CFSE细胞增殖检测

C F S E细胞增殖实验集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#准备：1.20ml 预冷5%FBS(HI)-PBS2.50ml 预冷MACS buffer3.70um滤网4. RBC lysis5.LS column6.50ml 37度预热PBS7.50ml 37度预热complete culture medium(RPMI 1640 +10% Heat InactivatedFBS+10 mM HEPES+1 mM penicilline streptomycin+ 50 mM 2-mercaptoethanol)（一）CD3抗体包被取96孔板每孔加入100ul 10ug/mlanti-CD3抗体（PBS）密封4度过夜。

（二）淋巴细胞获取1.小鼠的脾脏结摘取于10ml 冷5%FBS-PBS中。

2.于70um滤网研磨滤过，500g 4度 5min离心后弃上清。

3. RBC lysis裂红5 min，10ml 冷5% PBS终止。

4.500g 4度 5min 离心后弃上清，10mlMACS buffer重悬，计数。

留取105个细胞进行FACS。

（三）磁珠分选nave CD8a+ T细胞cell suspension at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely.cell pellet in 400 μL of MACS buffer per 108 total cells.100 μL of Naive CD8a+ T Cell Biotin-Antibody Cocktail per 108 total cells.well and incubate for 5 minutes in the refrigerator (28 °C).5.Add 200 μL of MACS buffer per 108 total cells.6.Add 200 μL of Anti-Biotin MicroBeads per 108total cells. Add 100 μL of CD44 MicroBeads per 108 total cells.7.Mix well and incubate for an additional 10 minutes in the refrigerator (28 °C).8.Wash cells by adding 10ml of MACS buffer per 108 cells and centrifuge at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely.9.Resuspend up to 108cells in 500 μL of MACS buffer.10.Place LS column in the magnetic field of a suitable MACS Separator.11. Prepare column by rinsing with 3 mL of MACS buffer.12.Apply cell suspension onto the column. Collect flow-through containingunlabeled cells, representing the enriched naive CD8a+ T cell fraction. 13.Wash column with 3 mL of MACS buffer. Collect unlabeled cells that passthrough, representing the enriched naive CD8a+ T cells, and combine with the flow-through from step 3.14.Determine cell number. 留取105个细胞进行FACS。

注册 |登录构建全球华人科学博客圈返回首页 RSS 订阅 帮助 FlowJo 分析细胞增殖已有 521 次阅读 2012-8-21 14:20 |个人分类:FlowJo 使用|系统分类:科研笔记|关键词:细胞增殖，数据分析，FlowJo ，CFSE ，博文FlowJo 分析细胞增殖CFSE 法检测细胞增殖的原理：CFSE(CFDA-SE)是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，CFSE 进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。

在细胞分裂增殖过程中，CFSE 标记荧光可平均分配至两个子代细胞中,因此其荧光强度是亲代细胞的一半。

演示数据：Proliferation tutorial ：实验中所用的荧光染料为eFluor ® 670 Proliferation Tutorial Data.rarFlowJo 分析细胞增殖的步骤：1. 确定要分析的目标细胞群（下图为演示数据中的样本Sample 1）2. 打开增殖分析平台：到“工具”菜单栏中选择“细胞增殖”，打开增殖分析平台，将参数轴中的参数更换为本实验中所采用的APC_A::670Dye ，如下图所示：张千君加为好友 给我留言 打个招呼发送消息FlowJo 中文技术博客分享/u/FlowJo流式细胞技术相关资源分享，流式细胞数据分析，流式技术支持及培训博客首页动态记录博文相册主题分享好友留言板个人资料左边为拟合结果图，右边为各个统计数据，其中：RMS: root mean square error的缩写，反映的是拟合结果与实际数据的吻合程度，RMS数值越小，说明拟合结果越好。

3.打开增殖分析平台左下角的“Options”选项选项中各个参数的介绍：#Peaks：增殖峰的数目，默认的最大数目为8个。

随着细胞的分裂，子代细胞所含的CFSE荧光染料的量以2倍的比例递减，分裂到第七代的时候，第七代细胞的CFSE荧光强度只有原代细胞的1/128，可能低于细胞的自发荧光。

在组织中检测细胞增殖、分化和凋亡的方法一、检测细胞增殖的方法（1）直接方法：通过直接测定进行分裂的细胞来评价细胞的增殖能力1、胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）渗入法胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必需物质。

用同位素3H标记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DAN合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DAN的代谢及细胞增殖情况。

但是具有放射性。

2、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）检测法羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，使CFSE成为一种良好的细胞标记物。

CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。

当细胞分裂时，CFsE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。

这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。

3、Brdu检测法Brdu中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷，为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu 单克隆抗体，ICC染色，显示增殖细胞。

同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义4、增殖标志检测有些抗原只存在于增殖细胞中，而非增值细胞缺乏这些抗原，您也可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测。

例如，在人体细胞中，Ki-67抗体识别同名蛋白，在细胞周期S期、G2期和M期表达，而在G0期和G1 期(非增殖期)不表达。

用针对Ki-67蛋白的单抗就可以检测细胞的增值情况。

由于需要组织切片，这种方法无法进行高通量分析。

不过这一方法颇受癌症研究者们的青睐，因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。

其他普遍使用的细胞增殖或细胞周期调控标志还包括，增殖细胞核抗原PCNA、拓扑异构酶IIB和磷酸化组蛋白H3。

◇实验方法学◇CFSE 示踪与流式细胞仪检测法研究环磷酰胺对T 淋巴细胞增殖的影响包晶晶,林海霞,马　璟(上海医药工业研究院国家上海新药安全评价研究中心,上海　201203)收稿日期:2009-12-30,修回日期:2010-03-18基金项目:科技部“十一五新药创制”重大专项资助课题(No2008ZX093052006);上海市科委企业技术创新团队项目资助(No 08430516200)作者简介:包晶晶(1983-),女,硕士生,E 2mail:jjb19831@g mail .com;马　璟(1963-),女,博士,研究员,博士生导师,通讯作者,Tel:0212508003332106中国图书分类号:R 2332;R 329.24;R 331.125;R 979.1;R 979.5文献标识码:A 文章编号:1001-1978(2010)06-0828-05摘要:目的　利用定量分析羧基荧光素乙酰乙酸(carboxyflu 2orescein diacetate succini m idyl ester,CFSE )时间系列数据的方法研究淋巴细胞细胞增殖动力学及免疫抑制剂对淋巴细胞增殖抑制机制的研究。

方法　环磷酰胺造成小鼠免疫抑制模型,并用CFSE 染料给对照组和给药组动物的淋巴细胞染色,通过数学模型拟合法分析数据。

结果　对照组和给药组淋巴细胞增殖进入第一代分裂的时间分别是27117h 和22188h,每代细胞死亡率分别为20%和40%;进入分裂前的细胞半衰期分别为31153h 和43132h 。

结论　通过数学拟合法对CFSE 数据进行定量分析,探讨药物对淋巴细胞增殖影响的机制,该实验中的药物环磷酰胺抑制淋巴细胞增殖的方式可能是使细胞增殖时每代细胞的死亡率增加所致。

关键词:CFSE;定量分析;数学拟合;流式细胞仪;淋巴细胞增殖;环磷酰胺 传统的测定淋巴细胞增殖的方法只能通过细胞数量的变化来反映细胞增殖的的变化,不能更深入的洞察细胞增殖是如何被改变的。

本文受国家973计划(2005CB523202)资助作者简介:赵和平(1983年-),男,硕士,主要从事动物病毒疫苗效力评价研究;通讯作者及指导教师:仇华吉(1967年-),男,博士,研究员,主要从事分子病毒学与免疫学研究,E mail:huajiqiu@ 。

免疫学技术与方法基于CFSE 染色的猪淋巴细胞增殖试验方法的建立赵和平 孙 元 袁 远 仇华吉(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室,哈尔滨150001)中国图书分类号 S852 文献标识码 A 文章编号 1000 484X(2009)02 0159 05[摘 要] 目的:建立一种方便可靠的评价猪只细胞免疫水平的试验方法。

方法:用终浓度分别为3、6、9和12 g/ml 的刀豆素A(Con A)刺激经羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(C FSE)染色的猪外周血单个核细胞(PBMC)3、5和7天,然后用荧光标记的单克隆抗体对CD4+和CD8+细胞进行标记,最后利用流式细胞术分析。

结果:不同浓度ConA 刺激后,猪PB MC 增殖能力不同,Con A 浓度为6 g/ml 时CD4+和CD8+细胞的细胞分裂指数最大,用MTT 试验也获得相似结果。

对PB MC 刺激5天后进行分析相对较好。

结论:建立了一种基于活细胞染料C FSE 染色的猪淋巴细胞增殖试验方法,该方法可以在单个细胞水平上有效地分析刺激后CD4+和CD8+细胞亚群的增殖水平,进而评价细胞免疫水平。

[关键词] 猪淋巴细胞;细胞免疫;C FSE 染色;淋巴细胞增殖试验A method for detecting porcine lymphocyte proliferation based on CFSE stainingZ HAO He Ping ,SU N Yuan ,YU AN Yuan,QIUHua Ji.Division o f Swine Infectious Diseases,Harbin Veterinary Research Institute,The Chinese Academy o f Agricultural Sciences,Harbin 150001,China[Abstract] Objective:To develop a method to assess porci ne cell mediated immunity (CMI).Methods:PBMCs from pigs were stained wi th intracellular fluorescen t dye,CFSE,and stimulated wi th varied amounts of ConA (0,3,6,9,and 12 g/mL),and plated in 3replicate cul tures for 3,5,or 7days.Then CD4+cell and CD8+cells were labeled with fluorescent antibodies.Data were acquired using flow cytometry (FC M )and analyzed using CellQuest software.Results:Cell division indices of porci ne CD4+and CD8+cells were different when porcine PB MCs were sti mulated with different doses of ConA.The results were similar to those obtained by MTT method.Op timal results were obtained when porcine lymphocytes were s timulated for 5days.C onclusion:The CFSE based method developed in this study can be used to analyze the proliferation of di fferent cell subsets si multaneonsly.[Key w ords] Porcine lymphocytes;Cell mediated immunity;CFSE staining;Lymphocyte proliferation目前对我国养猪业危害最大的主要是一些病毒性疾病,这些疫病主要通过疫苗接种手段来控制。

细胞增殖检测方法简介1.检测细胞代谢活性检测细胞的代谢活性也可以反映细胞增殖的情况。

在细胞增殖过程中乳酸脱氢酶的活性会增加，而活性的脱氢酶可以使得外源性的四唑盐或者阿尔玛蓝(Alamar blue)还原成为带有颜色还原产物。

通过分光光度计或者酶标仪来读取含染料培养基的吸光度，从而衡量细胞的代谢活性，检测细胞增殖的情况。

四种最常见的四唑盐是：MTT、XTT、MTS和WST1，其还原产物为甲瓒(formazan)。

(1)四甲基偶氮唑盐法(MTT)：MTT商品名为噻唑蓝，是一种黄色的染料。

1983年Mosmann 建立MTT比色法，用于检测细胞存活和增殖。

其原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶，甲瓒并沉积在细胞中，而死亡的细胞无此功能。

二甲亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫分析仪测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数量范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

MTT可以用于所有细胞类型，但MTT在标准的细胞培养基中是不溶的，而且其生成的甲瓒晶体需要溶解在DMSC)中。

因此，MTT主要作为终点检测方法。

另外，有研究发现过氧化物会降低MTT测定的准确度，抑制将近95％的MTT与O2-的反应，MTT溶解产物甲瓒会吸附在纳米纤维上，而致使检测的结果呈现假阴性。

(2)二甲氧唑黄比色法(XTT)：XTT是一种与MTT类似的四唑氮衍生物，可被活细胞还原形成水溶性的橘黄色的甲瓒产物，不形成颗粒，可直接用酶联免疫分析仪检测吸光度，故较MTT法更加快速、简便、敏感。

但XTT水溶液不稳定，需要低温保存，现配现用。

由于XTT的代谢产物呈橘黄色，故培养体系中有些黄色代谢物和试剂可能会影响其检测结果。

与MTT一样，过氧化物可抑制近95％的XTT与O2-的反应，故对XTT测定的准确度有一定的影响。

(3)内盐法(MTS)：MTS是一种新型的MTT类似物。

MTs在偶联剂PMS存在的条件下，可被活细胞线粒体中的多种脱氢酶还原成水溶性的有色甲瓒产物，其颜色深浅与活细胞数量在一定范围内呈高度相关，可用酶标仪检测。

在组织中检测细胞增殖、分化和凋亡的方法一、宇文皓月二、检测细胞增殖的方法（1）直接方法：通过直接测定进行分裂的细胞来评价细胞的增殖能力1、胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）渗入法胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必须物质。

用同位素3H标识表记标帜TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DAN合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DAN的代谢及细胞增殖情况。

但是具有放射性。

2、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）检测法羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，使CFSE成为一种良好的细胞标识表记标帜物。

CFSE进入细胞后可以不成逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。

当细胞分裂时，CFsE标识表记标帜荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。

这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。

3、Brdu检测法Brdu中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷，为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu单克隆抗体，ICC染色，显示增殖细胞。

同时结合其它细胞标识表记标帜物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义4、增殖标记检测有些抗原只存在于增殖细胞中，而非增值细胞缺乏这些抗原，您也可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测。

例如，在人体细胞中，Ki-67抗体识别同名蛋白，在细胞周期S期、G2期和M期表达，而在G0期和G1 期(非增殖期)不表达。

用针对Ki-67蛋白的单抗就可以检测细胞的增值情况。

由于需要组织切片，这种方法无法进行高通量分析。

不过这一方法颇受癌症研究者们的青睐，因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。

细胞增殖检测C F S E YUKI was compiled on the morning of December 16, 2020一、原理荧光染料CFSE，也可称为CFDA SE（5，6- carboxyfluorescein diacetate，succinimidyl ester）即羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，这使得CFSE成为一种良好的细胞标记物。

当CFSE以含有两个乙酸基团和一个succinimidyl ester功能基团的形式存在时，不具有荧光性质，而具有细胞膜通透性，能够自由进入细胞；而当其扩散进入细胞内环境，内源的酯酶可将其乙酸基团水解，此种形式的CFSE分子具有很高的荧光活性，被激发能够产生绿色荧光，却不再具有膜通透性；同时，其含有的succinimidyl ester基团能与胞内的细胞骨架蛋白中的游离胺基反应，最终形成具有荧光的蛋白加合物。

因此，当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白被平均分配到第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度便会减弱至一半；以此类推，分裂得到的第三代细胞的荧光强度便会比第二代细胞再次减弱。

这种现象可以在488nm的激发光下，采用流式细胞仪检测分析，通过检测到细胞荧光强度不断的降低，进一步分析得出细胞分裂增殖的情况。

二、CFSE配制用DMSO溶解成5 mmol/L的储存液，于- 20 ℃避光保存。

使用时，用无血清DMEM培养液稀释成5μmol/L的工作液备用。

CFSE试剂盒内有一小瓶CFSE（A试剂）标明500ug ，另有一小瓶DMSO（B试剂），500ugCFSE溶解于180ulDMSO即是5mMstock solution。

三、CFSE标记细胞制作细胞悬液，加入等体积CFSE工作液，于37℃孵育10 min，用40%体积的冷小牛血清立即终止标记10min。