蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳配方

蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验目的1.掌握垂直电泳槽的基本操作过程。

2.熟悉SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。

实验原理SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以根据蛋白质分子所带电荷的差异和分子大小的不同产生的不同迁移率，从而将蛋白分离成若干条带。

在催化剂过硫酸铵（APS）和N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（TEMED）的作用下，丙烯酰胺（Acr）和交联剂N，N′-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）聚合交联形成具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。

SDS是一种阴离子表面活性剂，能与蛋白分子结合形成复合物，使蛋白所带的负电荷远远超过其原有的电荷，从而掩盖了各种蛋白分子间原本的电荷差异。

因此，电泳时的迁移率不再受蛋白原有电荷和分子形状的影响。

实验器材垂直电泳槽、电泳仪、移液器、移液器吸头、烧杯等。

实验试剂30%（29∶1）Arc-Bis溶液、分离胶缓冲液（pH8.8）、浓缩胶缓冲液（pH6.8）、TEMED、10%APS、5×蛋白电泳缓冲液、10×蛋白上样缓冲液、蛋白标准液、考马斯亮蓝R-250染色液、考马斯亮蓝脱色液等。

实验操作（1）配制SDS聚丙烯酰胺凝胶：将制胶的凹型玻璃与平玻璃固定在制胶夹板上，确保不漏水后按以下配方配制12%的分离胶。

30%（29∶1）Arc-Bis溶液3ml分离胶缓冲液（pH8.8） 1.95mlH2O 2.55ml10%APS 75μlTEMED 30μl（2）混匀分离胶后，尽快灌至两块玻璃板的间隙中，在距离较短玻璃板2～3cm处停止灌胶，同时加入1～2ml的去离子水覆盖凝胶，室温静置10～20min。

（3）分离胶聚合后倒去水层，用滤纸把剩余水分吸干，按以下配方配制4%的浓缩胶。

30%（29∶1）Arc-Bis溶液650μl浓缩胶缓冲液（pH6.8） 1.3mlH2O 3ml10%APS 50μlTEMED 18μl（4）混匀后将浓缩胶灌注至已聚合的分离胶上，当灌注至与较短玻璃板顶端相齐时，立即插入梳子，同时避免产生气泡。

pH6.8
5%
Gly- Gly-
Gly- Gly-
Gly- Gly-
蛋白质离子
Cl- Cl- Cl-
Cl- Cl- Cl-
Cl- Cl-Cl-
快慢离子的产生 高的电压梯度
pH8.8
10%
Pr-运动加速 浓缩效应
实验原理
• 分子筛效应
主要离子
氯离子 甘氨酸离子(pI5.97)
pH6.8
5% Gly- Gly- - Gly Gly Cl Cl- -Gly Cl- -
蛋白质离子
Gly-GlyGly-Gly-
甘氨酸解离增加 无快慢离子 Pr-根据分子量运动
- - - Cl - Cl -Cl Gly Cl Cl- -Cl Gly Gly Gly Gly Gly
pH8.8
10%
分子筛效应
实验原理
• 分子筛效应
主要离子
氯离子 甘氨酸蛋白质离子 甘氨酸解离增加
加入分离胶溶 液 pH 8.8

封水的目的是使分离胶上表面平直，并排除气泡。 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。
制备浓缩胶(浓缩胶)
样梳需一次平稳插入,梳 口处不得有气泡,梳底需 水平。
插入样品梳
加入浓缩胶溶 液 pH 6.8
分离胶 pH 8.8
样品处理
Sample buffer
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）
实验流程
配胶
配分离胶(下胶)
配浓缩胶(上胶)
样品制备
电泳（1.5~2h） 染色（20min） 脱色（30min~2h） 分析
实验过程
1.装配装置
BG-verMINI型迷你垂直电泳槽 (北京百晶)

SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测 定蛋白质的分子量
实验原理
电泳：是带电颗粒在电场作用下，作定向运动即 向着与其电荷相反的电极移动的现象。 电泳法分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据 各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带净电荷 多少等因素所造成的电泳迁移率的差别。 区带电泳是样品物质在一惰性支持物上上进行电 泳的过程。因电泳后，样品不同组分形成带状区 间，故称区带电泳。
在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的SDS时，蛋白质分子 的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其他因素对电泳 迁移率的影响几乎可以忽略不计。当蛋白质的分子量在 15,000～200,000之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈直线关 系，符合下列方程式：
lg MW=-b·mR+K MW为蛋白质分子量，mR为相对迁移率，b为斜率，k为截 距。在条件一定时，b和K均为常数。 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图， 可获得一条标准曲线。未知蛋白质的相同条件下进行电泳，根 据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
实验步骤
凝胶的制备 蛋白质样品的处理 加样：用微量注射器依次在各个样品槽内加样，各加
10～15μl（含蛋白质10～15μg），稀溶液可加20～30μl
电泳凝胶配方：
30.8%Acr-Bis
1.5mol/l Tris(pH8.9)
0.5mol/l Tris(pH6.7) ddH2O水
10%SDS
10%过硫酸铵AP
3、样品处理与加样 ⑴样品制备
取蔗糖酶样品（样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）各50μl，分别放入1.5ml离心管中， 12000r/min离心10分钟，上清即为电泳样品。 ⑵样品处理
将离心后的上清各取20ul，加入等体积“2×蛋白质样品溶解液”，100℃保温 3分钟，取出冷却后，12000r/min离心2min,取上清直接加样。 ⑶加样

聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质【目的】1 ． 掌握圆盘电泳分离血清蛋白的操作技术。

2 ．熟悉 聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。

【原理】带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动，称为电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE ）就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。

在电泳时，蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小，形状和所带的电荷量有关。

聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺（ Acr ）单体和少量交联剂 N,N- 亚甲基双丙烯酰胺（ Bis ）在催化剂 过硫酸铵（Ap ） 和加速剂 四甲基乙二胺（ TEMED ） 的作用下发生聚合反应而制得的（其化学结构式见第 2 篇第 1 章）。

聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构，其网眼的孔径大小可用改变凝胶液中单体的浓度或单体与交联剂的比例来加以控制。

根据血清蛋白分子量的大小，学生实验一般选用 7 ％聚丙烯酰胺凝胶分离血清蛋白质。

不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳利用浓缩效应、分子筛效应和电荷效应的三重作用分离物质（见第 2 篇第 1 章）， 使样品分离效果好， 分辨率较高。

一般醋酸纤维薄膜电泳只能把血清蛋白质分离出 5 ～ 7 条带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳却能分离出十几条到几十条来（图 3-4 ），是目前较好的支持介质， 应用十分广泛。

图 3-4 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱根据凝胶支持物的形状不同，分为垂直板电泳和盘状电泳两种，二者原理相同。

本实验采用的盘状电泳是在直立的玻璃管中，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系，使样品在不连续的两相间积聚浓缩（浓缩效应）成厚 度 为 10 -2 cm 的起始区带，然后再利用 分子筛效应和电荷效应的双重作用在分离胶中 进行电泳分离。

【器材】1 ．电泳仪直流稳压电源，电压 400 ～ 500V ，电流 50mA 。

2 ．垂直管型圆盘电泳装置目前这类装置的种类很多，可根据不同的实验要求选择其中的一种。