CCK8法检测细胞增殖预实验教学文稿

表型检测：增殖
细胞增殖的定义：
Cell Counting Kit-8 （CCK-8）分析细胞增殖的原理：
CCK-8 测细胞增殖操作流程：
CCK-8 测细胞增殖实验分组设计：
数据处理与绘图：
Tips：
1. 第一次做实验时，先做几个孔摸索接种细胞数量和加入CCK- 8 试剂后的培养时
间。

2. 铺板要混匀：a）可以先往孔里加50ul 培养基，再接种50ul 细胞悬液；b)不时地混
匀细胞悬液，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接种几个孔就混匀一下；c)铺完板后，还可以轻敲板底，帮助细胞分散均匀。

或者用振荡器摇板帮助细胞分散。

3. 培养板周围一圈孔容易蒸发，为了减少误差，培养板的四周只加无菌PBS，而不作
为指标检测孔。

4. 使用新鲜的完全培养基稀释cck8，完全混匀，把待测孔中旧的培养基吸掉，加入配
制好的含cck8 的培养基。

5. 加液时，枪尖贴着孔内壁慢慢加，避免出现气泡。

6. 每次测定都需要在同一块板上设置调零孔。

如果细胞培养时是含药物的，那么调零
孔里也要含有相应的药物。

7. 使用双波长检测，检测波长450nm-490nm，参比波长600-650nm。

450nm 最灵
敏。

CCK-8 法测细胞增殖适用范围：
⏹ 适用于检测贴壁细胞和悬浮细胞数量
⏹ 不能检测组织中的细胞数量
⏹ 不能确认细胞数量的变化是由细胞增殖增多还是细胞凋亡减少引起的，需要配合其
他实验结果进行综合判断
5。

cck8细胞增殖实验原理CCK-8细胞增殖实验原理引言：细胞增殖实验是生物学和医学研究中常用的一种实验方法，用于测定细胞的增殖能力。

CCK-8（Cell Counting Kit-8）是一种常用的细胞增殖检测试剂，通过测量细胞中的还原型CCK-8转化为溶液中的发色体，从而间接反映细胞增殖的能力。

本文将介绍CCK-8细胞增殖实验的原理及其应用。

一、CCK-8细胞增殖实验原理：CCK-8细胞增殖实验原理基于细胞代谢产物对试剂的还原作用。

CCK-8试剂中含有一种能被还原的黄色酶，当细胞活力高时，细胞内的代谢产物会将CCK-8试剂还原为有色产物。

实验原理如下：1. 细胞培养：将待测细胞接种于培养皿中，培养至适当的细胞数和状态。

2. 细胞处理：根据实际需求，对待测细胞进行处理，例如给予药物处理、基因转染等。

3. CCK-8试剂处理：将CCK-8试剂加入培养皿中，与细胞共同孵育一段时间。

4. 反应终止：孵育一段时间后，加入一种酸性溶液终止反应，阻止进一步的细胞代谢反应。

5. 测量吸光度：将培养皿中的溶液转移到微孔板中，使用酶标仪或多功能酶标仪在450 nm波长下测量吸光度。

6. 数据分析：根据吸光度值，计算细胞增殖的相对程度，比较不同处理组的细胞增殖能力。

二、CCK-8细胞增殖实验的应用：CCK-8细胞增殖实验广泛应用于生物医学研究、药物筛选、细胞毒性评价等领域。

以下列举几个常见的应用场景：1. 药物筛选：CCK-8实验可用于评估药物对细胞增殖的影响。

将细胞分为不同处理组，给予不同浓度的药物处理，通过测量吸光度值，评估药物对细胞增殖的抑制或促进作用。

2. 细胞毒性评价：CCK-8实验可用于评估化合物、材料或环境因素对细胞生存能力的影响。

通过测量吸光度值，判断待测物质对细胞的毒性程度。

3. 细胞增殖动力学研究：CCK-8实验可用于研究细胞增殖的动力学过程。

通过连续测量不同时间点的吸光度值，得到细胞增殖曲线，进一步分析细胞增殖速率和生长特性。

CCK—8法在淋巴细胞增殖检测中最佳实验条件的筛选目的筛选CCK-8法在淋巴细胞增殖检测中的最佳实验条件。

方法采用正交实验设计，对初始细胞浓度、培养时间、LPS浓度、显色时间这4个主要因素各水平对人外周血单个核细胞（PBMC）和小鼠脾细胞增殖的影响进行试验研究，对各实验组合测得的刺激指数进行方差分析。

结果CCK-8检测人PBMC 增殖试验的最佳条件：初始细胞浓度为2.5×106/mL，培养时间为48 h，LPS浓度为1 μg/mL，加入CCK-8后孵育4.5 h；检测小鼠脾细胞增殖试验的最佳条件：初始细胞浓度为5.0×106/mL，培养时间为48 h，LPS浓度为1 μg/mL，加入CCK-8后孵育4.5 h。

结论CCK-8法便捷、灵敏、重复性好，可作为检测淋巴细胞增殖的稳定方法。

本研究建立的CCK-8最佳实验条件可为免疫调节作用的药物体外筛选和免疫药理学作用的研究提供依据。

[Abstract] Objective To optimize the experimental conditions of CCK-8 in lymphocyte proliferation assays. Methods An orthogonal test was designed to investigate the influence of four major factors （cell density，culture period，concentration of LPS and duration of incubation with CCK-8）on cell proliferation of human PBMC and mouse splenocyte. ANOV A was carried out to analyze the stimulation indices of all experimental condition combinations. Results The optimal conditions for CCK-8 was as follows：for PBMC，cell density was 2.5×106/mL，culture period was 48 h，concentration of LPS was 1 μg/mL，and duration of incubation with CCK-8 was 4.5 h；and for splenocyte，cell density was 5.0×106/mL，culture period was 48 h，concentration of LPS was 1 μg/mL，and duration of incubation with CCK-8 was 4.5 h. Conclusion The optimized CCK-8 protocol is a sensitive，convenient and stable quantitative method to evaluate lymphocyte proliferation. This result can provide evidence in screening of immunomodulating drugs and investigation of their immunopharmacology.[Key words] CCK-8；PBMC；Lymphocyte proliferation；Orthogonal test檢测淋巴细胞增殖的方法主要有形态学检查法、放射性核素标记法和四氮唑盐比色法等。

CCK8实验原理与步骤7页CCK-8实验是一种细胞活力试验，用于研究化合物对细胞增殖和代谢的影响。

它采用一种水溶性琼脂乳胶法，简便、快速、灵敏，广泛应用于细胞生物学、药理学、毒理学等领域。

原理CCK-8实验基于细胞色素P450还原酶系统，在细胞内氧化还原反应所产生的NADPH提供还原力，将CCK-8溶液还原成从橙色到黄色的水溶液，吸光度与细胞代谢活性成正比。

CCK-8试剂的成分类似于MTT，唯一的区别是在MTT中氧化剂是过硫酸铵，而在CCK-8实验中是琼脂红(VS)。

步骤1.细胞处理在细胞进行试验之前，需进行培养、传代、分离等处理。

细胞分装于96孔板中，以达到需要的浓度。

K-8试剂添加将CCK-8试剂添加到细胞培养液上，混合均匀。

3.细胞孵育将接种细胞的96孔板，放置在孵育箱中，孵育固定时间。

4.光学密度测定用光谱计或酶标仪测定吸光度，获得样品的光学密度值。

5.分析数据处理所获得数据，如绘制生长曲线、IC50计算等。

6.控制组的添加添加阳性及阴性对照物质，用于检测实验的准确性。

7.重复实验重复实验，以验证实验的可重现性和可靠性。

优点K-8法对细胞数量、增殖速度的影响很敏感，可以更直观地了解药物对细胞活性的影响。

K-8试剂耗量低、操作简便，减少了工作时间和操作风险，提高了实验的效率。

K-8试剂无需使用有机溶剂，避免了染料的毒性和膜相溶性，缩短了处理时间，不会干扰药物的测定结果。

存在的问题1. CCK-8试剂需要保持在4℃以下，且使用前要摇匀，否则会对实验结果产生影响。

2. CCK-8试剂对CO2和PH值的依赖性很强，需要精确控制实验条件，否则会导致误差的发生。

3. 由于CCK-8法不能自动修正可能的干扰，因此需要注意加入对照试样，以便精确分析试验结果。

CCK8佥测细胞增殖/毒性的原理、方法及注意事项、CCK8检测细胞增殖/毒性的原理Cell Counting Kit-8 （简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。

其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-（2-甲氧基 4 硝基苯基）-3-（4- 硝基苯基）-5-（2,4- 二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS 的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物Formazan dye）。

生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。

因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验CCK8的优点：・使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；* CCK-8法能快速检测；* CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度；* CCK-8法的重复性优于MTT法；・CCK-8法对细胞毒性小；・CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。

CCK8的缺点：•与MTT法相比，CCK8和XTT的价格比较贵。

* CCK8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。

与以往的增殖/毒性测定试剂相比较:现配现用即开即用即开即用使用方法配成溶液后使用二、CCK8检测细胞增殖/毒性的方法实验一：细胞增殖分析1、 制备细胞悬液：细胞计数2、 接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul 细胞悬液， 同样的样本可做3个重复。

3、 37C 培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，如果 不需要贴壁，这步可以省去。

4、 加入10ul CCK8 :由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在 孔壁上而带来误差，建议 在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。

或 者直接配置含10%CCK8的培养基，以换液的形式加入。

（1）制备细胞悬液：生长情况良好的细胞汇合率约80%的P3代HUVECs，胰酶消化方法制成细胞悬液。

（2）细胞接种：将常规培养的HUVECs细胞以2.0×103/孔，接种于96孔板中。

（3）测定A值并统计：每24小时，每组细胞任取8个孔，每孔中均加入标准制式的CCK-8液10μL。

继续放入培养箱放置2小时，取出后尽快酶联免疫检测仪上测定吸光度A值（λ=450nm）。

连续7天，检测结果绘制两组细胞的增殖曲线，所测得A值用均数±标准差表示，统计学分析每天三组所测值是否有统计学意义。

（4）注意事项：每孔细胞数量必须适量，需经过预实验，确定接种细胞数量；接种时细胞悬液需混匀；96孔板最外围一圈培养液易挥发，因此外围的孔加入PBS溶液，不作为实验检测孔；每孔加入CCK-8试剂液体量为10μL，为培养液体积1/10；加CCK-8溶液时枪头斜贴96孔板壁加入，以免产生气泡，加入试剂后轻摇96孔板，试剂与培养液应充分混匀。

CCK8实验原理与步骤CCK-8是一种常见的细胞活力检测方法，常用于评估细胞增殖和细胞毒性等生物学活性。

实验原理：CCK-8试剂是一种黄色噻唑-二苯基甲烷盐的溶液，它能够在有活细胞存在时被细胞内的酶还原成橙色水溶性的产物。

这种产物可以通过光度计测量，从而得到细胞的活力信息。

细胞活力高时，细胞内有较多的酶可以将CCK-8还原成产物，产生较高的吸光度；细胞活力低时，细胞内酶的活性降低，无法完全还原CCK-8，产生较低的吸光度。

实验步骤：1.细胞培养：将待测细胞株接种到含有适宜培养基的培养皿或孔板中，并在恒温、湿润、含有5%CO2的培养箱中孵育。

2.实验前处理：根据实验设计的需要，可进行细胞预处理，如给药、感染等。

预处理时间根据需要确定。

K-8试剂准备：将CCK-8试剂按照用户手册的要求溶解成适合实验设计的浓度。

注：部分实验可能需要调整试剂的浓度，应根据实验要求进行调整。

K-8试剂加样：对不同组的培养皿或孔板分别加入适量的CCK-8试剂，使其与培养基均匀混合。

一般情况下，加入的CCK-8试剂量为培养基总量的10%。

5.孵育CCK-8与细胞的反应：将含有CCK-8试剂的培养皿或孔板放回恒温、湿润、含有5%CO2的培养箱中继续孵育。

孵育时间根据实验需要确定，一般为1-4小时。

6. 吸光度测定：使用酶标仪或光度计测定吸光度（OD）值，一般在450nm波长下测定。

同时，记录对照组（如细胞温育组）的OD值作为参照。

7.数据处理与分析：根据实验设计，采用合适的统计学方法，比较各组的细胞活力差异，并将数据结果进行图表展示。

注意事项：K-8试剂对皮肤、眼睛、呼吸道等有刺激性，请注意安全操作；2.实验前需进行细胞的适宜密度的培养，以保证其在实验过程中的稳定生长状态；3.在实验中注意培养条件的一致性，如温度、湿度、CO2浓度等；4.参照组的选择要慎重，需要与实验对象具有相同的培养条件；5.准备稀释CCK-8试剂时，避免过长时间暴露于光线和空气中，以免降低其效力。

（完整版）CCK8细胞增殖实验
CCK8细胞增殖实验
1.首先保证细胞消化下来后吹打成单细胞悬液，然后计数准确，接受每个孔前都将细胞悬液充分混匀。

接种完成后，整个96孔板按十字形来回充分晃动，保证细胞接种后在每个孔中都平均分布，否则测定OD值时重复孔会出现大幅度波动，影响结果。

2. 消化细胞前先用PBS或者生理盐水清洗细胞1-2遍，再加入胰酶，晃动培养瓶/皿使胰酶充分覆盖细胞，然后去除全部的胰酶，将细胞放入培养箱孵育3-5min。

待细胞边缘收缩至单个细胞后加入培养液吹打即可，很好吹打成单细胞悬液的。

3. 我试着回答下你的问题，CCK-8读值我想是独立于你条件培养之外的，意思就是你按照你的实验设计完成压力培养，比如你要培养48小时，那么你就等48小时结束后再加入CCK-8，那么CCK-8培养就不需要在压力条件下了，普通条件下就可以，贴壁细胞是要1－4小时，在这个时间段内你选择你认为最好的时间点测量，CCK-8公司技术专员建议CCK-8加入后培养液变黄，颜色变的最深的时间测量！
我的做法是：加入CCK-8后1－4个小时内每隔半小时测下OD 值，对比下不同时间的颜色，数值，大概估计下最佳时间点，再做的时候应该就方便了！。

cck8细胞增殖实验报告CCK8细胞增殖实验报告细胞增殖是生命科学研究中的重要课题之一，它关乎着生物体的生长和发育过程。

为了更好地了解细胞增殖的机理和规律，科学家们开展了一系列的实验研究。

本文将重点介绍一种常用的细胞增殖实验方法——CCK8实验，并对其原理、操作步骤及结果分析进行详细阐述。

一、CCK8实验的原理CCK8实验是一种基于细胞代谢活性的颜色反应的实验方法。

其原理基于细胞内的酶促反应，通过将CCK8试剂加入到培养皿中，可以与活细胞中的代谢产物发生反应，形成可溶性的紫色产物。

这种紫色产物的浓度与细胞数量成正比，因此可以通过测量其光密度来评估细胞的增殖情况。

二、CCK8实验的操作步骤1. 细胞培养与处理：首先，我们需要选择一种适合的细胞系进行培养。

将细胞悬浮液均匀地分布在培养皿中，并根据实验需要添加不同的处理条件，如药物处理、基因干预等。

2. CCK8试剂的加入：在培养皿中加入适量的CCK8试剂，并轻轻摇晃培养皿，使试剂均匀地分布在细胞上。

3. 孵育：将培养皿放置在恒温培养箱中，以维持适宜的温度和湿度，孵育一定的时间。

4. 光密度测量：使用酶标仪或分光光度计测量培养皿中产生的紫色产物的光密度值。

5. 数据分析：根据测得的光密度值，可以计算出细胞的增殖率，并进行统计学分析。

三、CCK8实验结果的分析CCK8实验的结果分析主要包括两个方面：对照组与实验组的比较，以及不同时间点的变化趋势。

1. 对照组与实验组的比较：首先，我们需要设立一个对照组，即未经处理的细胞。

通过与对照组进行比较，可以评估实验组的处理对细胞增殖的影响。

如果实验组的光密度值较对照组显著增加或减少，说明该处理条件对细胞增殖有明显的影响。

2. 不同时间点的变化趋势：在CCK8实验中，通常会选择不同的时间点进行测量，以了解细胞增殖的动态变化。

通过绘制时间-光密度曲线，可以观察到细胞增殖的变化趋势。

一般来说，细胞增殖呈现出指数增长的趋势，但也可能存在阶段性的变化。

CCK8细胞增值检测实验简介全心全意就为医生服务，一心一意只为造福医生CCK-8（Cell Counting Kit-8）细胞活性和增殖检测是医学研究中常用的实验技术，其原理是该试剂中含有WST-8，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。

生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。

因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

以下是CCK-8检测的具体步骤：细胞活性检测1. 在96 孔板中接种细胞悬液 (100 ml /孔 ) 。

将培养板放在培养箱预培养 (在37 ℃，5% CO2的条件下 )。

2. 向每孔加入10 ml 的CCK- 8溶液 (注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 O.D值的读数) 。

3. 将培养板在培养箱内孵育 1-4小时。

4. 用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

5. 如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入 10 ml0.1 M HCl溶液或者1% w/vSDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。

在 24小时内吸光度不会发生变化。

细胞增殖 -毒性检测1. 在96 孔板中配制 100 ml的细胞悬液。

将培养板在培养箱预培养 24小时 ( 在37℃， 5% CO2的条件下 )。

2. 向培养板加入10 ml不同浓度的待测物质。

3. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间 (例如: 6,12, 24 或48小时 )。

4. 向每孔加入10 ml CCK-8 溶液 (注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 O.D值的读数) 。

5. 将培养板在培养箱内孵育 1-4小时。

6. 用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

7. 如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入 10 ml 0.1 M HCl溶液或者1%w/vSDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。

CCK8细胞增值检测实验简介全⼼全意就为医⽣服务，⼀⼼⼀意只为造福医⽣CCK-8（Cell Counting Kit-8）细胞活性和增殖检测是医学研究中常⽤的实验技术，其原理是该试剂中含有WST-8，它在电⼦载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸⼆甲酯（1-Methoxy PMS）的作⽤下被细胞中的脱氢酶还原为具有⾼度⽔溶性的黄⾊甲瓒产物（Formazan dye）。

⽣成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正⽐。

因此可利⽤这⼀特性直接进⾏细胞增殖和毒性分析。

以下是CCK-8检测的具体步骤：细胞活性检测1. 在96 孔板中接种细胞悬液 (100 ml /孔 ) 。

将培养板放在培养箱预培养 (在37 ℃，5% CO2的条件下 )。

2. 向每孔加⼊10 ml 的CCK- 8溶液 (注意不要在孔中⽣成⽓泡，它们会影响 O.D值的读数) 。

3. 将培养板在培养箱内孵育 1-4⼩时。

4. ⽤酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

5. 如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可以向每孔中加⼊ 10 ml0.1 M HCl溶液或者1% w/vSDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。

在24⼩时内吸光度不会发⽣变化。

细胞增殖 -毒性检测1. 在96 孔板中配制 100 ml的细胞悬液。

将培养板在培养箱预培养 24⼩时 ( 在37℃， 5% CO2的条件下 )。

2. 向培养板加⼊10 ml不同浓度的待测物质。

3. 将培养板在培养箱孵育⼀段适当的时间 (例如: 6,12, 24 或48⼩时 )。

4. 向每孔加⼊10 ml CCK-8 溶液 (注意不要在孔中⽣成⽓泡，它们会影响 O.D值的读数) 。

5. 将培养板在培养箱内孵育 1-4⼩时。

6. ⽤酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

7. 如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可以向每孔中加⼊ 10 ml 0.1 M HCl溶液或者1%w/vSDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。

cck8检测细胞增殖原理细胞增殖是生命体系中的一个基本过程，其对于维持细胞数量及体内组织器官的发育和功能至关重要。

CCK-8检测方法是一种用来测定细胞增殖的实验技术，也是目前使用较广泛的一种方法之一。

CCK-8（Cell counting kit-8）是一种基于Tetrazolium盐化学反应原理，用于测定活细胞数量的试剂盒。

CCK-8试剂通过标记的化学染料检测细胞增殖，并建立与增殖程度的数量关系。

CCK-8检测细胞增殖原理主要包括以下几个方面：首先，CCK-8试剂通过不同途径进入细胞内部，其中主要途径包括内吞作用和扩散作用。

CCK-8试剂通过细胞膜进入细胞内部，与活细胞中存在的过氧化物酶（peroxidase）发生作用，形成的紫红色终产物被吸收于细胞质中。

其次，CCK-8试剂在细胞内和细胞活性产生的代谢物质，如可溶性氧化物和还原剂，进行化学反应，使化学试剂发生颜色的变化。

CCK-8试剂的还原剂从浅黄色到橙红色，与细胞活性的增加成正比。

最后，CCK-8试剂与细胞中的NADH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）、NADPH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）等酵素发生作用，形成紫色的形成物。

总之，CCK-8检测细胞增殖原理可以归纳为：CCK-8试剂通过内吞和扩散作用高效进入细胞内部，与细胞中存在的过氧化物酶发生作用，形成的产物被吸收于细胞质中。

进而通过代谢反应和化学反应，与细胞活性产生的代谢物质发生反应，最终形成特定颜色的化学反应产物。

这种产物的颜色强度或吸光度强度可以反映出细胞数或细胞活性的变化。

从而可以测定细胞增殖的程度及其对药物、化合物等作用的评估。

CCK-8检测方法具有操作简便、结果准确、数据稳定等特点，因此在细胞培养和细胞增殖分析等领域得到广泛应用。

该技术的应用可以为生命科学和药学研究提供重要的实验手段和数据支持。

CCK8实验原理与步骤CCK-8实验（Cell Counting Kit-8）是一种常用的细胞增殖和细胞毒性测定实验方法。

CCK-8试剂可以通过还原机制，测量细胞内的活性代谢物质水平，从而评估细胞数量和活力。

以下是CCK-8实验的基本原理和步骤。

实验原理：CCK-8试剂中含有一种缩合的四氢噻唑并噻吩偶吡啉（WST-8）和电子传递剂1-甲基噻唑盐（MTS）。

细胞内的代谢酶可以将WST-8还原成橙红色的形成物形成溶液。

这个形成物可以通过光度计检测，并与细胞数量和代谢活性成正比。

所以，通过测量形成物的光吸收度，可以获得细胞的增殖和毒性信息。

实验步骤：1.细胞培养准备：将待测细胞分散在完全培养基中，并按照常规方法培养至适当的细胞密度。

2.细胞悬液准备：将培养的细胞用PBS缓冲液洗涤一次，然后用PBS 缓冲液重新悬浮至适当的浓度。

3.细胞计数：使用仪器（如细胞计数器）计数细胞的数目。

如果没有细胞计数器，则可以使用显微镜和计数板手工计数。

4.细胞接种：将细胞分散在细胞培养板或96孔板中，使得每个孔的细胞数目相等。

通常可以根据实验需求设定各组的重复孔数。

5.处理组别：根据实验设计，在每个组中添加不同浓度的药物处理。

同时设置一个对照组（只添加培养基），以便比较。

6.增殖处理：将细胞培养在适当的条件下（如37°C，5%CO2）孵育一定时间。

孵育时间取决于具体实验需求和细胞类型。

K-8试剂处理：在孵育结束后，添加CCK-8试剂到每个孔中，使其最终浓度达到指定浓度。

通常浓度为1/10到1/100倍的CCK-8试剂：细胞悬液体积。

在这个步骤中，也可以添加几种不同的浓度以确定最佳浓度应用于未来的实验。

8.孵育：将试验板放回培养箱中，继续孵育一段时间。

孵育时间可以根据实验设计确定，通常为2-4小时。

9. 吸光度测量：在孵育结束后，使用酶标读板机或其他光度计测量每个孔中形成物的吸光度。

根据实验目的，可以选择470nm或450nm波长。

CCK８检测细胞增殖/毒性得原理、方法及注意事项一、CＣK8检测细胞增殖/毒性得原理Cｅｌl Ｃouｎting Kiｔ—8(简称CCK－8)试剂可用于简便而准确得细胞增殖与毒性分析。

其基本原理为:该试剂中含有ＷSＴ—8【化学名:2—(２—甲氧基—４-硝基苯基)－3-(4-硝基苯基)-5—(2,4—二磺酸苯)－２H—四唑单钠盐】,它在电子载体1－甲氧基-5－甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(１—Ｍethｏxy PＭＳ)得作用下被细胞中得脱氢酶还原为具有高度水溶性得黄色甲瓒产物(Foｒmazａn dye)。

生成得甲瓒物得数量与活细胞得数量成正比。

因此可利用这一特性直接进行细胞增殖与毒性分析、用途:药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验ﻫCCK8得优点:•使用方便,省去了洗涤细胞,不需要放射性同位素与有机溶剂;•ＣCＫ-8法能快速检测;•CＣK—8法得检测灵敏度很高,甚至可以测定较低细胞密度;•ＣＣK－8法得重复性优于ＭTT法;•CCK－8法对细胞毒性小;•CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液,毋需预制,即开即用。

ﻫＣCＫ8得缺点:•与MＴT法相比,CCK8与XTT得价格比较贵。

•CCK8试剂得颜色为淡红色,与含酚红得培养基颜色接近,不注意得话容易产生漏加或多加。

ﻫ与以往得增殖/毒性测定试剂相比较:ﻫ检测方法MTT法XＴT法WST－1法CCＫ8法甲臢产物得水溶性差(需加有机溶剂溶好好好解)产品性状粉末2瓶溶液溶液1瓶溶液使用方法配成溶液后使用现配现用即开即用即开即用检测灵敏度高很高很高高检测时间较长较短较短最短检测波长560-６0０nm ４2０-48０nm４20-4８0nｍ4３0—490ｎm细胞毒性高,细胞形态完全消失很低,细胞形态不变很低,细胞形态不变很低,细胞形态不变试剂稳定性一般较差一般很好批量样品检测可以非常适合非常适合非常适合便捷程度一般便捷便捷非常便捷ﻫ二、CCK８检测细胞增殖/毒性得方法ﻫ实验一:细胞增殖分析1、制备细胞悬液:细胞计数2、接种到９6孔板中:根据合适得铺板细胞数,每孔约100ul细胞悬液,同样得样本可做3个重复。

细胞增殖-毒性实验步骤令狐采学1、细胞传代、细胞计数、细胞增殖-毒性实验步骤：实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线消毒30分钟（枪、枪头、15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复温实验所需试剂[细胞培养液（DMEM、1640）、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、胰酶（0.25% Trypsin-EDTA）、胎牛血清（FBS）、双抗]，所有的试剂、仪器放入生物安全柜前要用酒精喷洒消毒。

显微镜下看细胞生长状态，有无污染。

1）倒去培养瓶内的培养液；2）加入PBS 2ml洗涤培养瓶内细胞2次；3）加入胰酶500ul/0.5ml 2～10min（具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）；4）加入含10%FBS的培养液1～1.5ml[培养液：胰酶=（2～3）:1]中和胰酶；5）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜；6）将单细胞悬液吸入10～15ml离心管中，低速离心800rpm 3分钟，倒去上清液；7）加入含10%FBS细胞培养液1～2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液；8）吸取20ul细胞悬液（10ul细胞悬液+10ul台盼兰液：给坏死细胞染色，判断细胞活力）至细胞计数板，进行细胞计数；CCK-8实验：9）在96孔板中，给每孔加100μL（约7000个）的细胞悬液，将培养板放在培养箱预培养24-72小时（37℃，5%CO2），使细胞贴壁；10）向培养板中加入10μL不同浓度（5、10、20、40、80、160ug/ml）的待测药物；11）将培养板在培养箱孵育一段适当的时间24小时（例如：6、12、24或48小时）（药物起作用）；注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然。