菌种保存方法

菌种保藏

（一）、菌种保藏的目的

微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡，因而常常造成菌种的衰退，并有可能使优良菌种丢失。菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。

（二）、菌种保藏的原理

无论采用何种保藏方法，首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。其次，应根据微生物生理、生化特点，人为地创造环境条件，使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧，另外，避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果。

（三）、菌种保藏的方法

1、斜面低温保藏法

将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存6个月左右，无芽孢的细菌可保存1个月左右，酵母菌可保存3个月左右。如以橡皮塞代替棉塞，再用石蜡封口，置于4℃冰箱中保藏，不仅能防止水分挥发、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。这一改进可使菌种的保藏期延长。

该法的优点是简便易行，容易推广，存活率高，故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法。其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。

2、石蜡油封藏法

此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端lcm，使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。使用的液体石蜡要求优质无毒，化学纯规格，其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸汽灭菌60～80min，再置于80℃的烘箱内烘干除去水分。

菌种保存方法：

一.菌种保藏方法大致可分为以下几种：

1．传代培养保藏法

又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6

℃冰箱内保存。

2．液体石蜡覆盖保藏法

是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖

灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进

入，以减弱代谢作用。

3．载体保藏法

是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例

如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。

4．寄主保藏法

用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须

在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒

等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。

5．冷冻保藏法

可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）

等保藏法。常用的有甘油菌保存：取灭过菌的1.5mlEP管，按照60%—80%甘油的加入量，保存零下80度。例：取37°培养

过夜的菌液2-4ml甘油6-8ml，充分混匀后分装于1.5mlEP管中，置于-80°冰箱即可。

6．冷冻干燥保藏法

先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真

空干燥）。

有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，

以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产

生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。

二.常用的器材

所要保存的微生物；

肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，

河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙；

灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100

菌种保存、传代、使用、销毁管理规程,操作规程

传代用菌种采用甘油冷冻管保存法。将菌种接种在适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，将菌液混合甘油并分装至冷冻管中，冷冻管标注菌种名称、代数、保存日期等信息，然后放置于-80℃冰箱中保存。每年进行一次复苏和传代，保存时间不超过5年。

5.3.2.2液体石蜡保存法

对于一些难以保存的菌种，采用液体石蜡保存法。将菌种接种在适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，将菌液混合液体石蜡并分装至玻璃瓶中，瓶口用铝箔密封，标注菌种名称、代数、保存日期等信息，保存温度为-70℃。每年进行一次复苏和传代，保存时间不超过5年。

5.4菌种的传代

传代用菌种每年进行一次复苏和传代。复苏后，将菌种接种至适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，按照规定的传代代数制备传代用菌种，并及时更新菌种库存记录。

5.5菌种的使用 使用菌种前，应先确认菌种的品质和纯度，并按照规定的传代代数制备工作用菌种。使用后，应及时更新菌种库存记录，并进行相应的消毒处理。

5.6菌种的销毁

菌种在使用过程中，如出现变异或污染等情况，应及时进行应灭活处理，并填写《菌种销毁记录表》，经主管部门审核同意后，进行销毁处理。菌种库存中长期未使用的菌种，应定期进行清理和销毁处理。

菌复苏、复壮；

Sabouraud葡萄糖琼脂培养基：用于白色念珠菌复苏、复壮；

青霉素-链霉素琼脂培养基：用于铜绿假单胞菌复苏、复壮。

5.4.1.1.3复苏步骤：

1.取出保存好的菌种管，用接种针在酒精灯上消毒；

2.将接种针在75%酒精中消毒，再用酒精棉球擦拭消毒；

3.用接种针在相应的培养基上进行接种；

4.置于适宜温度下孵育，待菌落出现后进行传代或进行实验。

5.4.1.2标准菌株的确认

通过形态学、生理生化特性、分子生物学等方法进行鉴定，确认菌株的纯度和种属。

5.4.1.3标准菌株的传代

将菌株从原始保存方式中转移到新的保存方式中，确保菌株的保存和传承。传代次数不宜过多，一般不超过10代。

菌种保藏方法

菌种保藏方法

菌种保藏是指将某一种菌株或菌种保存在一定的条件下，以便长期保存并用于研究或应用。菌种保藏的目的是为了防止菌株的变异和降低其性状的丧失，以便在需要的时候能够重新培养出相同或相似的菌株。下面将介绍几种常见的菌种保藏方法。

一、冷冻保藏法

冷冻保藏法是将菌种保存在低温条件下，一般为-80℃或液氮温度。这种方法比较简单，操作方便，且保存效果较好。首先，将菌株从培养基上接种到含有10%-15%甘油的液体培养基中，然后用无菌冻存管将菌液分装好，经过冷冻机或液氮罐进行冷冻保存。在需要使用菌株时，只需将冻存管快速解冻并转移到新的培养基上即可。

二、真菌分生孢子的枯燥保存法

真菌的分生孢子经过枯燥保存后，能够在相对湿度较低的条件下长期保存。这种保存方法主要适用于真菌，特别是产生分生孢子的真菌。首先，从培养基上接种分生孢子，培养出菌丝后进行枯燥处理。一般采用短暂的枯燥处理，依靠菌丝中的水分进行干燥。然后将枯燥的菌丝放置在无菌瓶中密封保存，放在相对湿度低于30%、温度介于10℃和25℃之间的干燥环境中。

三、气干法

气干法是将菌株保存在干燥剂中，以保持菌株的活力。这种方法适用于较短时间的菌种保存。首先，将菌株从培养基上接种到含有干燥剂的培养基中，待培养基中的水分被干燥剂吸收后，将菌株封存在密封袋或密封瓶中。干燥剂一般选择无水硅胶或干燥剂片，确保环境的干燥程度。

四、冷藏法

冷藏法是将菌株保存在低温条件下，一般为4℃至10℃之间。这种方法适用于细菌、酵母和一些真菌的保存。菌株保存在含有15%-30%甘油的稀释培养基中，然后在低温条件下保存。需要使用时，只需从低温保存中取出，接种到新的培养基中即可。

总结起来，菌种保藏是一项重要的科研工作，不同的菌种可以采用不同的保藏方法。冷冻保藏法适用于大部分微生物的保存，真菌的分生孢子的枯燥保存法适用于真菌的保存，气干法适用于较短时间的保存，冷藏法适用于细菌、酵母和一些真菌的保存。科学的菌种保藏方法可以保证菌株的长期保存和有效利用，为科研和应用提供了有力的支持。