一、实验目的
为了探究不同种类抗生素的抑菌效果，本研究采用体外抑菌实验方法，对青霉素、氨苄西林、头孢克洛和氯霉素四种抗生素进行抑菌活性测试，为临床合理用药提供依据。
二、实验材料
1. 实验菌株：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等常见革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
2. 实验试剂：青霉素、氨苄西林、头孢克洛和氯霉素等抗生素粉末，琼脂、牛肉膏、蛋白胨、pH试纸、无菌生理盐水等。
3. 实验仪器：培养箱、恒温培养箱、电子天平、移液器、显微镜、培养皿、锥形瓶、滴管等。
三、实验方法
1. 菌株活化：将保存的菌株在适宜的培养基上培养24小时，备用。
2. 制备菌悬液：用无菌生理盐水将菌株稀释至适宜浓度，备用。
3. 制备抗生素溶液：分别将青霉素、氨苄西林、头孢克洛和氯霉素粉末用无菌生理盐水溶解，配制成一定浓度的抗生素溶液。
4. 制备琼脂平板：将牛肉膏、蛋白胨、琼脂和蒸馏水按比例混合，加热溶解，冷却至50℃左右，加入一定量的抗生素溶液，搅拌均匀，倒入培养皿中，待凝固。
5. 涂布菌悬液：用无菌棉签将菌悬液均匀涂布在琼脂平板表面。
6. 抑菌实验：将涂布好菌悬液的琼脂平板放入培养箱中，分别加入青霉素、氨苄西林、头孢克洛和氯霉素纸片，培养24小时。
7. 观察结果：观察平板上的抑菌圈直径，记录数据。
四、实验结果
1. 青霉素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的抑菌圈直径分别为：15mm、10mm和8mm。
2. 氨苄西林对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的抑菌圈直径分别为：10mm、8mm和6mm。 3. 头孢克洛对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的抑菌圈直径分别为：12mm、9mm和7mm。
4. 氯霉素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的抑菌圈直径分别为：18mm、15mm和13mm。
五、实验结论
1. 青霉素、氨苄西林、头孢克洛和氯霉素均具有较好的抑菌效果。
2. 氯霉素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的抑菌效果最好，其次是青霉素、头孢克洛和氨苄西林。
《生物工程综合实验平台》
——《抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验》
专业班级：
学 号：
姓 名：
小组成员：
实验日期：5月27日-5月30日
微生物综合实验
抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验
班级16级生物技术1、2班 姓名
学号 座位号
实验日程安排
日期 开始时间 实验内容 备注
5月27日（周一） 14:30-15:30 实验背景、原理、方法讲解
15:30-18:00 分组准备试剂、培养基、实验器具
5月28日（周二）
上午 8:00-8:30 体内抑菌实验细菌接种、培养
8:30-10:30 体外抑菌实验：MIC法
10:30-11:40 固体培养基的配制、体外抑菌实验：纸片法、
5月28日（周二）
下午 12:30-13:30 体内抑菌实验：4小时实验组稀释涂布
5月28日（周二）
晚上 20:00-21:00 体内抑菌实验：12小时实验组稀释涂布
5月29日（周三）
上午 10:00-12:00 体内抑菌实验：24小时实验组稀释涂布；
体外抑菌实验：纸片法、MIC法结果观察，分析；
5月30日（周四）
上午 8:30-12:00 体内抑菌实验：4小时、12小时、24小时实验组结果观察、分析；
所有实验结果的统计与讨论
抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验
一、实验原理
抗菌药物一般是指具有抑菌或杀菌活性的药物，包括各种抗生素、磺胺类、咪唑类、硝基咪唑类、喹诺酮类等化学合成药物。由细菌、放线菌、真菌等微生物经培养而得到的某些产物，或用化学半合成法制造的相同或类似的物质，也可化学全合成。抗菌药物在一定浓度下对病原体有抑制和杀灭作用。
体外抑菌实验方案
一、实验目的
1.探究不同抑菌剂对特定细菌的抑制效果。
2.优化抑菌剂的配方，提高抑菌效率。
3.为临床应用提供理论依据。
二、实验材料
1.实验菌株：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌等。
2.抑菌剂：酒精、碘伏、过氧化氢等。
3.实验器材：培养皿、移液器、酒精灯、生物安全柜等。
三、实验方法
1.菌株活化：将实验菌株从冻存管中取出，接种至斜面培养基，37℃培养24小时。
2.制备菌液：将活化后的菌株用无菌生理盐水洗涤，调整菌液浓度为10^6CFU/mL。
3.抑菌剂配制：按照实验设计，配制不同浓度和配比的抑菌剂。
4.抑菌实验：在生物安全柜中，将菌液均匀涂布于培养皿，加入不同抑菌剂，置于37℃培养箱培养24小时。
5.观察结果：观察各培养皿中细菌生长情况，记录抑菌效果。
6.数据处理：统计分析各抑菌剂的抑菌效果，计算抑菌率。
四、实验步骤
1.活化菌株：从冰箱取出金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌等菌株，接种至斜面培养基，放入37℃培养箱培养24小时。 2.制备菌液：将活化后的菌株用无菌生理盐水洗涤，调整菌液浓度为10^6CFU/mL。
3.配制抑菌剂：按照实验设计，配制酒精、碘伏、过氧化氢等抑菌剂的不同浓度和配比。
4.抑菌实验：在生物安全柜中，将菌液均匀涂布于培养皿，加入不同抑菌剂，放入37℃培养箱培养24小时。
5.观察结果：观察各培养皿中细菌生长情况，记录抑菌效果。
6.数据处理：统计分析各抑菌剂的抑菌效果，计算抑菌率。
五、实验结果
1.不同抑菌剂对金黄色葡萄球菌的抑制效果：酒精浓度为75%时，抑菌效果最佳，抑菌率为99.99%；碘伏浓度为5%时，抑菌率为99.95%。
2.不同抑菌剂对大肠杆菌的抑制效果：过氧化氢浓度为3%时，抑菌效果最佳，抑菌率为99.99%；酒精浓度为75%时，抑菌率为99.90%。
3.不同抑菌剂对白色念珠菌的抑制效果：碘伏浓度为5%时，抑菌效果最佳，抑菌率为99.99%；过氧化氢浓度为3%时，抑菌率为99.95%。
抑菌试验方法总结
用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。通过抑菌实验，可以测定一个药物的最低抑菌浓度，用以评价该药物的抑菌性能，这是抗菌药物的最基本的药效学数据。主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。
1、定性测定
（1）纸片扩散法(disk diffusion test)，K-B法： WHO推荐的全球统一的标准方法。
原理：含有定量抗菌货物的纸睡帖在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
质控：标准菌株的抑菌圈直径应落在预期范围内，如果超出该范围，应视为失控而予以纠正。
影响因素：培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具的精度和质控菌株本身的药敏特性等均能影响试验结果的准确性。
操作方法：
按每1000 ml蒸馏水称取Muller-hinton Agar 38 g配备M—H琼脂，按每个平皿(直径9
mm)25 ml进行分装。
将孵育16—24 h的菌种分别接种生理盐水试管中，校正浓度至0.5麦氏标准(相当于1.0×108 CFU／m1)。
用无菌棉签拭蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在M—H琼脂表面，均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周。
平板在室温下干燥3—5 min后用无菌镊子将药物纸片紧贴于琼脂表面．置35℃孵育16
18 h。记录抑菌圈的直径，实验。重复10次。
主要用于比较不同抗菌物质，或者通过不同方法提取的同一种物质的效果。
（2）打孔法药敏实验：
待M—H平板干后，用无菌棉签蘸取菌液(相当于1.0×108 CFU／m1)，在培养基平板上密集划线接种。盖好平皿。放置5 min，待平板表面水分吸收后，用直径6 mm无菌金属打孔器在平皿内打孔。除去洞内琼脂，用微量移液器吸取50μl第二次浓缩液加入洞内，37℃培养16~18 h，记录抑菌圈的直径。实验重复10次。
