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无菌检验 方法学验证方案辽宁爱母医疗科技有限公司 2010 年 9 月文件名称 文件编号 起草部门无菌检验方法学验证方案起草人起草日期总页数 备注审核部门审核人生产技术部主管起草部门主管审批部门审批人总工办负责人质量部主管审核意见审核日期审批意见审批日期1、验证对象、范围及时间 2、目的 3、实施验证的人员分工及职责 4、可接受标准 5、验证操作方法 6、验证结论 7、结果分析与评价 8、漏项与偏差表 9、再验证周期 10、最终批准 11、附录目录1、验证对象及范围本实验是关于产品无菌检查试验的验证。
参照《中国药典2005年版》二部附录无菌检查方法进行试验。
结果采用直接接种法对人工污染的六种菌株进行试验，产品对枯草芽孢杆菌、生孢梭菌有不同程度的抑菌作用。
采用薄膜过滤法用0.9%氯化钠100mL进行样品稀释，然后用500mL的pH7.0氯化钠缓冲液分几次冲洗，可消除其抑菌成分。
验证结果应显示对产品无菌试验方法。
2、目的 本方案的目的在于为分析评价无菌检验方法，以确认采用适宜的检验方法。
3、实施验证的人员分工及职责表 1 无菌检验方法学验证小组职责分工验证职责负责部门负责人起草验证方案起草验证报告无菌检验方法学验证实施检验审核验证方案和验证报告批准验证方案和验证报告4、接受标准已对生化检验人员进行专业培训。
5、验证操作方法5、1 概述本产品为三类医疗器械无菌产品。
无菌检查法是对该产品质量控制的重要检查项目，《2005年版药典》要求建立产品的无菌检查法时要进行方法学的验证，来确认所采用的方法适用。
按照《中国药典2005年版》要求，以金葡球菌，铜绿假单胞菌，枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌，黑曲霉菌作为实验菌种，对甲磺酸罗哌卡因注射液无菌检查方法进行了验证实验。
5、2 验证主要文件文件名称编号实际情况《无菌工作服管理规程》AM·SMP·De23-05-I《初始污染菌检验》5、3 无菌服洗衣消毒灭菌程序纯化水浸泡加洗涤剂适量15 分钟洗涤脱水2 分钟纯化水漂洗消毒0.1 新洁尔灭浸泡 15 分钟纯化水漂洗5 分钟3 分钟脱水晾干放入无菌袋灭菌121℃，30min放入传递窗缓冲区指定地点5、4 取样 将浸有灭菌生理盐水的棉拭子在无菌服的门衣襟、袖上来回涂抹 10 次（往返为一次）采样面积为 5cm×5cm，将棉拭子放入 10ml 灭菌生理盐水的试 管中。
无菌检验方法验证无菌检查方法是为了检查药典要求无菌的制剂及其他制品是否无菌而建立的试验方法！至于无菌检查具体有哪些验证方法呢？下面就随店铺一起来了解下吧！无菌检验方法验证无菌检查方法验证一般分为前验证和再验证两种。
前验证，也称预验证，指在无菌分析方法正式使用前，按照预定验证方案进行的验证。
如果没有充分的理由，任何检查方法必须进行前验证。
再验证，指某一检查方法经过验证并在使用一段时间后进行的，旨在证实已验证状态没有发生飘移而进行的重新验证及对检查方法进行修订、改变时进行的验证。
通常一个无菌产品的检查流程为：首先基于产品的剂型、溶解度等性质，按照药典的要求确定是否需要进行前处理;然后根据产品的特性是否有抑菌性，确定是否需要增加去除产品抑菌性的方法;最后验证整个检查方法中用到的一切及试验过程中的每一个环节包括样品的预处理方式、检查过程、培养条件等均不影响样品中微生物的生长。
前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应是验证的重点。
供试品中抑菌活性的去除是当前验证工作的重点，尤其强调应充分验证供试品本身对微生物生长的影响。
(一)具体的验证方法如下：1. 菌种的选择无菌检查方法验证中通常选择以下6种试验中常用的控制菌的标准菌株，它们分别代表不同类型的菌种：枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501]代表药品中常见的污染菌——芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]代表革兰阳性菌、生孢梭菌 [CMCC(B)64 941]代表厌氧菌、大肠埃希菌[CMCC(B)44 102]代表革兰阴性菌、白色念珠菌[CMCC(F)98 001]代表酵母菌、黑曲霉菌 [CMCC(F)98 003]代表霉菌。
2. 菌液的制备接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30~35 ℃培养18~24h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，23~28℃培养24~48h，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。
贵州金玖生物有限责任公司验证方案及报告验证方案名称：直接接种无菌检查方法验证验证方案编号：验证完成日期：有效期：验证方案申请人: 日期: 年月日验证方案审核人: 日期: 年月日验证方案审批人: 日期: 年月日1 概述无菌检查法是为了检查药典要求无菌的制剂及其他制品是否无菌而建立的检查法，是作为批准无菌产品放行的检验或监督部门对无菌产品质量监督中的一个重要项目。
它是根据用于实验的培养基中是否有微生物生长来判定样品的无菌性，液体培养基变浑浊一般表明样品受微生物的污染。
基于微生物污染的不均匀性，使无菌检查法结果的可信度受许多因素制约，如抑菌因素、检查法、检验量、检查用的培养基质量、操作环境、无菌技术等。
检验方法的验证是现代质量保证体系中关系到质控技术、方法、手段的科学性、准确性的重要组成部分，是保证检验结果的公正、科学、准确的基础。
2 验证目的对本公司所采用的直接接种无菌检查法进行分析验证，以证明所采用的方法适合于本公司产品的无菌检查。
3 实验原理直接接种法是通过加入一定的抑菌中和剂，以方便而快捷地中和抑菌剂，消除抑菌作用，从而消除抑菌作用对无菌检查的影响。
本实验通过设计对照试验对直接接种法所加入的抑菌剂的中和效果进行验证，从而得出直接接种法无菌检验的有效性。
4 验证范围实用于本公司所采用的直接接种法进行的无菌检验过程验证。
56 职责7 验证内容建立样品组、对照组及菌种活性检查组，接种菌株到指定培养基，培养24~72小时，比较观察菌落的生长状况，得出结论。
8 验证指示物本实验所用菌种为购于贵州食品药品监督管理局标准菌株:大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念球菌及生孢梭菌。
9 实验过程（1）培养基的配制用于大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的营养琼脂培养基用于白色念球菌的改良马丁培养基用于生孢梭菌的流体硫乙醇酸盐培养基（2）供试品的制备术泰舒TM生物多糖冲洗胶液供试品：直接取成品10ml，加pH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为供试品。
无菌检查方法验证验证项目编号R-YZ-501-01年月验证机构云南德华生物药业有限公司质控部化验室负责部门：质控部验证小组成员：验证方案批准对验证方案批准表示同意其测试内容、测试方法和本方案内的各种表格格式、内容。
目录1.概述2.验证目的3.验证范围4.验证人员及职责5.文件准备和培训6.验证条件及验证时间安排7.验证依据8.验证过程9.评价标准10.验证过程评价11.验证结论12.建议无菌检查方法验证1.概述无菌检查是用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其它品种是否无菌的一种方法。
无菌检查工作量大、操作不规范、人员的知识匮乏、检查方法应用不当等都会导致试验失败，因此在对一个产品进行无菌检查之前应先对无菌检查方法进行验证。
2.验证目的2.1确认所用的无菌检查方法适用于“医用即溶止血纱布”的无菌检查。
2.2确保检查结果的准确性、可靠性、准确性和重新性以及检查方法的完整性。
2.3通过对不同批次产品无菌检查的比较，对医用即溶止血纱布产品的生产全过程进行质量监控。
3.验证范围医用即溶止血纱布产品的无菌检查。
4.验证人员及职责验证委员会负责验证项目的确定；质控部负责该验证方案的起草及组织实施；验证小组负责验证方案的审批；质控部参与验证的实施及监督。
验证小组成员：5.文件准备和培训5.1检查验证所需的各类文件资料，应齐全；相关的文件草案是否已具备。
5.2培训参加验证人员需进行本文件及下述内容的培训：微生物知识、无菌检查及微生物检验操作培训。
6.验证条件及验证时间安排6.1验证条件6.1.1检验公用系统验证及仪器安装完成；仪表量器经过校验合格，且在有效期内。
6.1.2供试品3批①②③6.1.3培养基及试剂：氯化钠：临用前配成0.9%浓度的溶液硫乙醇酸盐流体培养基批号：生产厂家：改良马丁培养基批号：生产厂家：营养肉汤培养基批号：生产厂家：改良马丁琼脂培养基批号：生产厂家：6.1.4验证用菌株：（来源：云南省药品检验所）金黄色葡萄球菌【CMCC（B）26003】铜绿假单胞菌【CMCC（B）10104】枯草芽孢杆菌【CMCC（B）63501】生孢梭菌【CMCC（B）64941】大肠埃希菌【CMCC（B）44102】白色念珠菌【CMCC（F）98001】6.1.5无菌检验仪器及相关设备压力蒸汽灭菌器型号：生产厂家：生化培养箱型号：生产厂家：霉菌培养箱型号：生产厂家：超净工作台型号：生产厂家：6.2验证时间验证小组提出完整的验证计划，经批准后实施，整个验证活动按下面时间安排完成。
食品微生物学检验
商业无菌检验能力验证技术方案
根据《新项目论证技术要求》，为保证此次能力验证数据准确，结果可靠，特制定如下技术方案：
一、检验依据
《食品微生物学检验商业无菌检验GB4789.26-2013》
二、检品
灭菌乳：取两个品牌的同品种产品
调制乳：灭菌工艺生产的产品
三、人员比对
灭菌乳A：a、b分别试验进行数据比对（双人双平行）；
灭菌乳B：c、a分别试验进行数据比对（双人双平行）；
调制乳：c、b分别试验进行数据比对（双人双平行）。
三、准备工作
仔细核对并灭菌本试验使用试剂、耗材以及玻璃容器等。
四、质量控制
1、按照国家标准规定准确称重并按照不同温度进行保藏或培养。
2、仪器设备性能和检测环境的确认
（1）依据《消毒与灭菌效果的评价方法与标准GB15981-1995》定期对高压蒸汽灭菌锅的灭菌效果进行检测评价并记录；
（2）依据《无菌室消毒灭菌操作规程》定期对对无菌室、生物安全柜、超净台、无菌衣进行清洁消毒灭菌；
（3）依据《实验室质量控制规范食品微生物检测GB/T27405-2008》定期对对无菌室、生物安全柜及超净台进行沉降菌检测并记录。
3、对照
每次实验均应进行低温对照确保实验数据的可靠性。
五、注意事项
1、实验人员要严格按照《无菌检查系统操作规程》进出无菌室；
2、严格按照《食品微生物学检验总则GB4789.1-2016》进行采样
和实验；
3、PH测定所用到的酸度计每次应进行校准；
4、本实验不包含商业无菌异常原因分析；。
注射液无菌检查的方法学验证方案注射液的无菌性是医疗领域中最为重要的质量指标之一。
为了确保注射液的无菌性，需要进行方法学验证方案。
本文将介绍一种常见的注射液无菌检查方法学验证方案，确保验证结果准确可靠。
一、验证目的本验证方案旨在验证注射液无菌性检查的方法学准确性和可靠性。
通过验证，可以确保注射液无菌性检查的结果符合预期，并为其他类似检查提供参考。
二、验证对象本验证方案适用于各类注射液无菌性检查方法，包括但不限于常规培养法、膜过滤法、试管法等。
三、验证步骤1. 制定验证计划：明确验证的目标、方法和时间安排等。
2. 准备样品和试剂：收集需要验证的样品和所需试剂，并确认其质量符合要求。
3. 合理布局实验室：确保实验室环境符合无菌实验要求，避免干扰因素的存在。
4. 实验操作：a) 样品准备：按照标准操作程序，制备样品，确保操作无菌。
b) 检测方法操作：按照所选的检测方法，依次进行实验，确保操作无误。
c) 平行实验：为了验证结果的可重复性，进行平行实验，确保结果一致。
5. 结果分析：根据实验结果进行数据统计和分析，得出结论。
6. 结果确认：将验证结果与预期目标进行比较，确认验证是否合格。
7. 编写验证报告：将整个验证过程、操作方法和结果总结编写成验证报告。
四、验证要求1. 严格遵守无菌技术操作规范。
2. 注射液样品的选择应具有代表性和典型性。
3. 实验室环境应符合无菌要求，避免外界干扰。
4. 检测方法的选择应根据实际情况和需求进行。
5. 实验操作过程要规范、准确，确保每个步骤符合方法要求。
6. 结果分析要科学、客观，数据统计要准确无误。
7. 结果确认应根据验证目标和标准进行判断。
8. 验证报告要详细、完整，包括验证目的、方法、结果和结论等。
五、验证结果分析根据实验结果的分析，可以判断注射液无菌性检查方法是否准确可靠。
如果验证结果符合要求并且与预期目标一致，则说明所选的检查方法具有可靠性和精准性。
如果验证结果与预期目标不一致，则需要进一步分析原因，寻找解决方案。
XXX无菌检验方法学验证方案
编号：VP.SV.039.00
目录
验证方案的审批
验证小组名单
验证实施进度
技术性文件
引言
1．概述
2．验证目的
3．职责
无菌检查方法学的确认
再验证周期
验证方案审批
验证小组名单
验证实施进度
技术性文件
引言
1.概述
1.1根据2010版《中华人民共和国药典》二部附录ⅪH规定，当建立药品的无菌检查方
法时，需进行方法学的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的检测。
当药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检测方法应重新验证。
2.验证目的：
2.1根据2010版《中华人民共和国药典》二部附录ⅪH无菌检查方法要求，通过试验，
寻找合适的材料、条件和方法，最终确定氧氟沙星滴眼液的检验方法，并将其定为日常检测的正式方法。
3.职责
3.1验证办
3.1.1负责验证方案的审批。
3.1.2负责验证的协调工作，以保证验证方案规定项目的顺利实施。
3.1.3负责验证数据及结果的审核。
3.1.4负责验证报告的审核。
3.1.5负责再验证周期的确认。
3.2质量监控部
3.2.1负责验证所需的标准品、样品、试剂、试液等的准备。
3.2.2负责仪器、仪表、量具的校正。
3.2.3负责取样及样品检验。
3.2.4负责收集各项验证、试验记录，对结果进行分析，起草验证报告，报验证办。
3.2.5负责拟订验证方案。
3.2.6负责组织试验所需设备。
3.2.7负责按照验证方案里各项操作步骤进行操作。
3.2.8负责保证设备的正常运转。
无菌检查方法学的确认
1.验证环境、设备及实验前准备：
1.1无菌室内（无菌检查应在环境洁净度B级下的局部洁净度A级的单向流空气区域或
隔离操作器内完成。
由QA人员定期按国家相关要求进行环境监控。
1.2仪器和设备：①GSP-9080MBE型隔水式电热恒温培养箱（上海博迅实业有限公司医疗
设备厂）；②生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；③AL204型电子天（梅
特勒—托利多仪器有限公司）；④GZX-9070MBE型电热恒温鼓风干燥箱（上海博迅实
业有限公司医疗设备厂）；⑤YXQ-LS-50SI型高压蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公
司医疗设备厂）；⑥HTY-2000A集菌仪、全封闭集菌培养器可重复使用集菌培养器（杭
州高得·泰林医疗器械有限公司）；⑦超净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备
厂)；。
⑧微孔滤膜（孔径0.45µm直径50mm）…
1.3供试品：
1.4所需培养基：
1.4.1硫乙醇酸盐流体培养基（细菌培养）；批号：050104；灵敏度：应符合定
厂家：北京三药科技开发公司；
改良马丁培养基（真菌培养）；批号：050106 ；灵敏度：应符合规定
厂家：北京三药科技开发公司；
营养琼脂培养基（分离单个菌落及传菌种）；厂家：北京三药科技开发公司；
改良马丁琼脂培养基（培养真菌及传菌种）；厂家：北京三药科技开发公司；
1.5稀释液、缓冲液：
0.9%氯化钠溶液；PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 (配制方法参照chp2005附录—90页)
1.6验证用菌种：金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]；大肠埃希菌[CMCC（B）44 102]
生孢梭菌[CMCC（B）64 941]；枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]；黑曲霉[CMCC（F）
98 003]；白色念珠菌[CMCC（F）98 001]。
（以上菌种均由湖北省药品检验所提供）1.7培养基的无菌检查：培养基配制好并采取验证合格的灭菌程序灭菌后随机取 5瓶
(管)，培养 14 天，结果应无菌生长。
2.方法学验证:
2.1简要方法说明：本品为喹诺酮类抗生素，通过抑制细菌的DNA旋转酶和DNA复制而发
挥作用。
对革兰阳性菌、革兰阴性菌均有较强的抗菌作用。
由于本品为液体眼用制剂，
且其组分中含强抑菌成分，故计划使用薄膜过滤法，以PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液
为冲洗液对本品进行方法学验证。
2.2检查方法：根据2010版《中华人民共和国药典》规定：凡供试品性状允许，应采用
薄膜过滤法。
（检验量：10瓶；供试品用量：20ml ；培养基用量：100ml 2.3菌液的制备：（1）接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物
至100ml营养肉汤中，30～35℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9%无菌氯化
钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法稀释，制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。
（2）接种白色念珠菌的新鲜培养物至100ml改良马丁培养基中，23～28℃培养24～
48小时，取此培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法稀释，
制成制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。
菌悬液。
（3）接种黑曲霉的新鲜培养
物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天，加入3-5ml含0.05%（ml）
聚山梨80的酯0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，用管口带有薄的无菌棉花的无菌
吸管吸出菌液，用装有脱脂棉的小漏斗过滤，除去菌丝后收集菌悬液，用接种环取1
环至10ml 0.9%无菌氯化钠溶液混匀，取0.1ml接种至改良马丁琼脂培养基，23～28℃
培养72小时培养后制成制成每1ml含菌数小于100cfu的孢子悬液。
（4）接种生孢梭
菌新鲜菌悬液用10倍递增稀释法接种至硫乙醇酸盐流体培养基中30～35℃培养18～
24小时，轻轻取此培养液，勿摇，观察培养基中悬挂的灯笼状菌落，计数，使菌数
制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。
2.4菌落计数，（结果见相关记录）
2.5取金黄色葡萄球菌菌液、大肠埃希菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液各1 m1分别接种于营
养琼脂培养基中，生孢梭菌接种至含1．5％琼脂的硫乙醇酸盐流体培养基中，30℃～
35℃生化培养箱培养24～48 h，取白色念珠菌菌液、黑曲霉菌液各1 m1分别接种至
改良马丁琼脂培养基中，经23℃一28~C霉菌培养箱培养48～72 h，计数。
(上述各
菌液分别接种两个平板，取平均值，同时设阴性对照)
2.6培养基接种取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于
100cfu的金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，枯草芽孢杆菌，生孢梭菌，各2支，另1
支不接种作为空白对照，培养3天，取每管9ml的改良马丁培养基5支，分别接种小
于100cfu的白色念球菌，黑曲霉各2支，另一支不接种作为空白对照，培养5天，
逐日观察结果。
2.7结果判断空白对照管应无菌生长，若加菌的培养管菌生长良好，判断该培养基
的灵敏度检查符合规定。
2.8供试液的制备：无菌操作，取供试品10瓶，注入无菌锥形瓶内混匀，取滴眼液原液
10ml供一株试验菌使用。
2.9试验组(样品+阳性) 取一次性全封闭集菌培养器(三联装)一套，先用少量pH7.0无菌
氯化钠-蛋白胨缓冲液润湿滤膜，取样品15瓶溶解于100ml缓冲液中，按薄膜过滤法过滤，样品过滤完毕后，再用pH7．0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，每次每管注入冲洗液100 ml，充分振摇，完全排空后，总冲洗量达到500 ml每管。
冲洗完毕后在2管中分别注人改良马丁培养基100 ml，另1管中注入硫乙醇酸盐流体培养基100 ml。
另取一套集菌培养器(三联装)取本品依上述方法过滤并冲洗后，均注入硫乙醇酸盐流体培养基100 ml，将上述6管集菌培养器移至阳性对照室，于含硫乙醇酸盐流体培
养基的集菌培养器中，分别接种金黄色葡萄球菌菌液、大肠埃希菌茵液、枯草芽孢杆菌菌液、生孢梭菌菌液各1 ml，于含改良马丁培养基的集茵培养器中，分别接种白
色念珠菌菌液和黑曲霉菌液各1 ml，按前述规定温度培养3～5 天，观察结果。
2.10阳性对照组取一次性全封闭集菌培养器(三联装)二套，4管中分别注入硫乙醇酸盐流
体培养基各100 ml、2管中分别注入改良马丁培养基各100 ml，在阳性对照室内将6种菌液分别接种至相应管内，作为阳性对照，按前述规定温度培养2～3 天，观察结果。
2.11阴性对照组取一次性全封闭集菌培养器(二联装)一套，滤过适量缓冲液后分别注入硫
乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基各100 ml，作为阴性对照，按前述规定温度
培养14 天，观察结果。
2.12样品的无菌检查取样品15支依上述方法同法操作，以500 ml／管的冲洗量冲洗，
加入培养基后，按规定温度培养14 天，逐日观察，若培养14 天均澄清；由此判定供试品符合规定。
2.13结果及记录：见相关报告
2.14结果判断：试验组各培养器中试验菌与阳性对照组比较均生长良好，说明该供试品
的该检验量在该检验条件下无抑菌作用（或其抑菌作用可忽略不计），可以照此检验方法和检验条件进行该供试品的无菌检查。
2.15如试验组各培养器中试验菌与阳性对照组比较至少有一种菌株生长微弱、缓慢或不
生长说明该供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采用增加冲洗量，或增加培养基用量，或使用中和剂或灭活剂，更换滤膜品种等方法，消除供试品抑菌作用，并重新进行方法学验证。
2.16结论：
检查人：日期：
复核人：日期：
验证小组负责人：日期：
验证小组负责人：日期：
再验证周期
1.当药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检测方法应重新验证。
