基因沉默》课件

详细描述
在1990年代初期，科学家们发现双链RNA可以诱导基因沉默，但具体的机制和作用方式并不清楚。随着研究的 深入，人们逐渐揭示了RNAi的分子机制和生物学意义。在1998年，Andrew Fire和Craig Mello因为发现了 RNAi机制而获得了诺贝尔生理学或医学奖。
RNAi作用机制
总结词
RNAi过程中可能产生脱靶效应，影响实验 结果的准确性和可靠性。
体内应用难度
在体内应用RNAi技术时，面临如何将 siRNA有效递送到靶细胞的问题。
细胞毒性
某些RNAi分子可能对细胞产生毒性，影响 实验结果。
伦理和法规问题
在人类和动物实验中，需要考虑伦理和法规 问题，确保实验的合法性和道德性。
未来研究方向与展望
基因沉默与疾病
基因沉默与许多疾病的发生和发展密切相关。例如，肿瘤、神经退行性疾病和遗传性疾病等许多疾病都 涉及到基因沉默现象。因此，深入了解基因沉默的机制可以为这些疾病的治疗和预防提04
关系
RNAi在基因沉默中的作用
基因沉默的触发机制
RNAi通过降解目标mRNA或抑制其 翻译，在转录后水平上调节基因表达 ，从而触发基因沉默。
发展新型RNAi技术
针对现有技术的不足，发展更高效、 低毒、特异的RNAi技术。
拓展应用领域
将RNAi技术应用于更多领域，如神 经科学、免疫学等。
深入研究作用机制
深入探究RNAi的作用机制，为技术 的改进和应用提供理论支持。
加强法规监管
制定和完善相关法规和伦理规范，确 保RNAi技术的合理应用和健康发展 。
RNAi的作用机制是通过双链RNA诱导特异性mRNA的降解来实现基因沉默的。在细胞 内，dsRNA被切割成小干扰RNA（siRNA），这些siRNA与mRNA结合并诱导其降解

RNA干扰技术 (1)


优点：可以跳过检测和筛选有效 siRNA序列的步骤，为研究人员节 省时间和金钱。
缺点：有可能引发非特异的基因沉 默，特别是同源或者是密切相关的 基因。
用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA
Figure 2: siRNA production by ShortCut RNase III: (A) Varying amounts of ShortCut RNase III were incubated with 2 µg of a 500 bp dsRNA for 20 minutes. (B) dsRNA fragments (1 kb and 175 bp) were digested with ShortCut RNase III. Digests were analyzed by 20% TBE polyacrylamide gel electrophoresis.
补充：
Whitehead 研究所已研发了siRNA的自动选择方法，并于 网站：/bioc/siRNA/home.php 上向公 众开放．这个软件允许使用者定义序列基序和G/C含量， 并自动在人和鼠的基因组数据库中搜索siRNA序列，以 防错配。
疑难解答：
• 假如siRNA不起作用，应首先确定所使用的靶序列和细胞是 否来源于相同的组织。是否使用了错误的细胞系。 • 应确定用于进行RNAi的siRNA双链对选择的mRNA序列是否 可靠的，因后者可能包含序列上的错误、突变（如在癌细胞 中）或存在多态性。
二、 siRNA的合成
• 1、化学合成 • 2、体外转录 • 3、用RNase Ⅲ 消化长片断双链RNA制 备siRNA • 4、体内表达
《老子》说:“万物负阴而抱阳”； 《易经》说：“一阴一阳谓之道”。

RNA干扰


年 10 月 2 日 瑞典卡罗林斯卡医学院宣布，将
2006 年诺贝尔生理学，医学奖授予两名美国科 学家 安德鲁·菲尔和 克雷格·梅洛，以表彰 他们发现了RNA干扰现象。
2006年诺贝尔生理学或医学奖获得者
Andrew A.Fire
Craig C.Mello
• 1999年
Tuschl等
报道在哺乳动物中也存在RNAi
酶、核酸外切酶等多种成分组成。
蛋白复合体 siRNA RISC 活化的RISC siRNA解链
• 活化的 RISC在单链siRNA 引导下识别目的 mRNA，
并在RISC中的核酸内切酶作用下从 siRNA引导链
中心所对应的靶基因位置切割靶 mRNA ，最后可 能再被核酸外切酶进一步降解， 从而干扰基因表 达。
Discovery of RNAi
Nature 1998 391:806-811
Nature 1998 391:806811 原位杂交法检测胚胎 中mex-3 mRNA A:杂交液不含探针； B:未注射外源基因： C:注射反义RNA； D:注射dsRNA
Double-stranded RNA
antisense
子
目前应用的基因干扰技术
• mRNA水平的基因干扰技术
用反义RNA
性mRNA
技术阻遏翻译过程, 破坏内源 结合的蛋白
设计寡核苷酸来破坏与mRNA
质, 使mRNA 不稳定
双链RNA
干扰技术（RNAi）
一. 概述
RNAi是植物、果蝇、线虫和很可能包括哺乳动物 在内的许多生物抵抗病毒感染和限制转座子运动的 一种自然存在的防御机制。 RNAi 可以作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗 传工具，来制备特定基因缺失表型的个体 , 从而研 究该基因的功能。它正在功能基因组学领域掀起一
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效应阶段
RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性 结合，RISC具有核酸酶的功能，在ATP存在情况下， 在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反 义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降 解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。

扩增扩散阶段
⑥ATP依赖性：在去除ATP的样品中RNA干扰现象降 低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程。可能 是Dicer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量。

1、研究基因功能的新工具
RNA干扰的应用
线虫和果蝇的全部基因组序列已测试完毕，发现大量未知功能的新 基因，RNAi将大大促进对这些新基因功能的研究。与传统的基因敲除技术 相比，这一技术具有投入少，周期短，操作简单等优势。 2、开展基因治疗的新策略 RNAi具有抵抗病毒入侵，抑制转座子活动，防止自私基因序列过量 增殖等作用，因此可以利用RNAi现象产生抗病毒的植物和动物，并可利用 不同病毒转录序列中高度同源区段相应的dsRNA抵抗多种病毒。 3、进行药物筛选的工具
录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应 规模和量始终有一定的限制。

3. 用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA 4. siRNA表达载体 5. siRNA表达框架
RNAi具有的特征
①RNAi是转录后水平的基因沉默机制； ②RNAi具有很高的特异性，只降解与之序列相应的单 个内源基因的mRNA；
RNAi具有的特征
③RNAi抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到 缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分 子（数量远远少于内源mRNA的数量）就能完全抑制 相应基因的表达，是以催化放大的方式进行的；
RNAi具有的特征
④RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不 同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机 体以及可遗传等特点；


RNA干扰仍存在的问题
目前siRNA导入胞内的效率低下，如何有效将siRNA转 移入体内成为RNAi应用的最大障碍； 如何在目的基因序列上选择21-23nt左右的序列作为 siRNA 的模板，从目前的研究来看，序列的选择原则 尚不清楚； 目前RNAi 机制尚未完全阐明。
siRNA的特点：3’端均有2～3个 突出的核苷酸
效应阶段
siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和 反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内 切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默 复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。
RNA干扰作用机制
起始阶段
病毒基因、人工转入基因等外源 性基因随机整合到宿主细胞基因 组内，并利用宿主细胞进行转录 时，常产生一些dsRNA 这些dsRNA被胞质中的RNaseⅢ特 异核酸酶Dicer切割成多个具有特 定长度和结构的小片段RNA（大约 21～23 bp），即siRNA
siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可 作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNAdependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更 多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生 大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大， 最终将靶mRNA完全降解。
介绍人：高娜娜

1. RNA干扰的简介 2. RNA干扰的作用机制 3. RNA干扰具有的特征 4NA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进
化过程中高度保守的、由双链RNA（doublestranded RNA，dsRNA）诱发的、使同源mRNA高 效特异性降解的现象。即由双链RNA诱发的“基因沉 默”。
2.体外转录


相对化学合成法而言成本比较低，体外转录是一种性 价比高的筛选siRNAs的好方法。更重要的是能够更快 的得到siRNAs。 值得一提的是体外转录得到的siRNAs只要较低的浓度 就可以达到化学合成siRNAs较高浓度得到的效果。
不足之处：实验的规模受到限制，虽然一次体外转

RNAi研究的一般技术路线

获得SiRNA产物
1、化学合成

尽管化学合成是最贵的方法，但是却是最方便的——研究人 员几乎不需要做什么工作。许多公司都可以根据用户要求提 供高质量的化学合成siRNA。 主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。 由于价格比其他方法高，为一个基因合成 3—4 对 siRNAs 的 成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效 的序列再进行化学合成。 最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量 siRNA进行研究； 不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因 素
RNAi具有的特征
⑤dsRNA不得短于21个碱基，并且长链dsRNA也在 细胞内被Dicer酶切割为21 bp左右的siRNA，并由 siRNA来介导mRNA切割。而且大于30 bp的dsRNA 不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，而是细胞非 特异性和全面的基因表达受抑和凋亡；
RNAi具有的特征