双缩脲法测定蛋白质浓度

三、操作
1、稀释血清的制备 准确吸取血清0.5mL，置于试管中，加入 0.9% NaCl（即生理盐水）4.5mL,混匀备用。 （血清稀释倍数是多少？5/0.5=10）
2.取三支试管按下表操作
试剂（mL） 蒸馏水
5mg/mL标准蛋白质溶液
空白管 标准 4.0 — — 1.0 4.0
稀释血清 双缩脲试剂 A540
混匀，放置30min后，用分光光度计在 540nm波长处比色，以空白管调零点，测定各 管吸光度。
四、计算
A测定 100 C标准 稀释倍数 血清蛋白质含量（g / 100 mL） A标准 1000
C标准 ：标准蛋白质溶液浓度，为5mg/mL
血清稀释倍数为10 （人的正常值：6～8g/100mL）
2.器材：
(1)试管及试管架； (2) 吸管； (3) 分光光度计。
试剂和器材 1.试剂
(1) 0.9％NaCl溶液即生理盐水； (2) 双缩脲试剂：称取1.5g 硫酸铜(CuSO4•5H2O) 和 6.0g酒石酸钾钠(NaKC4H4O6•4H2O) 溶于500mL蒸馏水 中，在搅拌下加入300 mL 10%NaOH溶液和1.0g KI， 最后用蒸馏水定容至1000mL。 (3) 标准蛋白质溶液(5mg/mL)：牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05mol/LNaOH配制。 (4) 待测蛋白质溶液：血清样本；
实验四 双缩脲法测定蛋白质含量
一、目的
掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法
二、原理
双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物， 在碱性溶液中双缩脲与硫酸铜反应生成紫红色 络合物，称为双缩脲反应。具有两个或两个以 上肽键的化合物都有双缩脲反应，因此蛋白质

一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。

在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。

凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。

测定范围为1~10mg蛋白质。

干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。

主要的缺点是灵敏度差。

因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

（二）试剂与器材1.试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml 的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。

如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。

牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。

（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4?5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。

此试剂可长期保存。

若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。

2.器材：可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。

（三）操作方法1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。

充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。

用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。

×
吸 光 度
× × ×
×
蛋白质浓度（mg/mL）
牛血清白蛋白标准曲线（双缩脲法）
吸光度-蛋白浓度现性方程：
实验试剂
双缩脲试剂；
标准溶液贮备液：2mg/mLBSA溶液 待测蛋白液：卵清蛋白液
实验操作
1. 标准曲线绘制工作表 管号 试剂 mL BSA
(2mg/mL)
0
1
2 0.6 2.4 2.0
3 0.9 2.1 2.0
4 1.2 1.8 2.0
5 1.5 1.5 2.0
6 1.8 1.2 2.0
未 未 知1 知2 3.0 0.0 2.0 3.0 0.0 2.0
0.0 0.3 3.0 2.7 2.0 2.0
dH2O 双缩脲试剂
充分混匀,30 min以内在540nm处测定吸收度. 蛋白质浓度
(mg/mL)
0.0 0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
A540nm
数据处理
标准曲线绘制：用坐标纸，以吸光度值对标准蛋白质浓度作图 Y：A540；X：蛋白质浓度(mg/mL),
坐标刻度：涵盖全部测定值，易于读取，适当反应实验精度
比例：适当，基本保证图形为正方形，容易进行数据处理 数据点标示：用X，O 等图形，其中心点为数据值 趋势线回归：常用一元回归方程；直接估计——使实验数据点 分布在拟合曲线的两侧，
直线方程拟合：任意选取拟合曲线上两点，求直线方程
未知样品浓度：测Βιβλιοθήκη 值应在标准曲线范围以内 吸光度值代入方程 稀释倍数
实验5
双缩脲法测定蛋白质浓度
实验目的
掌握比色法测蛋白质浓度原理及方法 学习标准曲线绘制和分光光度计使用

实验十一双缩脲法测定面粉中蛋白质的含量一、目的要求1．学习双缩脲法的基本原理及操作。

2．通过实验学会制作标准曲线。

二、实验原理：双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。

在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。

凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

在一定的浓度范围内，紫色络合物颜色深浅与蛋白质含量呈线性关系（即：颜色的深浅与蛋白质浓度成正比）而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可在540nm处比色用来测定蛋白质含量。

测定范围为1－10mg蛋白质/ml。

干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。

主要的缺点是灵敏度差。

因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

三、操作方法：1．标准曲线的制作。

酪蛋白：10mg/ml（如果用干酪素来配制则需用0.05M NaOH 做溶剂，也可以用酪蛋白酸水解物直接配制。

）管号 1 2 3 4 5 6酪蛋白(ml) 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2蒸馏水(ml) 2 1.6 1.2 0.8 0.4 0双缩脲试剂(ml) 3 3 3 3 3 3混匀，放置30分钟A540 0计算出各管浓度（计算出各管浓度，再做标准曲线，那么最后计算的公式中就不用除以6了，这么做好理解些。

）混匀，放置30分钟后，在540nm处以1号管调0点，测定各管吸光度，以吸光度（OD值）为纵坐标，蛋白质浓度（酪蛋白的毫克数）为横坐标绘制标准曲线。

四、样品处理1．0.25g小麦面粉＋0.5ml四氯化碳＋25ml双缩脲试剂（四氯化碳为有机溶剂，在这里作为分散剂，使面粉不成团。

）；2．加塞，在摇床上振摇30分钟，使之充分混匀、反应，然后于实验台上静置10分钟；3．离心，4000rPm，离心15分钟；4．取上清比色：OD 540 nm；（在用滴管取上清时要轻、缓，避免沉淀物上浮。