一株溶藻菌的分离、鉴定及其溶藻物质的研究

溶藻细菌及其溶藻活性物研究进展刘萍【摘要】利用溶藻细菌及其产生的溶藻活性物控制有害藻华是未来最有发展潜力的生物控制方法之一.对溶藻细菌类群、溶藻活性物、溶藻作用方式及溶藻机制进行综述,并在此基础上对溶藻细菌的研究进行展望.【期刊名称】《环境污染与防治》【年(卷),期】2016(038)009【总页数】7页(P86-92)【关键词】溶藻细菌;溶藻活性物;有害藻华;机制【作者】刘萍【作者单位】滨州学院资源环境系,山东滨州256600【正文语种】中文有害藻华(HABs)包括海洋赤潮和淡水水华，自20世纪70年代起，被公认为是世界范围的水生态污染问题之一。

当HABs发生时，水生态环境遭到严重破坏。

由于大量藻类死亡，消耗水体氧气，需氧生物因缺氧大量死亡，不仅严重危害到水产养殖业，与水体相关的旅游行业也受到牵连。

据统计，美国每年由于HABs造成的经济损失高达几十亿美元[1]。

不仅如此，迅速繁殖的有毒藻类会向水环境释放大量毒素，这些毒素可通过食物链进入人体，进一步对人类健康造成威胁。

HABs在全球范围内的发生率仍然在持续增长，发生HABs的水域包括海洋、湖泊以及内陆水库，比如非洲的维多利亚湖、北美洲的伊利湖、欧洲的波罗的海和亚洲的太湖等[2]。

因此，迫切需要有效且环境友好的措施来治理HABs。

早期的HABs 治理主要采用物理方法，如利用絮凝剂、黏土等，或进行人工打捞、挖掘[3-4]，但是物理方法对HABs发生面积较大的区域适应性不强。

而采用化学方法，如使用硫酸铜制剂、表面活性剂等[5-6]，会造成环境的二次污染。

近年来，考虑到生态环境等因素，环境工作者将研究重点转移至生态方法和生物方法，采用大型植物、浮游动物或微生物去除富营养化水体中的N、P等营养元素，达到预防及治理HABs的目的。

溶藻细菌具有种类多、繁殖快、分布广、代谢类型多样等特点，且专一性强、高效、二次污染低、环境友好、成本低廉，越来越受到环境工作者的重视；而其分泌的溶藻活性物也备受关注，越来越多的溶藻活性物被分离纯化，为溶藻仿生制剂的研发提供了新的契机。

醋酸钙不动杆菌的分离鉴定及溶藻特性王赟;张业猛;李佩佩【摘要】淡水微囊藻水华不仅造成水体动植物缺氧死亡，而且释放藻毒素，影响人类和其它动物的健康。

利用液体感染技术，从河南省平顶山市白龟山水库分离一株能够溶解铜绿微囊藻PCC 7806的溶藻菌，命名为溶藻菌5，16S rDNA核苷酸序列测序证实该菌株为醋酸钙不动杆菌。

它具有一定的溶藻特异性，只溶解PCC 7806，对FACHB-930和斜生栅藻没有影响，能够促进衣藻和红球藻的生长。

最佳溶藻体积比为1∶1。

溶藻菌5的菌体和无细胞培养物均具有相同的溶藻效果。

显微观察藻细胞被溶解的黄化液显示细菌并未附着在藻细胞周围，也无菌胶膜形成。

表明溶藻菌5可能通过释放杀藻物质和与藻竞争营养物质两种机制溶解藻细胞。

%The microcystis bloom not only result in the death of the aquatic animals due to hypoxia, but also produce mycrocystins which is harmful to the human beings and wild animals. One algicidal bacterium against toxicMicrocystis aeruginosa PCC 7806 was isolated from the Baiguishan Reservoir in Pingdingshan of Henan province using liquid infection technology and was named algicidal bacterium 5. The 16S rDNA sequence analysis indicated that this bacterium belongs toAcinetobacter calcoaceticus. It specifically removes PCC 7806 by cell lysis, but has no effect on FACHB-930 andScenedesmus obliquus. Interestingly, the growth of haematococcus andChlamydomonas reinhardtii are promoted. The algicidal effect of bacterium against PCC 7806 is better when the volume ratio of 1∶1. The thalli and cell-free filtrate shows the same lytic effect. There are no bacteria adhering to the surface of the PCC 7806. And nobacterial biofilm were observed. These results may suggest that TheA. calcoaceticusmay secrete substance and compete for nutrients to remove PCC 7806.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2015(000)003【总页数】6页(P140-145)【关键词】溶藻菌;醋酸钙不动杆菌;16S rDNA;铜绿微囊藻;溶藻特性【作者】王赟;张业猛;李佩佩【作者单位】河南城建学院生命科学与工程学院，平顶山 467036;河南城建学院生命科学与工程学院，平顶山 467036;河南城建学院生命科学与工程学院，平顶山 467036【正文语种】中文近年来水体富营养化日益加剧，水华现象频繁发生，致使水体恶化严重，我国有限的淡水资源愈加匮乏。

溶藻菌的分离及其对铜绿微囊藻溶藻特性的研究溶藻菌的分离及其对铜绿微囊藻溶藻特性的研究溶藻菌是一种能够降解藻类细胞壁并释放藻胞内物质的细菌，对于藻类生态系统的稳定性具有重要作用。

本文旨在介绍溶藻菌的分离方法，并研究其对铜绿微囊藻的溶藻特性。

通过这项研究，人们可以更好地认识溶藻菌的作用机制，进一步推动藻类生态系统的保护和修复。

首先，我们需要分离溶藻菌。

采样地点选择在铜绿微囊藻繁殖较为丰富的水域，如湖泊或水库。

采用传统的培养基，将水样接种于琼脂平板培养基上，培养出单菌落后进行纯化。

通过进行形态观察、生理生化检测以及基因测序等方法可以鉴定溶藻菌的种类。

最后，将纯化后的菌株保存以备后续实验使用。

接下来，我们研究溶藻菌对铜绿微囊藻的溶藻特性。

首先，在实验条件下培养出一定浓度的铜绿微囊藻。

然后，将不同种类的溶藻菌接种于含有铜绿微囊藻的培养基中，建立菌藻共生体系。

通过监测铜绿微囊藻生长的光密度、叶绿素含量以及细胞数目等指标，可以评估溶藻菌对藻类的溶解效果。

在实验过程中，研究人员发现不同溶藻菌对铜绿微囊藻的溶藻效果存在差异。

有些溶藻菌能够迅速降解铜绿微囊藻细胞壁，释放出藻胞内物质，限制藻类的生长。

而有些溶藻菌对铜绿微囊藻影响较小，甚至对其生长有促进作用。

这表明溶藻菌的种类和数量对藻类生态系统的影响非常重要。

此外，溶藻菌的溶藻机制也是研究的重点之一。

通过对溶藻菌分泌的溶藻酶进行分析，研究人员发现溶藻菌通过释放酶来分解藻类细胞壁，并吸收其中富含的营养物质。

这不仅揭示了溶藻菌的溶藻机制，也为微囊藻类繁殖的控制提供了一种新的思路。

综上所述，溶藻菌的分离及其对铜绿微囊藻的溶藻特性研究对于藻类生态系统的保护和修复具有重要意义。

通过深入研究溶藻菌的作用机制，人们可以寻找到一种更加有效的方法来控制藻类的繁殖，保护水域环境的健康。

此外，这项研究还为微生物资源的利用提供了新的途径，有助于推动生态学领域的研究和应用综合以上研究结果，溶藻菌对铜绿微囊藻的溶解效果存在差异，有些溶藻菌能够有效降解铜绿微囊藻细胞壁，限制藻类的生长，而有些溶藻菌对其影响较小甚至具有促进作用。

溶藻细菌及其作用物质研究进展张忠良1胡兴龙2马增岭1，2李仁辉1，2张和1，2*（1温州大学生命与环境科学学院，浙江温州325035；2温州大学城镇水污染生态治理技术国家地方联合工程研究中心，浙江温州325035）摘要随着全球气候变化和水体富营养化程度加剧，蓝藻水华已经成为一个世界性环境问题，不但对水生生态系统有许多负面影响，还会严重威胁公共卫生安全。

蓝藻水华的治理技术主要包括物理法、化学法和生物法等。

近年来，溶藻细菌作为一种新型蓝藻水华生物防治方法，因其环境友好、作用特异而受到广泛关注。

目前，已经发现了很多溶藻细菌，并开展了溶藻物质鉴定和溶藻作用机制研究。

本文根据近10年发表的文献，对溶藻细菌种类、溶藻物质作用机理的研究现状进行了归纳，并对未来进一步研究和应用溶藻菌控制蓝藻水华进行了展望。

关键词蓝藻水华；溶藻细菌；溶藻物质；作用机制；应用中图分类号X52文献标识码A文章编号1007-5739（2023）19-0143-07DOI：10.3969/j.issn.1007-5739.2023.19.038开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Research Progress on Algicidal Bacteria and Algae-lysing SubstancesZHANG Zhongliang1HU Xinglong2MA Zengling1,2LI Renhui1,2ZHANG He1,2*(1College of Life and Environmental Science,Wenzhou University,Wenzhou Zhejiang325035;2National and Local Joint Engineering Research Center of Urban Water Pollution Ecological Governance Technology,Wenzhou University,Wenzhou Zhejiang325035)Abstract With the global climate change and intensification of eutrophication,cyanobacteria bloom has become a worldwide environmental problem,which has many negative effects on aquatic ecosystem and seriously threatens public health.The technologies for controlling cyanobacteria bloom mainly include physical,chemical and biological methods.In recent years,algicidal bacteria,as a new biological strategy for controlling cyanobacteria bloom,has received extensive attention due to its environmental friendliness and specific effects.At present,many algicidal bacteria have been discovered,and identification of algal-lysing substances and study on algal-lysing mechanism have been carried out.Basing on the published reports in the past10years,the research status of the types of algicidal bacteria and the action mechanism of algal-lysing substances were summarized,and prospects for further research and application of algicidal bacteria in controlling cyanobacteria bloom were presented.Keywords cyanobacteria bloom;algicidal bacterium;algal-lysing substance;action mechanism;application随着气候变化和水体富营养化不断加剧，蓝藻水华频频暴发，现在已成为一个世界性环境问题[1-2]。

第54卷 第5期 2024年5月中国海洋大学学报P E R I O D I C A L O F O C E A N U N I V E R S I T Y O F C H I N A54(5):063~070M a y,2024一株溶藻菌Z o b e l l e l l a s p.B 307对太平洋亚历山大藻的溶藻特性及作用机制研究❋马双慧1,白 洁1,孙鹏飞2,王登宇1,相壮壮1,李 辉1,3,晨 曦4❋❋(1.中国海洋大学环境科学与工程学院,山东青岛266100;2.自然资源部第四海洋研究所,广西北海536000;3.中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室,山东青岛266100;4.中国海洋大学海洋生命学院,山东青岛266003)摘 要: 为研究溶藻菌对赤潮甲藻的作用机制,本文从胶州湾沉积物中分离得到的一株耐盐菌株Z o b e l l e l l a s p.B 307,并研究了该菌株对太平洋亚历山大藻(A l e x a n d r i u m p a c i fi c u m )的抑制效果,从细胞结构㊁生理水平和分子水平探究了该菌株的抑藻途径及作用机制㊂结果表明,该菌株的抑藻途径为分泌胞外活性物质的间接溶藻,72h 的溶藻率高达91%㊂溶藻过程中藻细胞壁破损,叶绿素a 和总蛋白含量显著下降,藻细胞的活性氧(R O S )㊁超氧化物歧化酶(S O D )和过氧化氢酶(C A T )活性显著高于对照组,这表明溶藻物质对藻细胞造成的强烈氧化损伤是导致其死亡的直接原因㊂热休克蛋白基因(H S P )表达量显著上调,说明溶藻物质激发藻细胞产生的R O S 在激活抗氧化系统的同时诱导产生H S P 70,二者联合清除R O S 以减缓藻细胞受应激损伤的程度;A .p a c i fi c u m 的网格蛋白基因(C l a t h r i n )表达量显著上调,表示由网格蛋白介导的胞吞作用明显增强,进而说明为减轻光合营养功能受损造成的影响,藻细胞的异养功能增强㊂本研究结果有助于诠释菌藻关系,更为探究赤潮治理的生物方法提供重要的理论支持和实践指导㊂关键词: 赤潮;亚历山大藻;溶藻细菌;溶藻机理;基因表达中图法分类号: X 172 文献标志码: A 文章编号: 1672-5174(2024)05-063-08D O I : 10.16441/j .c n k i .h d x b .20220180引用格式: 马双慧,白洁,孙鹏飞,等.一株溶藻菌Z o b e l l e l l a s p.B 307对太平洋亚历山大藻的溶藻特性及作用机制研究[J ].中国海洋大学学报(自然科学版),2024,54(5):63-70.M a S h u a n g h u i ,B a i J i e ,S u n P e n g f e i ,e t a l .T h e a l g i c i d a l c h a r a c t e r i s t i c s a n d m e c h a n i s m o f a n a l gi c i d a l b a c t e r i u m Z o b e l l e l l a s p .B 307o n A l e x a n d e r i u m p a c i fi c u m [J ].P e r i o d i c a l o f O c e a n U n i v e r s i t y o f C h i n a ,2024,54(5):63-70. ❋ 基金项目:自然资源部热带海洋生态系统与生物资源重点实验室开放基金课题项目(2021Q N 07)资助S u p p o r t e d b y t h e F u n d o f t h e K e y L a b o r a t o r y o f T r o p i c a l M a r i n e E c o s y s t e m a n d B i o r e s o u r c e s ,M i n i s t r y of N a t u r a l R e s o u r c e s (2021Q N 07)收稿日期:2022-04-23;修订日期:2022-05-11作者简介:马双慧(1997 ),女,硕士生㊂E -m a i l :m i d n i gh t 459@163.c o m ❋❋ 通信作者:晨 曦(1988 ),男,博士,讲师㊂E -m a i l :c h e n x i @o u c .e d u .c n赤潮是指在特定的环境条件(如水体富营养化)下,海水中某些浮游植物㊁原生动物或细菌爆发性增殖或高度聚集而引起水体变色的一种有害生态现象[1],这些赤潮生物可能有剧毒,其大规模爆发性生长对海洋环境乃至人类生产和生活安全造成严重威胁,学术界将这些直接造成危害的赤潮称为有害藻华(H a r m f u la l ga lb l o o m s ,H A B s )[2]㊂近年来由于人类活动导致水体富营养化加剧,有害藻华在全球各海域频发,严重影响海洋生态环境,给养殖业㊁旅游业造成重大损失,同时部分藻类产生的藻毒素严重危害人体健康[3]㊂目前对赤潮的治理方法可大致分为物理法㊁化学法和生物法[4]:物理法主要包括过滤㊁吸附和黏土絮凝沉淀等,但往往无法根除赤潮藻;化学法多为向水体中投加铜离子㊁噻唑㊁光催化材料和酮类衍生物等杀藻剂,但会造成二次污染;生物法主要为引入藻类天敌或微生物,利用竞争关系和捕食关系来控制赤潮,是环保且可持续的治理方法㊂微生物治理赤潮是近些年的热点技术,主要使用能够抑制甚至杀死赤潮藻类的细菌或病毒,这种方法更加切实可行,对环境影响低,并且有良好的发展前景[5]㊂细菌是海洋生态系统的重要组成部分,对平衡藻类种群动态具有重要的调节作用,菌藻关系一直是海洋生态领域的研究热点[6]㊂具有溶藻功能的细菌称为溶藻菌,其溶藻主要分为直接溶藻㊁间接溶藻以及直接与间接结合的溶藻方式㊂通过分泌胞外溶藻物质进行杀藻属于间接溶藻,是目前发现的大多数溶藻菌的溶藻方式㊂迄今为止,已有多个种属的海洋细菌被筛选并被鉴定出具有溶藻作用,如假单孢菌属㊁芽孢杆菌属和不动杆菌属等[7],但Z o b e l l e l l a 属的溶藻作用目前还未见报道㊂中国海洋大学学报2024年亚历山大藻(A l e x a n d r i u m s p.)是一类重要的赤潮甲藻,可以产生麻痹性贝类毒素(P a r a l y t i c s h e l l f i s h t o x i n s,P S T s),对海洋生物和人类造成严重危害,其在全球范围内均有分布,在中国主要分布于青岛㊁浙江和天津等地区的海域[8]㊂目前已有针对太平洋亚历山大藻赤潮治理的多项研究,但利用溶藻菌抑制太平洋亚历山大藻赤潮爆发的研究还较少㊂本研究以一株耐盐菌株Z o b e l l e l l a s p.B307为研究对象,探究该菌对太平洋亚历山大藻(A l e x a n d r i u m p a c i f i c u m)生长的影响,首次发现该菌对A.p a c i f i c u m有极强的抑藻效果㊂本研究中还对该菌的溶藻途径及作用机制进行了分析探讨,以期为深入研究赤潮藻的控制理论及有毒赤潮的防控技术提供理论依据和技术支撑㊂1材料与方法1.1藻种及菌种来源本研究所用藻种A.p a c i f i c u m由中国海洋大学浮游生物实验室提供,株号A T H K;所用菌株由本研究团队从青岛胶州湾沉积物中分离获得[9],经16S r R N A 鉴定,该菌株为Z o b e l l e l l a属,命名为Z o b e l l e l l a s p. B307,其基因序列在G e n B a n k数据库中的登陆号为M F407315㊂1.2溶藻实验将培养至对数增长期的细菌发酵液离心,从而分离获得下层菌悬液和无菌的上清发酵液㊂分别将离心获得的下层菌悬液㊁无菌上清发酵液和未离心处理的含菌发酵液分别加入到三组对数期A.p a c i f i c u m培养体系中继续培养,培养条件为温度20ħ㊁光照5000 L u x㊁光暗比12hʒ12h㊂对照组加入等体积新配制的灭菌细菌培养基㊂培养期间定时取样,用于测定各项指标㊂1.3样品测定1.3.1叶绿素a含量测定与溶藻率计算采用荧光分光光度法测定叶绿素a含量,根据叶绿素a含量计算溶藻率[10]㊂溶藻率计算公式为:溶藻率=对照组C h l a含量-实验组C h l a含量对照组C h l a含量ˑ100%㊂1.3.2细胞形态观察取各组(本文1.2节提到的三级发酵液)培养时间为0㊁6㊁12㊁24㊁48和72h的藻液,用4%的戊二醛溶液(p H=7.0)固定后,直接用于光学显微镜观察细胞形态;用于电镜观察的样品需继续离心后用0.1m o l/L的P B S冲洗,经乙醇梯度脱水和乙醇-叔丁醇(1ʒ1)重悬后,用叔丁醇冲洗,并加叔丁醇于4ħ下保存,冷冻干燥后喷金,用扫描电镜(S E M)观察藻细胞形态㊂1.3.3总蛋白测定总蛋白浓度的测定采用了考马斯亮蓝(B r a d f o r d)法[11],在最大吸收值(波长为595n m)处测定样品吸光度,计算样品中的蛋白质浓度㊂1.3.4抗氧化功能测定(1)活性氧(R e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s,R O S)的测定是利用了D C F H-D A探针㊂在激发波长502n m㊁发射波长530n m处测定吸光值[12],根据荧光强度计算R O S含量㊂(2)过氧化氢酶(C a t a l a s e,C A T)的测定是采用了钼酸铵法[13]㊂在405n m处测其吸光值,计算C A T活性㊂(3)超氧化物歧化酶(S u p e r o x i d e d i s m u t a s e,S O D)的测定是采用了黄嘌呤氧化酶法[14]㊂测定其在550n m处的吸光值,计算S O D活性㊂1.3.5基因表达差异分析(1)藻细胞总R N A提取㊂离心收集分别加入溶藻菌及无菌发酵液后培养的A.p a c i f i c u m,用T r i z o l法提取藻细胞内的总R N A㊂提取时,在藻细胞中放入液氮进行研磨,将研磨后的藻加入到装有预冷T r i z o l的离心管中,加入氯仿及异丙醇,生成R N A沉淀后,再用乙醇漂洗沉淀,沉淀物中加入适量D E P C水溶解,溶解后的R N A于-80ħ下保存㊂(2)反转录及P C R扩增㊂采用索莱宝通用R T-P C R试剂盒,扩增引物序列如表1所示,内参基因序列来自中国海洋大学海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室[15],基因相对表达量用2-әәC t表示㊂表1目的基因引物序列T a b l e1P r i m e r s o f t a r g e t g e n e s基因G e n e引物序列(5 ң3 )P r i m e r s s e q u e n c e(5ң3 )扩增片段长度L e n g t h o fa m p l i f i e df r ag m e n t/b p c o bF:T T T T C T T C A A A C T C A T T T C G GG A T140R:T G G G C A C A G C T T T T A A C A T A GC A T Ac l a t h r i nF:G C A A T G A C A G G T G A C G G A G-G A T T A G85R:G C C T G C T G C C T T C C T T A G A T-G T GH S P70F:C G G T T C C A C A C G T C C A A G T CA G110R:G T G A T G C T C T C G C C A G T G A T-G T A G465期马双慧,等:一株溶藻菌Z o b e l l e l l a s p.B 307对太平洋亚历山大藻的溶藻特性及作用机制研究1.4数据分析将实验样品分为实验组和对照组,每组3个平行样㊂数据结果以平均值ʃ标准差来表示,利用S P S S 软件进行方差分析(O n e w a y AN O V A )和显著性检验,所得结果采用O r i gi n 软件分析作图,使用P r i m e r P r e m i -e r 5.0软件设计引物㊂2 结果与分析2.1溶藻菌的溶藻效率与作用途径将亚历山大藻培养体系分成三组,并分别加入本文1.2节中提到的菌悬液㊁无菌上清发酵液和未离心处理的含菌发酵液,各组溶藻率如图1所示㊂培养72h 后,未离心处理的含菌发酵液组的溶藻率达到91%,说明Z o b e l l e l l a s p.B 307是一株具有高效溶藻作用的细菌㊂无菌上清发酵液组的溶藻率为67%,二者溶藻率相差较大;菌悬液组的溶藻率仅为10.2%,溶藻率远低于其他两组,溶藻效果不显著㊂由此可以确定该菌株通过分泌溶藻活性物质杀藻,溶藻方式为间接溶藻㊂其中,溶藻物质能够持续保持活性,且溶藻菌Z o b e l l e l -l a s p.B 307能够持续分泌溶藻物质㊂(①T h e b a c t e r i a l f e r m e n t a t i o n b r o t h w i t h o u t c e n t r i f u ga t i o n ;②S t e r i l e s u -p e r n a t a n t o f t h e f e r m e n t a t i o nb r o t h ;③B ac t e r i a l s u s pe n s i o n .)图1 Z o b e l l e l l a s p .B 307纯菌及有菌和除菌发酵液对A .p a c i fi c u m 的溶藻率F i g 1 T h e a l g i c i d a l r a t i o o f Z o b e l l e l l a s p.B 307o n A .p a c i fi c u m 2.2溶藻物质对藻细胞形态结构的影响2.2.1光学显微镜下藻细胞形态结构的变化 细胞形态观察可以直观地显示溶藻物质对藻细胞的损伤情况㊂在光学显微镜下,不同处理时间的藻细胞形态变化如图2所示㊂正常藻细胞形态近似球形,表面结构完整,如图2A 所示;当加入溶藻物质处理6h 后,部分藻细胞外壳分离,内壁收缩,如图2B 所示;12h 后,部分藻细胞皱缩变形,如图2C 所示;处理24h 后部分藻细胞开始溶解死亡,同时出现细胞碎片,如图2D 所示;至72h 后91%的藻细胞溶解死亡,培养体系内存在大量细胞碎片㊂(A :正常N o r m a l ;B :6h 内壁收缩6h s h r i n k ;C :12h 皱缩变形12hd e f o r m a t i o n ;D :24h 溶解性死亡24h c y t o l yt i c d e a t h ㊂)图2 溶藻物质不同作用时间的A .p a c i fi c u m 形态变化(光镜)F i g .2 M o r p h o l o g i c a l c h a n g e o f A .p a c i fi c u m o v e r t i m e a f f e c t b y a l g a e -l y s i n g s u b s t a n c e s (o p t i c a l m i c r o s c o pe )2.2.2扫描电镜下藻细胞形态结构的变化 溶藻物质对A .p a c i f i c u m 细胞超微结构的影响如图3所示㊂从图3A 中可以看出,对照组正常的藻细胞表面有突起,近似球状,有甲片和横沟㊂其中,单个藻细胞直径约为20μm ㊂由图3B 可见,经溶藻物质处理6h 后,部分藻细胞外壳出现局部凹陷,表面出现孔洞;由图3C 可见,处理12h 后,部分藻细胞严重皱缩变形,甚至丧失细胞结构,与光学显微镜下的结果相符;处理24h 后大部分藻细胞皱缩变形,同时出现细胞碎片;处理48和72h 后,均发现藻细胞大部分破碎溶解,难以找到完整细胞个体㊂由此可以看出,Z o b e l l e l l a s p.B 307的胞外分泌物对A .p a c i fi c u m 有极强的溶藻作用,溶藻物质使得藻细胞外壁出现破损,细胞质流出,不断皱缩,最后裂解死亡㊂2.3溶藻物质对藻细胞叶绿素a 和总蛋白含量的影响2.3.1对藻细胞叶绿素a 含量的影响 在溶藻物质作用下,A .p a c i fi c u m 的叶绿素a 含量变化如图4A 所示㊂对照组和实验组的叶绿素a 含量在前6h 内相差不大,6h 后实验组的叶绿素a 含量开始下降,并显著低于对照组(P <0.05),72h 实验组叶绿素a 含量已经很低,说明此时90%以上的太平洋亚历山大藻死56中 国 海 洋 大 学 学 报2024年(A :正常N o r m a l ;B :6h 凹陷孔洞6h c o n c a v e a n d h o l e s ;C :12h 皱缩变形12h d e f o r m a t i o n㊂)图3 溶藻物质不同作时间的A .p a c i fi c u m 形态变化(电镜)F i g .3 M o r p h o l o g i c a l c h a n g e o f A .p a c i fi c u m o v e r t i m e a f f e c t b y a l g a e -l y s i n g s u b s t a n c e s (e l e c t r o n m i c r o s c o p e )亡并裂解,导致叶绿素分解或大量流失,最终导致藻细胞的光合作用能力受到严重影响或丧失㊂叶绿素a 是主要的光合色素,能够反应藻细胞的完整性和生长情况㊂亚历山大藻中的叶绿素种类没有丝状藻等大型藻类体内的叶绿素种类多,但亚历山大藻体内的叶绿素a 为自身提供了藻类自养所需要的生理基础,因此叶绿素a 的含量为计算亚历山大藻初级生产力的指标[16]㊂(A :叶绿素a C h l o r o p h yl -a ;B :总蛋白T o t a l p r o t e i n ;:P <0.05,:P <0.01,:P <0.001㊂)图4 溶藻物质对A .p a c i fi c u m 叶绿素a 和总蛋白含量的影响F i g .4 E f f e c t s o f a l g a e -l y s i n g s u b s t a n c e s o n t h e c h l o r o p h yl l a a n d t o t a l p r o t e i n c o n t e n t o f A .p a c i fi c u m 2.3.2对藻细胞总蛋白含量的影响 溶藻物质作用下藻细胞总蛋白含量的变化如图4B 所示㊂在整个实验过程中,实验组和对照组藻细胞的总蛋白质含量在培养的前24h 差别不大,但在之后的培养时间里,对照组的蛋白质含量显著增加,而实验组的显著下降(P <0.05),说明藻细胞内蛋白质发生了变性,或者藻细胞的蛋白质合成能力受到抑制,可见溶藻活性物质对藻细胞蛋白质的抑制或破坏在其溶藻过程中发挥着一定作用㊂蛋白质含量的降低会影响藻细胞的相关功能,使其正常的生理活动无法进行,促进了藻细胞的裂解死亡㊂2.4溶藻物质对抗氧化系统的影响2.4.1对藻细胞R O S 含量的影响 A .p a c i f i c u m 的R O S 含量变化如图5A 所示㊂在整个实验过程中,对照组的R O S 含量变化不大,说明正常情况下藻细胞内的R O S 含量基本维持在一个稳定的水平㊂对加入溶藻活性物质的实验组进行培养,其R O S 含量随时间推移的情况如下:在培养6h 时R O S 含量开始明显上升,约为对照组的2倍;12h 时R O S 含量大幅上升并显著高于对照组(P <0.05);24h 时R O S 含量达峰值,约为对照组的3倍;24h 后R O S 含量开始下降,并在72h 时已低于对照组㊂2.4.2对藻细胞C A T 活性的影响 A .p a c i fi c u m 的C A T 活性变化如图5B 所示㊂对照组的C A T 活性变化范围不大,加入溶藻物质的实验组的C A T 在前6h 内迅速升高至峰值279.14U /m g ,之后开始下降,但在24h 时再次升高,在48h 后迅速下降㊂观察实验组发现,C A T 活性先升高后降低,然后再次升高后再下降,这表明在溶藻物质作用的早期,藻细胞就启动了氧化应激功能,但随藻细胞自我防御机制的启动和氧爆作用[17]的发生的交互作用,作用效果发生波动㊂2.4.3对藻细胞S O D 活性的影响 溶藻物质作用下,藻细胞S O D 活性的变化如图5C 所示㊂从图5可665期马双慧,等:一株溶藻菌Z o b e l l e l l a s p.B 307对太平洋亚历山大藻的溶藻特性及作用机制研究以看出,对照组的S O D 活性在整个实验周期内大致保持不变,说明在正常生理活动中,S O D 活性也是稳定的㊂而加入溶藻活性物质的实验组,其S O D 活性显著高于对照组,其变化趋势与C A T 大致相同,还与藻细胞的生理响应机制有关㊂(A :R O S ;B :C A T ;C :S O D ;:P <0.05,:P <0.01,:P <0.001㊂)图5 溶藻物质对A .p a c i f i c u m 抗氧化系统的影响F i g .5 E f f e c t s o f a l g a e -l y s i n g su b s t a n c e s o n t h e a n t i o x i d a n t s y s t e m o f A .P a c i fi c u m 2.5溶藻物质作用下藻细胞相关蛋白基因表达差异2.5.1热休克蛋白基因表达差异 对A .p a c i fi c u m 的基因表达进行q P C R 检验,溶藻活性物质作用下,藻细胞内热休克蛋白(H e a t s h o c k p r o t e i n s )基因(H S P )表达量的变化如图6所示,可用于验证藻细胞受到氧化损伤的程度㊂从图6可以看出,加入溶藻活性物质12h 后,H S P 70的表达量显著高于0h 时H S P 70的表达量(P <0.05),说明此时H S P 70基因表达上调,诱导热休克蛋白的生成,表明细胞受到外界刺激产生了应激反应㊂24h 时H S P 70基因表达下调,表明H S P 合成受到了抑制㊂图6 溶藻菌作用下A .p a c i fi c u m 蛋白基因表达量变化F i g .6 E f f e c t o f a l g a e -l y s i n g su b s t a n c e s o n t h e r e l a t e d g e n e e x p r e s s i o n o f A .p a c i fi c u m 2.5.2网格蛋白基因表达差异 网格蛋白基因(C l a t h r i n )表达量的结果如图6所示,溶藻活性物质加入后,藻细胞内的C l a t h r i n 表达呈现持续上调趋势㊂12h 时,该基因表达量显著高于0h (P <0.05);24h时,上升趋势减缓㊂这表明溶藻活性物质诱导了A .p a c i fi c u m 网格蛋白产生,胞吞作用也会随之加强[18]㊂3 讨论3.1溶藻菌的溶藻方式本研究结果表明,Z o b e l l e l l a s p.B 307的主要溶藻方式是细菌胞外活性分泌物间接溶藻,且具有很强的溶藻活性㊂目前已经过验证的溶藻胞外活性物质包括多肽类㊁灵红菌素和某些酯类[19-21]等,有些胞外活性物质具有一定的环境稳定性,经高温㊁冷冻㊁酸碱处理后,仍具备一定的溶藻活性,能够在更复杂多变的自然环境中得以应用,同时具备后续提取加工溶藻制剂的生理基础,表明这种溶藻方式具有广泛的实用性[22-24]㊂3.2藻细胞对溶藻物质的响应机制被溶藻物质作用后,藻细胞结构(如细胞膜㊁细胞核和维持重要功能的细胞器)和生理生化水平均发生变化㊂细胞膜和细胞器受损导致细胞正常的生理活动无法维持,而一些酶活性㊁光合作用和呼吸作用等生理76中国海洋大学学报2024年过程也会受到破坏,藻细胞无法生长甚至会死亡㊂本研究结果表明,Z o b e l l e l l a s p.B307的除菌上清发酵液加入A.p a c i f i c u m培养液体系后,藻细胞在短时间内就迅速产生大量的R O S,说明此时发生了氧爆作用㊂溶藻活性物质对藻细胞造成氧化损伤时,细胞为减轻压力而启动抗氧化系统,抗氧化酶(S O D和C A T)活性增强㊂S O D能够将O2-歧化为H2O2和O2,是抵御氧化压力的第一道防线[25],C A T能够将H2O2氧化为水和氧分子,消除R O S的毒性,防止细胞膜和细胞器被氧化,减轻细胞受到的伤害㊂在溶藻活性物质的不断刺激下,藻细胞持续产生R O S,直到超出藻细胞的抗氧化清除能力时,藻细胞便受到不可逆损伤,导致后期S O D和C A T活性下降,藻细胞抗氧化能力下降㊂同时可以看出,在活性氧的刺激下,相比S O D,C A T的生成要早,同时C A T也更加脆弱,因此在后期C A T活性更难以维持㊂上述结果表明,Z o b e l l e l l a s p.B307的溶藻活性物质会对A.p a c i f i c u m造成强烈的氧化损伤,可能是导致藻细胞死亡的直接原因,此前也有研究证明氧化损伤是溶藻菌发挥溶藻作用的重要途径,王以斌等[26]从F l a v o b a c t e r i u m s p.的胞外活性物质中提取到有溶藻作用的灵菌红素,并通过研究表明该物质确实能升高亚历山大藻细胞内的丙二醛含量,使细胞膜通透性增加,说明藻细胞膜受损,藻体出现氧化损伤㊂Y u 等[27]的研究表明,溶藻菌L Y03分泌出的活性物质能够使中肋骨条藻细胞受损严重,内部细胞器被破坏,抗氧化系统受到损伤,最后裂解死亡㊂3.3藻细胞H S P70和C l a t h r i n基因表达差异H S P是生物体内广泛存在的一种蛋白质,当生物受到外界环境刺激(如高温㊁紫外线㊁酸㊁碱㊁氧化剂等)时,细胞会被诱导而生成H S P,以用于抵抗恶劣外界环境的损害,从而保护生物体㊂氧化损伤产生的过量R O S可以诱导H S P的产生,H S P同抗氧化酶一样,都具有清除R O S的功能㊂常见的H S P有H S P60㊁H S P70㊁H S P90㊁s H S P(小分子热休克蛋白)[28]等㊂H S P在蛋白的合成过程中发挥着重要作用,H S P70具有修复机制,广泛存在于生物体内,当生物受到外界环境胁迫时,H S P70会上调,诱导合成H S P,提高生物体对不利环境的耐受能力㊂W a n g等[29]研究了多个参与抗氧化系统胁迫响应的基因后发现,A.p a c i f i c u m细胞的C u/Z n-S O D基因和H S P70基因在铜离子的作用下出现显著上调,因此认为,在金属离子或其他外界因素的刺激下,这些基因对外界刺激引起的应激具有重要的保护作用㊂W a n g等[30]的研究表明,细菌S a g-i t t u l a s t e l l a t a对海洋微拟球藻具有显著溶藻作用,使藻细胞中的r b c S基因和P C N A基因的转录受到抑制, H S P基因表达显著上调㊂本研究中,H S P70基因表达量表现为先升高后降低,结合有关R O S和抗氧化酶(S O D和C A T)的研究结果进行判断可知,藻细胞受到溶藻活性物质刺激产生了大量R O S,然后利用抗氧化酶去除藻细胞中的R O S,并同时诱导藻细胞产生H S P,因此推测H S P通过与抗氧化酶联合而清除R O S㊂但随着活性氧持续大量的产生,超出了抗氧化系统的应对能力,最终藻细胞的应激系统受到不可逆的破坏㊂网格蛋白是一类比较保守的蛋白,能够介导膜蛋白进行胞吞作用,动㊁植物细胞普遍存在由网格蛋白介导的胞吞作用,这一作用对生物的生长繁殖有重要的意义㊂网格蛋白形成的披蛋白网格小泡(C l a t h r i n-c o a-t e d v e s i c l e)是细胞内吞的重要结构㊂网格蛋白不仅是介导主要胞吞作用的蛋白质,同时还影响到细胞的信号转导和代谢平衡[30]㊂M e n g等[31]的研究发现,N和P能够使得微小亚历山大藻(A.m i n i t u m)细胞中由网格蛋白介导的胞吞作用显著上升,在长期的营养缺乏条件下,编码网格蛋白㊁A P-2和H s c70蛋白的u n i-g e n e s显著上调,营养物进入A.m i n i t u m细胞主要依靠网格蛋白依赖的内吞作用,说明在营养缺乏的条件下,A.m i n i t u m具有混合营养的倾向㊂张淑雯等[32]已发现链状亚历山大藻(A.c a t e n e l l a)有摄食外源有机物的能力,但科学界普遍认为混合营养模式大多数发生在贫营养的情况下,亚历山大藻并不把异养作为主要能量获取的来源㊂Z h a n g等[33]对A.c a t e n e l l a进行转录组分析发现了与网格蛋白依赖性内吞作用相关的23种蛋白同源的131个u n i g e n e s,因此判断由网格蛋白介导的胞吞作用可能在异养过程中发挥着重要作用㊂本研究发现,在12h内,溶藻活性物质使A. p a c i f i c u m细胞编码网格蛋白基因(C l a t h r i n)表达量显著增加,推测溶藻物质使藻细胞的光合系统受到严重损伤时,由光合作用主导的自养过程无法正常进行,细胞为维持自身的生理活动而启动了异养功能㊂4结论(1)溶藻菌Z o b e l l e l l a s p.B307对A.p a c i f i c u m 具有显著的溶藻作用,主要通过胞外分泌物间接溶藻㊂(2)溶藻物质的作用机制:激发藻细胞产生R O S,并激活抗氧化酶(S O D和C A T)清除R O S;但由于溶藻物质的持续作用,过量的活性氧自由基导致氧化系统崩溃,最终导致藻细胞受损死亡;溶藻活性物质对藻细胞蛋白质的抑制或破坏在其溶藻过程中也发挥着间接作用㊂(3)藻细胞的氧化应激诱导热休克蛋白的产生,从而联合抗氧化酶清除过量的R O S,以减缓藻细胞受应激损伤的程度㊂此外,网格蛋白基因(C l a t h r i n)表达量865期马双慧,等:一株溶藻菌Z o b e l l e l l a s p.B307对太平洋亚历山大藻的溶藻特性及作用机制研究的显著上调说明溶藻活性物质增强光合营养功能损伤诱导A.p a c i f i c u m的异养功能,以应对光合自养功能损害的影响㊂参考文献:[1]P a t e l S S,L o v k o V J,L o c k e y R F.R e d t i d e:O v e r v i e w a n d c l i n i-c a l m a n i f e s t a t i o n s[J].T h e J o u r n a l o f A l l e r g y a nd C l i n i c a l I m m u-n o l o g y:I n P r a c t i c e,2020,8(4):1219-1223.[2] H o f b a u e r W K.T o x i c o r o t h e r w i s e h a r m f u l a l g a e a n d t h e b u i l t e n-v i r o n m e n t[J].T o x i n s,2021,13(7):465-465.[3]F l e m i n g L E,K i r k p a t r i c k B,B a c k e L C,e t a l.R e v i e w o f F l o r i d a r e d t i d e a n d h u m a n h e a l t h e f f e c t s[J].H a r m f u l A l g a e,2010,10(2):224-233.[4]周名江,于仁成.有害赤潮的形成机制㊁危害效应与防治对策[J].自然杂志,2007(2):72-76.Z h o u M J,Y u R C.M e c h a n i s m s a n d i m p a c t s o f h a r m f u l a l a g a e b l o o m s a n d t h e c o u n t m e a s u r e s[J].C h i n e s e J o u r n a l o f N a t u r e, 2007(2):72-76.[5] T a n a k a Y,A s a o k a K,T a k e d 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a c t e r i u m s p.a n d i t s a l g i c i d a l e f f e c t o n r e d t i d e a l g a e A l e x a n-d r i u m t a m a r a n s e[J].C h i ne s e J o u r n a l of M a r i n e D r ug s,2008,27(6):1-4.[27] Y u X Q,C a i G J,W a n g H,e t a l.F a s t-g r o w i n g a l g i c i d a l S t r e p t o-m y c e s s p.U3a n d i t s p o t e n t i a l i n h a r m f u l a l g a l b l o o m c o n t r o l s[J].J o u r n a l o f H a z a r d o u s M a t e r i a l s,2018(341):138-149.[28] T a g h a v i z a d e h Y,A m i r i M S,N o u r b a k h s h F,e t a l.B i o-i n d i c a t o r si n c a d m i u m t o x i c i t y:R o l e o f H S P27a n d H S P70[J].E n v i r o n-m e n t a l S c i e n c e a n d P o l l u t i o n R e s e a r c h I n t e r n a t i o n a l,2021,28(21):26359-26379.[29] W a n g H,K i m H,K i J S.T r a n s c r i p t o m e s u r v e y,m o l e c u l a r i d e n-t i f i c a t i o n,a n d e x p r e s s i o n a n a l y s i s o f s t r e s s-r e s p o n s i v e g e n e s i n t h e t o x i c d i n o f l a g e l l a t e A l e x a n d r i u m p a c i f i c u m u n d e r a l g i c i d a la g e n t s a n d m e t a l s t r e s s e s[J].J o u r n a l o f A p p l i e d P h y c o l o g y,2021,33:1-13.[30] W a n g M,Y u a n W Q,C h e n S,e t a l.A l g a l l y s i s b y S a g i t t u l as t e l l a t a f o r t h e p r o d u c t i o n o f i n t r a c e l l u l a r v a l u a b l e s[J].A p p l i e dB i o c h e m i s t r y a n d B i o t e c h n o l o g y,2021,193(3):2516-2533.[31] M e n g F Q,S o n g J T,Z h o u J,e t a l.T r a n s c r i p t o m i c p r o f i l e a n ds e x u a l r e p r o d u c t i o n-r e l e v a n t g e n e s o f A l e x a n d r i u m m i n u t u m i n r e s p o n s e t o n u t r i t i o n a l d e f i c i e n c y[J].F r o n t i e r s i n M i c r o b i o l o g y, 2019,10:2629.[32]张淑雯,欧林坚,吕颂辉,等.光照及营养盐对3种赤潮甲藻吞噬营养行为的影响[J].海洋科学,2011,35(4):94-99.Z h a n g S F,O u L J,L v S H,e t a l.E f f e c t s o f l i g h t a n d n u t r i e n t s o n t h e p h a g o t r o p h i c b e h a v i 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t u r a l R e s o u r c e s,B e i h a i536000,C h i n a;3.K e y L a b o r a t o r y o f M a r i n e E n v i r o n m e n t a n d E c o l o g y,M i n i s t r y o f E d u c a t i o n,O c e a n U n i v e r s i t y o f C h i n a,Q i n g d a o266100,C h i n a;4.C o l l e g e o f M a r i n e L i f e S c i e n s-e s,O c e a n U n i v e r s i t y o f C h i n a,Q i n g d a o266003,C h i n a)A b s t r a c t:I n o r d e r t o s t u d y t h e a l g i c i d a l m e c h a n i s m o f a l g i c i d a l b a c t e r i a o n r e d t i d e d i n o f l a g e l l a t e,a s a l t-t o l e r a n t b a c t e r i u m Z o b e l l e l l a s p.B307w i t h a l g i c i d a l a c t i v i t y t o t h e A l e x a n d r i u m p a c i f i c u m w a s i s o l a t e d f r o m t h e s e d i m e n t s o f J i a o z h o uB a y.T o e x p l o r e t h e a l g i c i d a l m e c h a n i s m o f Z o b e l l e l l a s p.B307, w e i n v e s t i g a t e d i t s e f f e c t o n t h e c e l l u l a r s t r u c t u r e,p h y s i o l o g y l a n d m o l e c u l a r m e c h a n i s m o f A.p a c i f i-c u m.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e i n h i b i t i o n m e c h a n i s m o f t h e s t r a i n w a s i n d i r e c t l y t i c e f f e c t s c a u s i n g b y e x t r a c e l l u l a r a c t i v e s u b s t a n c e s.A n d a f t e r72h c u l t i v a t i o n w i t h b a c t e r i u m a d d i t i o n,t h e a l g i c i d a l r a t e r e a c h e d u p t o91%,r e v e a l i n g i t s s t r o n g a l g i c i d a l a c t i v i t y a g a i n s t A.p a c i f i c u m.M e a n w h i l e,w e o b-s e r v e d c e l l w a l l d a m a g e,c h l o r o p h y l l-a a n d t o t a l p r o t e i n c o n t e n t s d e c r e a s e,a n d t h e e x c e s s i v e p r o d u c t i o n o f r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s(R O S),s u p e r o x i d e d i s m u t a s e(S O D)a n d c a t a l a s e(C A T).I t i n d i c a t e d t h a t t h e s e r i o u s o x i d a t i v e d a m a g e c a u s e d b y a l g a e-l y s i n g s u b s t a n c e s w a s t h e d i r e c t c a u s e o f A.p a c i f i c u m d e a t h.T h e e x p r e s s i o n l e v e l o f h e a t s h o c k p r o t e i n(H S P)g e n e w a s s i g n i f i c a n t l y u p r e g u l a t e d,s u g g e s t i n g t h a t a l g a e-l y s i n g s u b s t a n c e s c o u l d i n d u c e t h e p r o d u c t i o n o f H S P,a n d t h e c o m b i n e d e f f e c t s o f h i g h l y e x-p r e s s e d H S P a n d h i g h l y a c t i v i t e d a n t i o x i d a n t s y s t e m o f A.p a c i f i c u m c o u l d e l i m i n a t e R O S a n d a l l e v i a t e t h e a l g a e c e l l s d a m a g e c a u s e d b y o x i d a t i v e s t r e s s.I n a d d i t i o n,t h e e x p r e s s i o n o f A.p a c i f i c u m c l a t h r i n g e n e w a s s i g n i f i c a n t l y u p r e g u l a t e d,i n d i c a t i n g a l g a e c e l l s c o u l d e n h a n c e d h e t e r o t r o p h i c f u n c t i o n t o c o m-p e n s a t e t h e l o s s o f p h o t o s y n t h e s i s c a u s e d b y a l g a e-l y s i n g s u b s t a n c e s.T h e r e s u l t s o f t h i s s t u d y w i l l c o n-t r i b u t e t o e x p l a i n t h e n e w l y f o u n d e d r e l a t i o n s h i p b e t w e e n b a c t e r i a a n d a l g a e,a n d e x p l o r e t h e n e w b i o-l o g i c a l m e t h o d s o f r e d t i d e c o n t r o l.K e y w o r d s:r e d t i d e;A l e x a n d r i u m s p.;a l g i c i d a l b a c t e r i a;a l g i c i d a l m e c h a n i s m;g e n e e x p r e s s i o n责任编辑高蓓07。