细胞增殖-毒性检测(CCK8试剂盒法)操作步骤_MedChemExpress

CCK_8操作说明及检测步骤CCK-8是一种常用的细胞增殖和细胞毒性检测方法，该方法通过评估细胞内脱氢酶的活性来间接反映细胞的代谢活性。

其操作步骤如下：1.常规细胞培养选择要测试的细胞系，并在合适的培养基中进行培养。

通常使用细胞培养瓶或培养皿，并在37摄氏度的培养箱中保持恒定的温度。

确保培养基中含有足够的养分和补充物，以支持细胞的正常生长和代谢。

2.细胞计数和均匀分布细胞生长到适当的密度后，使用显微镜和细胞计数板计数细胞数目。

根据需求，将细胞以适当比例分装到不同的瓶中，再将细胞以适当比例分装到96孔板中，以保证每个孔中的细胞数量和均匀分布。

3.平台适应性试验在进行正式的实验前，可以进行平台适应性试验。

为此，将不同细胞浓度的细胞悬液加入到96孔板中，并使用CCK-8试剂进行处理。

根据CCK-8处理后的细胞的吸光度读数，选择适当的浓度范围和时间点进行后续实验。

4.细胞处理在进行CCK-8实验之前，确保细胞在适当的生长条件下。

将上一步骤中准备好的细胞悬液加入到96孔板中，使每个孔中的细胞数目均匀分布。

可以提前设计不同实验组的处理方式，如对照组、实验组和阴性对照组等。

K-8处理按照CCK-8试剂说明书的建议将CCK-8试剂加入到96孔板中的每个孔中。

通常建议每个孔中加入10%的CCK-8试剂，并与细胞悬液充分混合。

注意避免气泡的产生。

6.孵育将96孔板放置在37摄氏度的培养箱中，孵育一段时间。

孵育时间可以根据实验要求设定，通常为1-4小时。

7.吸光度测量使用酶标仪或多功能板读取器测量每个孔的吸光度值。

通常使用450纳米的波长进行测量。

根据吸光度值的变化，可以评估细胞的代谢活性，并进行细胞增殖或毒性分析。

通过以上步骤，可以使用CCK-8试剂评估细胞的增殖和毒性。

这种方法快速、简单且灵敏，被广泛应用于细胞实验中。

需要提醒的是，在进行实验前要仔细阅读CCK-8试剂的使用说明，并根据实际情况进行操作。

CCK_8操作说明及检测步骤CCK-8是一种常用的细胞增殖和细胞毒性检测方法，可以评估药物、毒物和其他试剂对细胞增殖的影响。

本篇文章将介绍CCK-8实验的操作说明及检测步骤。

实验材料：1.细胞培养物：包括细胞培养基和要检测的细胞系。

K-8试剂盒：包括CCK-8试剂和添加剂（如无血清培养基）。

实验步骤：1.细胞预处理：a.将细胞接种在培养皿中，使其达到对数生长期。

b.用PBS洗涤细胞，以去除培养基中的血清和其他杂质。

c.加入细胞培养基（如无血清培养基）孵育一天以适应新的生长条件。

K-8溶液的制备：a.从CCK-8试剂盒中取出所需量的CCK-8试剂。

b.按照试剂盒说明书中的方法，将CCK-8试剂溶解于适当的溶剂中，以获得CCK-8溶液。

3.细胞处理：a.在细胞培养皿中加入适量的处理组（含药物/毒物/试剂）和阴性对照组（不含处理）。

b.孵育细胞以使其与处理组接触，一般孵育24小时。

c.如果需要在不同时间点进行测量，可以设置不同的处理时间。

4.检测步骤：a.将培养皿从孵育器中取出，加入CCK-8溶液。

一般将CCK-8溶液与培养基混合，使浓度为10%。

b.返回孵育器中继续孵育15至60分钟，以使CCK-8溶液充分与细胞相互作用。

c. 使用酶标仪测量细胞的吸光度。

一般使用450nm波长进行检测。

d.记录各处理组的吸光度值。

5.数据分析：a.根据实验要求，选择合适的数据分析方法。

常用的包括比较各示踪实验组与阴性对照组之间的吸光度差异，或者使用半数抑制浓度（IC50）来评估样品对细胞增殖的影响。

b.绘制呈现实验结果的图表和图形。

c.进行统计分析，如t检验或方差分析，并计算显著性水平。

注意事项：1.操作前应严格按照实验室安全规定进行，佩戴实验室所需的个人防护设备。

2.在各步骤中，应尽量避免细胞暴露在环境中的时间过长，以减少细胞的应激反应。

3.操作时要注意使用无菌环境和无菌操作，以防止细胞污染。

4.实验中的所有操作必须根据实验室方法进行，避免任何操作的偏差。

如有侵权请联系网站删除细胞增殖-毒性实验步骤1、细胞传代、细胞计数、细胞增殖-毒性实验步骤：实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线消毒30分钟（枪、枪头、15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复温实验所需试剂［细胞培养液（DMEM、1640）、磷酸缓冲盐溶液（PBS、胰酶（0.25% Trypsin-EDT）胎牛血清（FBS、双抗］，所有的试剂、仪器放入生物安全柜前要用酒精喷洒消毒。

显微镜下看细胞生长状态，有无污染。

1、倒去培养瓶内的培养液；2）加入PBS 2ml洗涤培养瓶内细胞2次；3）加入胰酶500ul/0.5ml 2〜10min （具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）；4）加入含10%FBS勺培养液1〜1.5ml［培养液：胰酶=（2〜3）:1］中和胰酶；5）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜；6）将单细胞悬液吸入10〜15ml离心管中，低速离心800rpm 3分钟，倒去上清液；7）加入含10%FBS ffl胞培养液1〜2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液；8）吸取20ul细胞悬液（10ul细胞悬液+10ul台盼兰液：给坏死细胞染色，判断细胞活力）至细胞计数板，进行细胞计数；CCK-8实验：9）在96孔板中，给每孔加100卩L （约7000个）的细胞悬液，将培养板放在培养箱预培养24-72 小时（37 C，5%CO2,使细胞贴壁；10）向培养板中加入10卩L不同浓度（5、10、20、40、80、160ug/ml）的待测药物；11）将培养板在培养箱孵育一段适当的时间24小时（例如：6、12、24或48小时）（药物起作用）；注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。

当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

DOJIN‎D O操作说‎明细胞活性检‎测1.在96孔板中接种‎细胞悬液(100 ml /孔)。

将培养板放‎在培养箱预‎培养(在37℃，5% CO2的条‎件下)。

2.向每孔加入‎10 ml的CCK- 8溶液(注意不要在‎孔中生成气‎泡，它们会影响‎O.D值的读数‎)。

3.将培养板在‎培养箱内孵‎育1-4小时。

4.用酶标仪测‎定在450‎nm处的吸‎光度。

5.如果暂时不‎测定O.D值，打算以后测‎定的话，可以向每孔‎中加入10 ml 0.1 M HCl溶液‎或者1% w/vSDS溶液，并遮盖培养‎板避光保存‎在室温条件‎下。

在24小时内‎吸光度不会‎发生变化。

细胞增殖-毒性检测1. 在96 孔板中配制‎100 ml的细胞‎悬液。

将培养板在‎培养箱预培‎养 24小时 ( 在37℃， 5% CO2的条‎件下 )。

2. 向培养板加‎入10 ml不同浓‎度的待测物‎质。

3. 将培养板在‎培养箱孵育‎一段适当的‎时间 (例如: 6,12, 24 或48小时‎)。

4. 向每孔加入‎10 ml CCK-8 溶液 (注意不要在‎孔中生成气‎泡，它们会影响‎O.D值的读数‎)。

5. 将培养板在‎培养箱内孵‎育 1-4小时。

6. 用酶标仪测‎定在450‎nm处的吸‎光度。

7. 如果暂时不‎测定O.D值，打算以后测‎定的话，可以向每孔‎中加入 10 ml 0.1 M HCl溶液‎或者1% w/vSDS 溶液，并遮盖培养‎板避光保存‎在室温条件‎下。

在 24小时内‎吸光度不会‎发生变化。

注意：如果待测物‎质有氧化性‎或还原性的‎话，可在加 CCK-8之前更换‎新鲜培养基‎，去掉药物的‎影响。

当然药物影‎响比较小的‎情况可以不‎更换培养基‎，直接扣除培‎养基中加入‎药物后的空‎白吸收即可‎。

制作标准曲‎线1. 先用细胞计‎数板计数所‎制备的细胞‎悬液中的细‎胞数量，然后接种细‎胞。

2. 按比例 ( 例如：1/2比例 ) 依次用培养‎基等比稀释‎成一个细胞‎浓度梯度，一般要做 3-5个细胞浓‎度梯度，每组3-6个复孔。

CCK8检测细胞增殖/毒性的原理
Cell Counting Kit-8
●原理：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝
基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。

生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。

因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

●方法
1、制备细胞悬液：细胞计数
2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数（每孔5000细胞），每孔约100ul 细胞悬液，同样的样本可做3个重复。

3、37℃培养箱中培养：24h-48h
4、加入10ul CCK8,孵育2-4h
5、测定450nm吸光度。

DOJINDO操作说明细胞活性检测1.在96孔板中接种细胞悬液(100 ml /孔)。

将培养板放在培养箱预培养(在37℃，5% CO2的条件下)。

2.向每孔加入10 ml的CCK- 8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响O.D值的读数)。

3.将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

4.用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

5.如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10 ml 0.1 M HCl溶液或者1% w/vSDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。

在24小时内吸光度不会发生变化。

细胞增殖-毒性检测1. 在96 孔板中配制 100 ml的细胞悬液。

将培养板在培养箱预培养 24小时 ( 在37℃， 5% CO2的条件下 )。

2. 向培养板加入10 ml不同浓度的待测物质。

3. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间 (例如: 6,12, 24 或48小时 )。

4. 向每孔加入10 ml CCK-8 溶液 (注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 O.D值的读数) 。

5. 将培养板在培养箱内孵育 1-4小时。

6. 用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

7. 如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入 10 ml 0.1 M HCl溶液或者1% w/vSDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。

在 24小时内吸光度不会发生变化。

注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加 CCK-8之前更换新鲜培养基，去掉药物的影响。

当然药物影响比较小的情况可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

制作标准曲线1. 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。

2. 按比例 ( 例如：1/2比例 ) 依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做 3-5个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。

3. 接种后培养2-4 小时使细胞贴壁，然后加 CCK-8试剂培养一定时间后测定 O.D值，制作出一条以细胞数量为横坐标 (X轴) ，O.D值为纵坐标 (Y轴) 的标准曲线。

CCK8实验原理与步骤CCK-8是一种常见的细胞活力检测方法，常用于评估细胞增殖和细胞毒性等生物学活性。

实验原理：CCK-8试剂是一种黄色噻唑-二苯基甲烷盐的溶液，它能够在有活细胞存在时被细胞内的酶还原成橙色水溶性的产物。

这种产物可以通过光度计测量，从而得到细胞的活力信息。

细胞活力高时，细胞内有较多的酶可以将CCK-8还原成产物，产生较高的吸光度；细胞活力低时，细胞内酶的活性降低，无法完全还原CCK-8，产生较低的吸光度。

实验步骤：1.细胞培养：将待测细胞株接种到含有适宜培养基的培养皿或孔板中，并在恒温、湿润、含有5%CO2的培养箱中孵育。

2.实验前处理：根据实验设计的需要，可进行细胞预处理，如给药、感染等。

预处理时间根据需要确定。

K-8试剂准备：将CCK-8试剂按照用户手册的要求溶解成适合实验设计的浓度。

注：部分实验可能需要调整试剂的浓度，应根据实验要求进行调整。

K-8试剂加样：对不同组的培养皿或孔板分别加入适量的CCK-8试剂，使其与培养基均匀混合。

一般情况下，加入的CCK-8试剂量为培养基总量的10%。

5.孵育CCK-8与细胞的反应：将含有CCK-8试剂的培养皿或孔板放回恒温、湿润、含有5%CO2的培养箱中继续孵育。

孵育时间根据实验需要确定，一般为1-4小时。

6. 吸光度测定：使用酶标仪或光度计测定吸光度（OD）值，一般在450nm波长下测定。

同时，记录对照组（如细胞温育组）的OD值作为参照。

7.数据处理与分析：根据实验设计，采用合适的统计学方法，比较各组的细胞活力差异，并将数据结果进行图表展示。

注意事项：K-8试剂对皮肤、眼睛、呼吸道等有刺激性，请注意安全操作；2.实验前需进行细胞的适宜密度的培养，以保证其在实验过程中的稳定生长状态；3.在实验中注意培养条件的一致性，如温度、湿度、CO2浓度等；4.参照组的选择要慎重，需要与实验对象具有相同的培养条件；5.准备稀释CCK-8试剂时，避免过长时间暴露于光线和空气中，以免降低其效力。

cck8具体操作流程
以下是使用CCK8试剂盒进行细胞活力检测的步骤：
1. 准备细胞：取生长状态良好的细胞制备成一定浓度的细胞悬液。

如果是贴壁细胞，需要37℃培养箱进行预培养2-6小时等细胞贴壁后再开展实验，
如果是悬浮细胞，不需要预培养。

2. 制备培养基：在无酚红DMEM高糖培养基中加入双抗、谷氨酰胺和血清。

3. 准备96孔板：根据实验需求，准备适当数量的96孔板。

每孔加入
100ul细胞悬液，通常细胞增殖实验每孔加入2×10³个/100ul 细胞，细胞
毒性实验每孔加入5×10³个细胞/100ul。

如果是贴壁细胞，可以直接在96
孔板中进行实验，如果是悬浮细胞，需要离心后取沉淀进行实验。

4. 加药处理：根据实验需求，在各组细胞中加入不同浓度的药物或对照组不加药。

5. 孵育：将96孔板放入37℃培养箱中孵育一定时间，通常为24小时。

6. 检测：在检测前，将CCK8试剂加入96孔板中，轻轻混匀后继续孵育1-4小时。

然后使用酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度，记录数据并计算
细胞活力。

以上步骤仅供参考，具体操作请根据实验需求和实际情况进行调整。

CCK8检测细胞增殖/毒性的原理、方法及注意事项一、CCK8检测细胞增殖/毒性的原理Cell Counting Kit—8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。

其基本原理为：该试剂中含有WST—8【化学名：2—（2—甲氧基-4—硝基苯基）—3—（4-硝基苯基）—5-（2，4—二磺酸苯）—2H—四唑单钠盐】,它在电子载体1—甲氧基—5—甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan dye)。

生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比.因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验CCK8的优点：•使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；•CCK—8法能快速检测；•CCK—8法的检测灵敏度很高,甚至可以测定较低细胞密度；•CCK—8法的重复性优于MTT 法；•CCK-8法对细胞毒性小；•CCK—8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液,毋需预制，即开即用。

CCK8的缺点：•与MTT法相比，CCK8和XTT的价格比较贵。

•CCK8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。

与以往的增殖/毒性测定试剂相比较:检测方法MTT法XTT法WST-1法CCK8法甲臢产物的水差(需加有机好好好溶性溶剂溶解)产品性状粉末2瓶溶液溶液1瓶溶液使用方法配成溶液后使用现配现用即开即用即开即用检测灵敏度高很高很高高检测时间较长较短较短最短检测波长560-600nm420-480nm420—480nm430—490nm细胞毒性高,细胞形态完全消失很低，细胞形态不变很低,细胞形态不变很低，细胞形态不变试剂稳定性一般较差一般很好批量样品检测可以非常适合非常适合非常适合便捷程度一般便捷便捷非常便捷二、CCK8检测细胞增殖/毒性的方法实验一：细胞增殖分析1、制备细胞悬液：细胞计数2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数,每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做3个重复。

ＤＯＪINDO操作讲明细胞活性检测１、在96孔板中接种细胞悬液(10０ｍl /孔)。

将培养板放在培养箱预培养(在３7℃,５% CO２的条件下)、2、向每孔加入１０ml的ＣCK－8溶液(注意不要在孔中生成气泡,它们会影响O、Ｄ值的读数)。

3、将培养板在培养箱内孵育1-４小时、４、用酶标仪测定在４５0 nm处的吸光度、5、假如暂时不测定O、D值,打算以后测定的话,能够向每孔中加入10 ｍｌ 0、1 ＭHCl 溶液或者1% w/vSＤS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下、在２4小时内吸光度可不能发生变化、细胞增殖－毒性检测1、在９６孔板中配制100 mｌ的细胞悬液。

将培养板在培养箱预培养２4小时( 在３7℃,5％ CＯ2的条件下)、2、向培养板加入10 ml不同浓度的待测物质。

３、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(例如: 6,１２, 2４或48小时)。

4、向每孔加入10 ｍｌ CCＫ-８溶液(注意不要在孔中生成气泡,它们会影响O、D 值的读数) 。

5、将培养板在培养箱内孵育1—4小时。

6、用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

7、假如暂时不测定O、D值,打算以后测定的话,能够向每孔中加入10 mｌ0、1 M ＨCl溶液或者1% w／vSDS 溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下、在２４小时内吸光度可不能发生变化。

注意:假如待测物质有氧化性或还原性的话,可在加CCＫ—８之前更换新鲜培养基,去掉药物的影响。

当然药物影响比较小的情况能够不更换培养基,直截了当扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

制作标准曲线1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量,然后接种细胞、2、按比例( 例如:1/2比例) 依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度,一般要做3-５个细胞浓度梯度,每组3—6个复孔、3、接种后培养2—4 小时使细胞贴壁,然后加CCＫ—8试剂培养一定时间后测定O、D 值,制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴) ,O、D值为纵坐标(Y轴) 的标准曲线、依照此标准曲线能够测定出未知样品的细胞数量(使用此标准曲线的前提条件是实验的条件要一致,便于确定细胞的接种数量以及加入CCＫ－８后的培养时间)。

同仁CCK8操作说明与检测步骤一、同仁CCK-8操作说明1.实验前准备a.所需试剂：CCK-8试剂（CCK-8粉末和生理盐水），细胞培养基。

b.试剂的保存：CCK-8试剂应存放在4℃的暗处，避免阳光直射。

c.培养细胞：根据实验需要，选择适当的细胞株，并根据细胞培养的常规方法进行培养。

2.实验步骤a.细胞预处理：将细胞种植于24孔板中，使其达到合适的细胞密度和培养状态。

b.添加CCK-8试剂：将CCK-8试剂溶解于适量的生理盐水中，使浓度达到所需浓度。

注意：CCK-8试剂的浓度会根据实验要求而有所不同。

c.添加CCK-8溶液：将CCK-8溶液均匀地滴加到细胞培养基中，注意不要形成气泡。

d.孵育细胞：将孔板放入培养箱中，以适当的温度和湿度进行培养，一般为37℃、5%CO2的条件下孵育1-4小时。

e. 读取结果：使用酶标仪测量吸光度，一般在450 nm波长下测量。

3.结果解读a.根据吸光度结果，在坐标轴上绘制细胞种植数与实验时间的曲线图。

b.横轴表示实验时间点，纵轴表示吸光度值。

c.通过绘制的曲线图可以判断细胞的活力和增殖能力。

二、同仁CCK-8检测步骤在使用同仁CCK-8进行细胞增殖和细胞毒性检测时，一般按照以下步骤进行操作：1.细胞处理：将细胞培养在96孔板中，以合适的细胞密度和培养状态进行处理。

2.试剂添加：将CCK-8试剂溶解于适量的生理盐水中，确保浓度达到所需的浓度。

3.试样添加：在每孔中加入适量的试样，使试样浓度一致。

4.添加CCK-8溶液：将CCK-8溶液均匀地滴加到每个孔中，避免产生气泡。

5.孵育细胞：将孔板放入培养箱中，在适当的温度和湿度下培养，一般为37℃、5%CO2的条件下孵育1-4小时。

6. 结果读取：使用酶标仪测量吸光度，在450 nm波长下读取结果。

7.数据分析：根据吸光度结果，绘制细胞种植数与实验时间的曲线图，进行结果解读和数据分析。

总结：同仁CCK-8操作简便，检测敏感度高，广泛用于细胞增殖和细胞毒性研究。

CCK8实验原理与步骤CCK-8实验（Cell Counting Kit-8）是一种常用的细胞增殖和细胞毒性测定实验方法。

CCK-8试剂可以通过还原机制，测量细胞内的活性代谢物质水平，从而评估细胞数量和活力。

以下是CCK-8实验的基本原理和步骤。

实验原理：CCK-8试剂中含有一种缩合的四氢噻唑并噻吩偶吡啉（WST-8）和电子传递剂1-甲基噻唑盐（MTS）。

细胞内的代谢酶可以将WST-8还原成橙红色的形成物形成溶液。

这个形成物可以通过光度计检测，并与细胞数量和代谢活性成正比。

所以，通过测量形成物的光吸收度，可以获得细胞的增殖和毒性信息。

实验步骤：1.细胞培养准备：将待测细胞分散在完全培养基中，并按照常规方法培养至适当的细胞密度。

2.细胞悬液准备：将培养的细胞用PBS缓冲液洗涤一次，然后用PBS 缓冲液重新悬浮至适当的浓度。

3.细胞计数：使用仪器（如细胞计数器）计数细胞的数目。

如果没有细胞计数器，则可以使用显微镜和计数板手工计数。

4.细胞接种：将细胞分散在细胞培养板或96孔板中，使得每个孔的细胞数目相等。

通常可以根据实验需求设定各组的重复孔数。

5.处理组别：根据实验设计，在每个组中添加不同浓度的药物处理。

同时设置一个对照组（只添加培养基），以便比较。

6.增殖处理：将细胞培养在适当的条件下（如37°C，5%CO2）孵育一定时间。

孵育时间取决于具体实验需求和细胞类型。

K-8试剂处理：在孵育结束后，添加CCK-8试剂到每个孔中，使其最终浓度达到指定浓度。

通常浓度为1/10到1/100倍的CCK-8试剂：细胞悬液体积。

在这个步骤中，也可以添加几种不同的浓度以确定最佳浓度应用于未来的实验。

8.孵育：将试验板放回培养箱中，继续孵育一段时间。

孵育时间可以根据实验设计确定，通常为2-4小时。

9. 吸光度测量：在孵育结束后，使用酶标读板机或其他光度计测量每个孔中形成物的吸光度。

根据实验目的，可以选择470nm或450nm波长。

CCK8实验方法CCK8实验方法是一种广泛应用于细胞生物学领域的细胞增殖和细胞毒性测定方法。

在该实验方法中，细胞种植于细胞培养板中，并经过一定时间的培养，使细胞数量增加到足够数量。

然后使用CCK8试剂对细胞进行处理，并通过化学反应测量细胞的代谢活性。

以下将详细介绍CCK8实验方法的步骤和操作。

材料准备：1.细胞培养基：适用于所研究细胞的培养基；2.细胞：待测细胞种类；3.96孔板：用于培养细胞；K8试剂：购买商用的CCK8试剂盒；5.多功能酶标仪/微板阅读器：测定细胞代谢活性的设备。

步骤：1.细胞种植：将细胞按照所需的浓度分悬浮于细胞培养基中，并将细胞悬浮液均匀分配于96孔板的各孔中。

每孔放置一定数量的细胞，并添加适量的培养基使细胞培养。

2.细胞培养：将96孔板放置在恒温恒湿的培养箱内，以适当的温度（通常为37℃）和二氧化碳浓度培养细胞。

培养时间根据细胞的生长速率和所要研究的问题而定，通常为24小时。

K8试剂处理：将细胞培养液抽取出一定量，使得各孔中细胞数差异不大。

然后向每个孔中加入相同体积的CCK8试剂。

确保试剂均匀分布，充分接触到细胞。

4.反应时间：将加入CCK8试剂的孔置于恒温恒湿的培养箱内，反应一定的时间（通常为1-4小时）。

反应时间取决于试剂的使用说明和实验的需求。

5. 测定吸光度：取出反应后的96孔板，使用多功能酶标仪或微板阅读器在一个特定波长下测定各孔的吸光度值。

常用的吸光度波长为450nm。

6.数据处理：根据测定的吸光度值，在计算机软件中绘制标准曲线，将各个孔的吸光度值转化为相应的细胞数量。

注意事项：1.每个步骤的时间和温度都应根据实验的要求进行调整。

2.实验操作应注意无菌操作，避免细菌和真菌等污染。

3.使用CCK8试剂时注意安全使用，避免接触皮肤和眼睛，必要时佩戴防护手套和护目镜。

4.实验过程中应注意记录实验条件和结果，以便后续的数据分析和结果展示。

总结：CCK8实验方法是一种快速、可重复、灵敏的细胞增殖和细胞毒性测定方法。

CCK8实验1、在96孔板中配置100μl的细胞悬液。

将培养板在培养箱预培养24小时（37℃，5% CO2）。

2、向培养板加入10μl不同浓度的待测物质。

3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24或48小时）。

4、向每孔加入10μl CCK8溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。

5、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

7、若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μl 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。

24小时内测定，吸光度不会发生变化。

PS：1% w/v SDS溶液配制方法：组份浓度：10% (W/V)SDS配制量：100ml配制方法：1.称量10g高纯度的SDS置于100-200ml烧杯中，加入约80ml的去离子水，68℃加入溶解2.滴加浓盐酸调节pH值至7.23.将溶液定容至100ml后，室温保存。

注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。

当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

活力计算：细胞活力*（％）=[A(加药)-A（空白）]/[A（0加药）-A（空白）] ×100A（加药）：具有细胞、CCK8溶液和药物溶液的孔的吸光度A（空白）：具有培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度A（0加药）：具有细胞、CCK8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力CCK-8 可以用于细胞增殖和毒性分析。

其基本原理为:该试剂中含有WST-8，它在电子载体(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒染料，生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比,因此可以用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

细胞增殖-毒性检测实验操作步骤
CCK8试剂盒，是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法。

CCK法应用非常广泛，如药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等。

下面以engreen的CCK8试剂盒为例，简要说明细胞增殖-毒性检测的操作步骤
方法/步骤
1. 在96孔板中配制100μl的细胞悬液。

将培养板在培养箱预培养 24 小时 (在37℃，5% CO2 的条件下)。

2. 向培养板加入10μl 不同浓度的待测物质。

3. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间 (例如: 6,12, 24 或48 小时)。

4. 向每孔加入10μl CCK8 溶液（engreen） (注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 OD 值的读数)。

5. 将培养板在培养箱内孵育 1-4 小时。

6. 用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。

7. 如果暂时不测定OD值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10μl 0.1 M HCl溶液或者1%w/vSDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。

在24小时内吸光度不会发生变化。

cck8试剂盒说明书一、产品介绍cck8试剂盒是一种常用的细胞增殖与细胞毒性分析试剂盒，通过测定细胞代谢活性的变化，可以评估细胞增殖和细胞毒性等生物学效应。

本说明书描述了cck8试剂盒的使用方法、试剂成分和注意事项，以帮助用户正确和安全地进行实验。

二、试剂成分cck8试剂盒包含以下成分：1.Cell Counting Kit-8：一种混合染料，能够与细胞内的代谢产物发生反应，生成可溶于水的发色产物。

2.试剂盒缓冲液：用于稀释和混合CCK-8试剂。

三、试剂准备1.将CCK-8试剂从冰箱取出，放置室温下30分钟，使试剂回到室温。

2.打开试剂瓶盖前，先将瓶盖上的溶液摇匀，避免试剂附着在瓶口上。

3.取出所需的量的试剂盒缓冲液，根据需求合适地稀释CCK-8试剂。

注：试剂盒缓冲液的配制方法详见附录A。

四、试验操作1.将待测的细胞均匀地分散到不粘性的96孔板中，每个孔中含有适当数量的细胞。

2.向每个孔中加入适量的培养基，并在孔板中的正常培养条件下孵育所需时间。

3.在孵育所需的时间结束后，准备CCK-8试剂溶液。

在每个孔中，将培养基完全去除，然后加入100μl的稀释后的CCK-8试剂。

4.将孔板放入培养箱中，继续孵育所需的时间。

5.孵育结束后，记录各孔中的发色情况。

使用酶标仪在450nm波长下测量光密度，记录各孔的吸光度值。

五、结果解读1.吸光度值和细胞代谢活性成正相关。

吸光度值较高表示细胞代谢活性较高，细胞增殖较多。

2.吸光度值较低表示细胞代谢活性较低，可能是由于细胞毒性引起的。

3.吸光度的变化可用于评估药物、毒素和基因表达对细胞的影响。

六、注意事项1.本试剂盒仅供科研使用，不可用于临床诊断。

2.所有的操作必须在无菌条件下进行，以避免外界因素对实验结果的干扰。

3.使用CCK-8试剂的过程中，避免阳光直射，以防止试剂受到光的影响而降低反应效果。

4.请根据实验需要，选择适当的试剂盒缓冲液稀释CCK-8试剂。

5.请按照说明书指导的方法进行试验，以确保获得准确和可靠的结果。

DOJINDO操作说明细胞活性检测1.在96孔板中接种细胞悬液(100 ml /孔)。

将培养板放在培养箱预培养(在37℃，5% CO2的条件下)。

2.向每孔加入10 ml的CCK- 8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响O.D值的读数)。

3.将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

4.用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

5.如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10 ml 0.1 M HCl溶液或者1% w/vSDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。

在24小时内吸光度不会发生变化。

细胞增殖-毒性检测1.在96孔板中配制100 ml的细胞悬液。

将培养板在培养箱预培养24小时(在37℃，5% CO2的条件下)。

2.向培养板加入10 ml不同浓度的待测物质。

3.将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(例如: 6,12, 24或48小时)。

4.向每孔加入10 ml CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响O.D值的读数)。

5.将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

6.用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

7.如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10 ml 0.1 M HCl溶液或者1% w/vSDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。

在24小时内吸光度不会发生变化。

注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基，去掉药物的影响。

当然药物影响比较小的情况可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

制作标准曲线1.先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。

2.按比例(例如：1/2比例)依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。

3.接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加CCK-8试剂培养一定时间后测定O.D值，制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴)，O.D值为纵坐标(Y轴)的标准曲线。

细胞增殖-毒性实验步骤令狐采学1、细胞传代、细胞计数、细胞增殖-毒性实验步骤：实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线消毒30分钟（枪、枪头、15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复温实验所需试剂[细胞培养液（DMEM、1640）、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、胰酶（0.25% Trypsin-EDTA）、胎牛血清（FBS）、双抗]，所有的试剂、仪器放入生物安全柜前要用酒精喷洒消毒。

显微镜下看细胞生长状态，有无污染。

1）倒去培养瓶内的培养液；2）加入PBS 2ml洗涤培养瓶内细胞2次；3）加入胰酶500ul/0.5ml 2～10min（具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）；4）加入含10%FBS的培养液1～1.5ml[培养液：胰酶=（2～3）:1]中和胰酶；5）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜；6）将单细胞悬液吸入10～15ml离心管中，低速离心800rpm 3分钟，倒去上清液；7）加入含10%FBS细胞培养液1～2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液；8）吸取20ul细胞悬液（10ul细胞悬液+10ul台盼兰液：给坏死细胞染色，判断细胞活力）至细胞计数板，进行细胞计数；CCK-8实验：9）在96孔板中，给每孔加100μL（约7000个）的细胞悬液，将培养板放在培养箱预培养24-72小时（37℃，5%CO2），使细胞贴壁；10）向培养板中加入10μL不同浓度（5、10、20、40、80、160ug/ml）的待测药物；11）将培养板在培养箱孵育一段适当的时间24小时（例如：6、12、24或48小时）（药物起作用）；注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然。