实验一大肠杆菌DNA的提取

实验一大肠杆菌基因组提取简介大肠杆菌(Escherichia coli)是一种常见的肠道菌，其基因组结构简单，可以用于实验室中的基因工程。

本实验将介绍如何从大肠杆菌中提取基因组DNA，并进行后续的测序和分析。

材料- 大肠杆菌菌株- SDS（1%）- NaCl(5M)- EDTA(0.5M)- 三氯乙酸(CTAB)细胞裂解缓冲液（含Tris-HCl,pH8.0、NaCl、CTAB和EDTA）- 氯仿- 异丙醇- TE缓冲液（pH8.0）- 75%酒精- 100%酒精步骤1. 建立大肠杆菌沙门氏菌联合培养通过将大肠杆菌菌株与沙门氏菌菌株联合培养，可以使大肠杆菌更具韧性，可以在更苛刻的条件下生存。

因此，在进行基因组提取前，可以将大肠杆菌与沙门氏菌一同培养。

具体步骤如下：1.1 从大肠杆菌与沙门氏菌培养基中选择处于对数生长期的菌株；1.2 筛选出同步菌种进行接吻结合；1.3 将大肠杆菌沙门氏菌接种于 LB 培养基中，进行生长，收集状态良好的菌落。

2. 细胞裂解收集培养的大肠菌细胞，经过洗涤后，加入细胞裂解缓冲液中。

在催化剂SDS的作用下，细胞质膜溶解，使DNA释放到缓冲液中。

2.1 用洗液洗细菌达到OD600为0.6时离心6000g， 10分钟；2.2 将上清液倒掉，沉淀用NaCl水洗涤后，离心6000g， 10分钟；2.3 将沉淀重悬于 Tris-HCl 缓冲液中，加入 SDS 、 NaCl和 EDTA，并在65℃下进行快速震荡混匀，直到完全均匀混合。

3. 蛋白酶和RNA酶的处理使用丙酮和氯仿的混合物沉淀DNA，过滤掉蛋白酶和RNA酶。

3.1 向上清液中加入等体积异丙醇，避免产生气泡，盖紧座析管盖，冰上静置10min 。

3.2 离心12000g 10min，弃取上清层。

将沉淀重悬于 TE 缓冲液中，加入20ug/ml RNase 处理，65℃将体系涡旋5min；3.3 加入等体积氯仿，振荡10min，然后离心12000g 10min ，弃取上清液。

大肠杆菌基因组DNA的提取生技基地实验目的与要求以大肠杆菌培养物为材料，学习基因组DNA提取的一般方法。

实验原理基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交（包括RFLP）及PCR分离基因等。

利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。

加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中，可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。

在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNA。

一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。

而进行RFLP和PCR分析，DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段（20kb以下），并可保证包含PCR 所扩增的片段（一般2kb以下）。

不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同，不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。

在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子。

尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR 反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。

常规实验中从细菌基因组上PCR扩增目的基因时，一般所用的DNA量较少，可以采用较简单的沸水浴裂解法制备少量的DNA。

在短时间的热脉冲下，细胞膜表面会出现一些孔洞，此时就会有少量的染色体DNA从中渗透出来，然后离心去除菌体碎片，上清中所含的基因组DNA即可用于PCR模板。

而对于大量的基因组DNA制备（如Southern Blotting，需大量基因组），可采用试剂盒抽提。

一、大肠杆菌质粒DNA的提取质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。

方法如下：1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。

2、37℃振荡培养过夜。

3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。

4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。

5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。

6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。

7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。

9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。

10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。

11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。

2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。

3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。

4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。

5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。

6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。

7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。

8、取20ml进行电泳检查。

[注意] 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。

2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。

有时不同溶菌酶也能溶菌。

大肠杆菌基因组DNA的提取方式一、传统法提取大肠杆菌基因组DNA。

1、实验原理提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。

SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为光谱蛋白酶，其重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性。

在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白和DNA分离；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。

用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质，最后用无水乙醇沉淀DNA。

为获得高纯度DNA，操作过程中常加入RNaseA除去RNA。

CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定的程度（0.3mol/LNaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖物质分开。

最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。

2、实验试剂与仪器1）实验材料：大肠杆菌2）实验试剂：LB液体培养基，TE溶液，10%SDS，蛋白酶K，5mol/LNaCl，CTAB/NaCl 溶液，酚/氯仿/异戊醇，异丙醇，70%乙醇3）实验仪器：恒温摇床、低温离心机、微量移液器、水浴锅3、溶液配制1）LB液体培养基：细菌培养用胶化蛋白胨10g/L，细菌培养用酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，去离子水。

(搅拌溶解后，用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容100ml，用20/50ml摇瓶分装5瓶，包扎好，在121℃，1.034×105pa高压下蒸汽灭菌20min.)2）TE缓冲液：1MTris溶液（取Tris242.2g，加ddH2O至1600ml，加热溶解）1Mtris-HClpH8.0溶液（取1MTris溶液160ml用分析纯盐酸调至Ph=8.0（需浓盐酸约8.5ml），加ddH2O定容至200ml，高压灭菌备用）TE缓冲液（10mMTris-HCl1MmEDTApH=8.0，1MTris-HClBufferPH=8.05ml0.5MEDTAPH=8.01ml向烧杯中加入约400mlddH2O均匀混合;将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌，室温保存）3）蛋白酶K：（20mg蛋白酶K溶于1ml无菌双蒸水，-20℃备用）4）CTAB/NaCl溶液：（5%w/v，5gCTAB溶于100ml0.5MNaCl溶液中，需加热到65℃使之溶解，然后室温保存）4、实验方法步骤1、将大肠杆菌接种到灭菌好的LB培养基中，一级培养过夜，以10%的接种量进行二级培养，培养至对数期（4-6h）。

大肠杆菌DNA提取实验报告一、引言DNA（脱氧核糖核酸）是构成生物体遗传信息的重要分子，通过提取DNA，可以进行一系列的遗传学研究和实验。

大肠杆菌（Escherichia coli）是常见的一种细菌，它在基因工程和生物技术中具有重要的应用价值。

本实验旨在通过提取大肠杆菌的DNA，了解提取过程及其在实验中的应用。

二、理论基础2.1 DNA提取的原理DNA提取是通过物理、化学等方法将生物样品中的DNA分离出来的过程。

DNA提取的基本步骤包括细胞破碎、蛋白质和RNA去除以及DNA沉淀等。

2.2 大肠杆菌DNA结构大肠杆菌的DNA为环状双链结构，由四种碱基组成：腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）。

DNA分子具有一定的长度和序列，不同的DNA分子序列决定了不同的遗传特征。

三、实验材料与方法3.1 实验材料•大肠杆菌菌液•细胞裂解液•蛋白酶K•异丙醇•氯仿•氯化钠溶液•等温离心管•离心机•丙酮3.2 实验方法1.取适量的大肠杆菌菌液。

2.向细胞裂解液中加入适量的蛋白酶K。

3.在60摄氏度水浴中孵育30分钟。

4.加入等体积的氯仿，并充分混合。

5.离心分离水相和有机相。

6.将上清转移至新的离心管中。

7.加入等体积的异丙醇，并充分混合。

8.离心分离水相和有机相。

9.除去上清，加入氯化钠溶液，混匀。

10.加入等体积的冷异丙醇，混合后离心。

11.除去上清，加入丙酮洗涤。

12.最后离心去除丙酮。

四、实验结果与分析4.1 DNA提取过程观察在实验过程中，观察到细胞裂解液与大肠杆菌菌液接触后，出现了白色混浊的现象。

随着实验进程的推进，通过离心可以看到分离出的水相和有机相，其中水相呈现透明状，而有机相则呈现为混浊的白色液体。

4.2 DNA纯度检测通过使用紫外-可见分光光度计对提取得到的DNA进行检测，测得的吸光度比值（A260/A280）为1.8，表明DNA的纯度较高。

4.3 DNA浓度测定利用光度法对提取得到的DNA溶液进行浓度测定，测得DNA浓度为50 ng/μL。

Protocol:plasmid purification（没有特别提醒，均在冰上进行操作）吸取1.5ml菌液于1.5ml EP管中↓10000g离心，4℃， 5min弃上清，再次加入1.5ml菌液↓10000g离心，4℃，5min弃尽上清（尽量除尽上清，避免培养基中物质干扰纯化）↓取250μL Cell Resuspention Solution（CRS）重悬。

↓在室温下，加入250μL Cell Lysis Solution(CLS) 上下颠倒5次，充分混匀。

↓（混匀后为白色混浊，立即进行下一步，避免质粒被破坏）在室温下，加入10μL Protense Solution 上下颠倒5次，混匀。

↓室温温浴5min在冰上,加入350μL Neutralization Solution上下颠倒5次，充分混匀。

↓14000g 离心，4℃，10min↓取上清液（含有DNA）↓将上清液加入试剂盒提供的柱子中(Filter)↓14000g 离心，4℃，2min↓弃去离心下来的液体（DNA在柱上）↓向柱中加入750μL Wash Solution（已加入95%EtOH）↓14000g 离心，4℃，1min↓弃去离心下来的液体（DNA在柱上）↓向柱中加入250μL Wash Solution（已加入95%EtOH）↓14000g 离心，4℃，2min↓弃掉接收管以及其中的液体，将柱放在EP管上↓向其中加入Nucleas Free Water,100μL，等待5 min，使得质粒能够完全溶解在液体里↓具体Nucleas Free Water体积由质粒浓度定14000g 4℃离心2min↓弃去柱子，液体在EP管中（含有DNA），-20℃保存。

实验一大肠杆菌基因组DNA的提取及电泳鉴定一、琼脂糖凝胶电泳注意的问题：1. 缓冲系统：在没有离子存在时，电导率最小，DNA不迁移，或迁移极慢，在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的使用是否正确。

长时间高压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。

2. 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。

3. 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。

倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。

4. 样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。

5. 电泳系统的变化会影响DNA的迁移，加入DNA标准参照物进行判定是必要的。

6. DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。

7. DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。

采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。

小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。

二、如果提取的DNA中含有蛋白质和RNA污染,应如何解决?蛋白污染可以考虑用酚氯仿多抽提几次,记得吸上清的时候小心点,宁可浪费也别吸到界面.一般后续还需要用氯仿/异戊醇抽提来去除酚.这样基本蛋白污染就可以去干净.实在不行,抽提一次后,就用蛋白酶K消化30min,再抽提.如果DNA多,RNA污染就添加RNase A消化,你可以中途取少量跑胶检测,RNA去干净了再抽提,再沉淀DNA.三、如果提取的DNA产量较低，分析原因并提出解决办法。

1）样本材料老化或反复动容导致DNA含量下降。

质粒dna提取实验报告引言DNA的提取是生物学实验中非常重要的一步，它可以用于后续的分子生物学研究，比如克隆、PCR、基因测序等。

而本次实验的目的是从细菌中提取质粒DNA，并对提取的结果进行分析，评估提取效果。

材料与方法1. 实验材料- 大肠杆菌菌液- 细胞裂解液- RNase A- 莱文斯坦缓冲液- 高盐裂解液- 乙酰盐- 氯仿- 异丙醇- TE液- 离心管等实验仪器和耗材。

2. 实验步骤- 调制莱文斯坦缓冲液，用于细胞裂解和质粒DNA的稳定。

- 预处理大肠杆菌菌液，用高盐裂解液处理使其细胞壁破裂，释放出质粒DNA。

- 添加异丙醇与氯仿，用于分离DNA和其他细胞组分。

- 加入乙酸盐处理DNA上的蛋白质，使其沉淀。

- 用异丙醇洗涤DNA沉淀，去除杂质。

- 用TE液溶解提取得到的DNA。

结果与讨论经实验，我们成功地从大肠杆菌中提取到了质粒DNA。

通过紫外光照射，我们观察到了明亮的DNA带，证明提取得到的DNA具有较高的纯度。

另外，我们还使用琼脂糖凝胶电泳对提取的DNA进行了分析。

从琼脂糖凝胶电泳的结果中，我们观察到细长而连续的DNA 条带，说明提取得到的质粒DNA具有较好的完整性。

此外，我们还注意到，在琼脂糖凝胶中，质粒DNA的迁移速率要快于细菌染色体DNA，这是因为质粒DNA的分子量较小。

在实验的过程中，我们注意到了一些实验技巧和注意事项。

首先，在进行细胞裂解和DNA提取过程中，必须保持材料的无菌状态，以免外源性DNA的污染。

其次，避免在提取过程中显著提高DNA样本的温度，以防止DNA的降解。

最后，注意避免DNA溶液与金属物质接触，因为金属离子可能对DNA具有毒性。

结论通过本次实验，我们成功地从大肠杆菌中提取到了高质量的质粒DNA，并在琼脂糖凝胶上观察到清晰的DNA带。

实验过程中，我们掌握了DNA提取的基本操作技巧和注意事项，这对我们今后的分子生物学研究将产生积极的影响。

然而，本次实验还有一些改进的空间。