脯氨酸含量测定

脯氨酸含量测定

在逆境条件下（旱、盐碱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸（proline，Pro）的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。

一、原理

用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。

二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料：待测植物（水稻、小麦、玉米、高粱、大豆等）叶片。（二）仪器设备：1. 722型分光光度计；2. 研钵；3. 100ml小烧杯；

4. 容量瓶；

5. 大试管；

6. 普通试管；

7. 移液管；

8. 注射器；

9. 水浴锅；10. 漏斗；11. 漏斗架；12. 滤纸；13 剪刀。

（三）试剂

1. 酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L 磷酸（8ml85%磷酸定容至20ml）中，搅拌加热（70℃水浴）溶解，

贮于（4度）冰箱中（2-3天有效）；

2. 3％磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml；（密封避光）

3. 冰醋酸；

4. 甲苯。

三、实验步骤

1. 标准曲线的绘制

（1）在分析天平上精确称取25mg（10mg）脯氨酸（-20度，现稀释现用），倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml(100ml)容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100μg。取此液10ml稀释至100ml,即成10ug/ml脯氨酸标准液。

（2）各试管中试剂加入量：

0 1 2 3 4 5 6

标准脯氨酸量0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0

蒸馏水 2 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0

冰乙酸 2 2 2 2 2 2 2

酸性茚三酮 2 2 2 2 2 2 2

（3）取7支试管按上表加入各试剂，每管在沸水浴中加热40min。（4）冷却后各试管准确加入5ml甲苯，振荡30S，静置10min，使色素全部转至甲苯溶液。（5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比

色。

（6）标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸浓度（X）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml测定液中脯氨酸的含量（μg/2ml）。

2. 样品的测定

（1）脯氨酸的提取：准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g(0.2)，分别置大管中，然后向各管分别加入5ml3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取过程中要经常摇动,使碎叶沉下去），冷却至室温后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。

（2）吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热40min，溶液即呈红色。（3）冷却后加入5ml甲苯，充分摇荡30S，静置10min，(取上层液至10ml离心管中，在3000rpm下离心5min。)

（4）用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色，求得吸光度值。

四、结果计算根据回归方程计算出（或从标准曲线上查出）2ml测定液中脯氨酸的含量（Xμg/2ml），然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式如下：

单位鲜重样品的脯氨酸含量（μg/g）＝[X×5/2]/样重*106*100%

备注：比色时留下空白，以便随时调零(在用分光光度计测定时，若期间有段时间不用，重新启用时，应重新调零）显色反应应2小时内测完，甲苯分层后尽量两小时内测完。