菌种保存操作方法

菌种保藏

（一）、菌种保藏的目的

微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡，因而常常造成菌种的衰退，并有可能使优良菌种丢失。菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。

（二）、菌种保藏的原理

无论采用何种保藏方法，首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。其次，应根据微生物生理、生化特点，人为地创造环境条件，使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧，另外，避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果。

（三）、菌种保藏的方法

1、斜面低温保藏法

将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存6个月左右，无芽孢的细菌可保存1个月左右，酵母菌可保存3个月左右。如以橡皮塞代替棉塞，再用石蜡封口，置于4℃冰箱中保藏，不仅能防止水分挥发、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。这一改进可使菌种的保藏期延长。

该法的优点是简便易行，容易推广，存活率高，故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法。其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。

2、石蜡油封藏法

此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端lcm，使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。使用的液体石蜡要求优质无毒，化学纯规格，其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸汽灭菌60～80min，再置于80℃的烘箱内烘干除去水分。

菌种保存、传代、使用、销毁管理规程,操作规程

传代用菌种采用甘油冷冻管保存法。将菌种接种在适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，将菌液混合甘油并分装至冷冻管中，冷冻管标注菌种名称、代数、保存日期等信息，然后放置于-80℃冰箱中保存。每年进行一次复苏和传代，保存时间不超过5年。

5.3.2.2液体石蜡保存法

对于一些难以保存的菌种，采用液体石蜡保存法。将菌种接种在适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，将菌液混合液体石蜡并分装至玻璃瓶中，瓶口用铝箔密封，标注菌种名称、代数、保存日期等信息，保存温度为-70℃。每年进行一次复苏和传代，保存时间不超过5年。

5.4菌种的传代

传代用菌种每年进行一次复苏和传代。复苏后，将菌种接种至适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，按照规定的传代代数制备传代用菌种，并及时更新菌种库存记录。

5.5菌种的使用 使用菌种前，应先确认菌种的品质和纯度，并按照规定的传代代数制备工作用菌种。使用后，应及时更新菌种库存记录，并进行相应的消毒处理。

5.6菌种的销毁

菌种在使用过程中，如出现变异或污染等情况，应及时进行应灭活处理，并填写《菌种销毁记录表》，经主管部门审核同意后，进行销毁处理。菌种库存中长期未使用的菌种，应定期进行清理和销毁处理。

菌复苏、复壮；

Sabouraud葡萄糖琼脂培养基：用于白色念珠菌复苏、复壮；

青霉素-链霉素琼脂培养基：用于铜绿假单胞菌复苏、复壮。

5.4.1.1.3复苏步骤：

1.取出保存好的菌种管，用接种针在酒精灯上消毒；

2.将接种针在75%酒精中消毒，再用酒精棉球擦拭消毒；

3.用接种针在相应的培养基上进行接种；

4.置于适宜温度下孵育，待菌落出现后进行传代或进行实验。

5.4.1.2标准菌株的确认

通过形态学、生理生化特性、分子生物学等方法进行鉴定，确认菌株的纯度和种属。

5.4.1.3标准菌株的传代

将菌株从原始保存方式中转移到新的保存方式中，确保菌株的保存和传承。传代次数不宜过多，一般不超过10代。

菌种复苏传代保存操作规程

菌种复苏传代保存是微生物实验室中常见的操作之一，其目的是将冷冻保存的菌种从冷冻状态中恢复出来，并按照一定的方法传代保存。以下是菌种复苏传代保存操作规程，共1200字。

一、实验准备

1.1 准备所需物资：包括菌种冻存试管、培养基、称量仪器、吸管、移液器、贴标纸等。

1.2 检查完整的实验设备：包括洁净台、离心机、培养箱、移液枪等，确保设备无损坏。

1.3 检查所需培养基的质量：检查培养基的配制日期、有效期等，确保培养基适用于所需菌种。

二、复苏菌种

2.1 取出含菌种的冻存试管：从冷冻保存箱中取出所需菌种的冻存试管，并将试管放置于洁净台上。

2.2 快速复苏：将冻存试管置于培养基底部，用力旋转数次，使菌种快速复苏。

2.3 开孔放气：用火焰消毒后的吸管尖端取出菌种后将其放入含菌种的冻存试管中，并迅速封闭试管口，以防菌种污染。 2.4 培养基选择：根据菌种类型的不同，选择相应的培养基进行培养。如需选择无菌培养基时，需要在使用前先进行灭菌处理。

2.5 培养条件：将含菌种的试管放入预先灭菌处理过的培养基中，确保培养基将菌种完全覆盖，并在适当的培养条件下培养，包括温度、湿度、光照等。

三、传代保存

3.1 菌种鉴定与纯化：复苏后的菌种应进行鉴定与纯化，以确保菌种的纯度和正确性。

3.2 菌种传代：将复苏后的菌种接种到新的培养基中，进行传代培养。传代时应注意传代次数，一般不超过10次。

3.3 传代培养条件：传代时应保持相同的培养条件，以保证菌种的生长状态和性状的稳定。

3.4 保存方式选择：根据菌种的特性和实验需求，选择适当的保存方式，包括持续传代培养、冷冻保存、冷冻干燥等。

3.5 标识和记录：每次传代后，应及时贴标记于保存容器上，并记录传代时间、次数和相关信息，以便后续使用和管理。

四、实验安全与废弃物处理

4.1 实验环境安全：在进行菌种复苏传代保存操作时，应注意实验室的环境安全，保持实验室干净、整洁，并严格遵守实验室操作规范。 4.2 安全操作：在操作过程中，要严格遵守无菌操作规范，避免菌种污染或实验人员感染。

- 1 - 现行的菌种保藏方法

常规冷冻保藏是将菌种在培养基中生长到对数生长期，加入等体积的甘油后，在-70℃以下的冰箱内保存。这种方法保存时间较短，通常为半年至一年不等。

低温冷冻保藏是将菌种在培养基中生长到对数生长期，加入一定比例的冻干保护剂（如蔗糖、缓冲液等），在-80℃以下的超低温冰箱内保存。这种方法保存时间较长，可达数年甚至十年以上。

干燥保藏是将菌种在培养基中生长到对数生长期，经过适当的处理（如洗涤、离心、吹干等），在干燥剂的包装中保存。这种方法保存时间较长，也可达数年至十年以上。

液氮冷冻保藏是将菌种在培养基中生长到对数生长期，加入一定比例的冻干保护剂，经过冷冻干燥处理后，放入液氮中保存。这种方法保存时间最长，可达数十年甚至百年以上。

以上不同的保藏方法应根据菌种的特点和需求进行选择，以确保菌种能够长期保存并保持其生物学特性。