SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤

实验十一SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子质量一、目的要求学习和掌握采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子质量的基本原理和方法。

二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（Acr）和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合交联形成的三围网状结构。

通过改变单体Acr浓度或单体与交联剂的比例可以控制凝胶孔径的大小，这取决于两个重要的参数T和C，其中T是两个单体（Acr和Bis）的总百分浓度，C是与总浓度有关的交联百分浓度。

T=（a+b）/m×100(%) C=b/(a+b)×100(%)式中，a为Acr质量（g）；b为Bis质量（g）；m为水或缓冲液的终体积（mL）。

聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续的和不连续系统两种。

在连续系统中，电泳槽中缓冲液的pH与凝胶中一致，而在不连续系统中上述两者的pH不相同，不连续系统的分辨率较高。

从凝胶形式上可分为柱式或板式。

将凝胶装于垂直的玻璃管中进行电泳分离称柱式电泳，此法制备凝胶方便，样品需要量少，凝胶条便于长期保存；板式电泳的优点是可以在同一凝胶板上同时检测盒比较多个样品，在平板电泳的基础上还建立了分辨率更高的双向电泳。

不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳系统具备三种效应，因此大大提高了分辨率。

(1)浓缩效应：在电泳开始时，样品在浓缩胶与分离胶界面上形成了高度压缩的薄层，作为在分离胶中进一步分离的起始样层，有时甚至能浓缩几百倍。

(2)电荷效应：蛋白质混合物在界面处被高度浓缩，形成一狭小的高浓度的蛋白质区带。

由于每种蛋白质分子所带的电荷不同，因而泳动率不同，各种蛋白质就以一定的顺序排列成一个一个的蛋白质区带。

(3)分子筛效应：当蛋白质分子通过浓缩胶进入分离胶时，颗粒小、呈球形的样品分子移动快，柯利达、形状不规则的分子在通过凝胶空洞时的阻力大，移动就缓慢。

聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同的蛋白质分子的主要极力为上述的电荷效应和分子筛效应，即这些分子所带净电荷的差异和分子质量大小的不同。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)实验报告一、实验目的1.学习SDS-PAGE分离蛋白质的原理；2.掌握垂直板电泳的操作方法。

二、实验原理1、电泳：(1)定义：是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。

(2)影响电泳效果的因素：①带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快；②颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快；③溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之越快；④溶液的pH值：影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快；⑤电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快；⑥离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快；⑦电渗现象：电场中，液体相对于固体支持物的相对移动；⑧支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之则快。

2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）(1)定义聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。

SDS-PAGE:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）(2)SDS的作用SDS是一种阴离子去垢剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。

由于SDS带有大量负电荷，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖,即消除了蛋白质分子之间电荷差异。

因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小(3) SDS-PAGE分类：¾SDS-PAGE按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连续系统和不连续系统两大类：连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。

不连续系统：缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳(4)聚丙烯胺凝胶的生成：聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)实验原理和操作步骤实验原理：SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。

该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。

SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中.SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比.在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后,电荷因素可被忽略。

蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。

试剂和器材：试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml):0。

6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10％的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1％溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。

可在4℃保存数周,或在－20℃保存数月。

2。

凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0。

8g，加重蒸水溶解后,定容到100ml。

过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月.3。

pH8。

9分离胶缓冲液：Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8。

9，定容至100ml，4℃保存。

4。

pH6.7浓缩胶缓冲液：Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml,加重蒸水80ml使其溶解，调pH6。

7，定容至100ml，4℃保存.5。

TEMED（四乙基乙二胺）原液6.10%过硫酸铵(用重蒸水新鲜配制）7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8。

3后，用蒸馏水定容至1000ml。

置4℃保存，临用前稀释10倍。

8. 考马斯亮蓝G250染色液:称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7。

5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml,搅拌1小时,小孔滤纸过滤。

器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。

实验操作（一）样品制备将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20ul＋5ul)在一个Eppendorf 管中混合。

垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质一.实验目的学习SDS-聚丙烯跌胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。

二、实验原理蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。

当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pl)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点吋，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少.蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。

聚丙烯酰胺礙胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。

本实验釆用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表現出不同的迁移率。

由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子董大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。

这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。

同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，釆用两种缓冲体系；上层胶pH二一，下层胶pH=; Tris—HCI缓冲液中的Tris 用于维持溶液的电中性及pH,是缓冲配对离子：Cl-是前导离子。

在时，缓冲液中的Gly为尾随离子，而在卩日=吋，Gly的解离度增加：这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。

不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。

由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子拜效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。

A B如果在聚丙烯酰胺;疑胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS),由于SDS带有大董的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如疏基乙醇存在下，蛋白质分子內的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质一SDS复合物：此时，蛋白质分子上所带的负电荷董远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。

垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质一、实验目得学习ＳDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法(ＳDS—ＰAGＥ)测定蛋白质得分子量得原理与基本操作技术、二、实验原理蛋白质就是两性电解质,在一定得ｐH条件下解离而带电荷。

当溶液得pH大于蛋白质得等电点(pＩ)时,蛋白质本身带负电,在电场中将向正极移动;当溶液得pH小于蛋白质得等电点时,蛋白质带正电,在电场中将向负极移动;蛋白质在特定电场中移动得速度取决于其本身所带得净电荷得多少、蛋白质颗粒得大小与分子形状、电场强度等。

聚丙烯酰胺凝胶就是由一定量得丙烯酰胺与双丙烯酰胺聚合而成得三维网状孔结构、本实验采用不连续凝胶系统,调整双丙烯酰胺用量得多少,可制成不同孔径得两层凝胶;这样,当含有不同分子量得蛋白质溶液通过这两层凝胶时,受阻滞得程度不同而表现出不同得迁移率。

由于上层胶得孔径较大,不同大小得蛋白质分子在通过大孔胶时,受到得阻滞基本相同,因此以相同得速率移动;当进入小孔胶时,分子量大得蛋白质移动速度减慢,因而在两层凝胶得界面处,样品被压缩成很窄得区带。

这就就是常说得浓缩效应与分子筛效应。

同时,在制备上层胶(浓缩胶)与下层胶(分离胶)时,采用两种缓冲体系;上层胶ｐＨ=6、7—6。

8,下层胶pH=8.9;Tris—HCＩ缓冲液中得Triｓ用于维持溶液得电中性及pＨ,就是缓冲配对离子;ＣI－就是前导离子。

在pH6.８时,缓冲液中得Gly—为尾随离子,而在pH＝8、９时,Gly得解离度增加;这样浓缩胶与分离胶之间ｐH得不连续性,控制了慢离子得解离度,进而达到控制其有效迁移率之目得。

不同蛋白质具有不同得等电点,在进入分离胶后,各种蛋白质由于所带得静电荷不同,而有不同得迁移率、由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在得浓缩效应,分子筛效应及电荷效应,使不同得蛋白质在同一电场中达到有效得分离。

如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度得十二烷基硫酸钠(SDS),由于SDＳ带有大量得负电荷,且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性,特别就是在强还原剂如巯基乙醇存在下,蛋白质分子内得二硫键被还原,肽链完全伸展,使蛋白质分子与SDS充分结合,形成带负电性得蛋白质—SDS复合物;此时,蛋白质分子上所带得负电荷量远远超过蛋白质分子原有得电荷量,掩盖了不同蛋白质间所带电荷上得差异、蛋白质分子量愈小,在电场中移动得愈快;反之,愈慢。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）一、材料准备（1）丙烯酰胺单体（Arc）：在交联剂作用下形成聚丙烯酰胺（2）N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）：交联剂（3）10%十二烷基硫酸钠（SDS）：阴离子去污剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。

由于SDS带有大量负电荷，当与蛋白质形成复合物后好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖，即消除了蛋白质分子之间电荷差异。

配制方法：10g SDS，用双蒸水溶解并定容至100ml，室温保存。

（4）10%过硫酸铵（Ap）：引发剂。

配制方法：0.1 g过硫酸铵溶解于1ml双蒸水中。

过硫酸铵会缓慢分解，应新鲜配制。

（5）N、N、N’、N’－四甲基乙二胺（TEMED）：其碱基催化AP产生氧自由基，激活单体形成自由基，发生聚合。

配制方法：原液使用。

应使用电泳级TEMED。

（6）30%丙烯酰胺凝胶贮液（Arc-Bis贮液）配制方法（50mL体系）：14.55 g丙烯酰胺＋0.45 g N，N-甲叉双丙烯酰胺，先用40ml双蒸水溶解，搅拌，直到溶液变成透明，再用双蒸水稀释至50 ml，0.45μm滤膜过滤。

用棕色瓶储存于4℃（丙烯酰胺单体贮液在储存过程中因光和碱催化发生脱氨反应，会缓慢转化成丙烯酸和双丙烯酸，储存液应测定pH值不超过7.0。

丙烯酰胺单体贮液应在暗色瓶中保存，每隔数月须重新配制。

丙烯酰胺具有很强的神经毒性和致癌性，并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。

称量时必须戴手套和面具。

）（7）分离胶缓冲液（pH8.8的Tris-HCl缓冲液）：1.5M Tris-HCl，pH8.8。

配制方法：9.08 g Tris溶解在40ml 双蒸水中，用4 mol/L盐酸调节pH值8.8，再用双蒸水加至50ml。

4℃保存。

（8）浓缩胶缓冲液（pH6.7的Tris-HCl缓冲液）：1.0M Tris-HCl，pH6.8。

配制方法：6.06 g Tris溶解在40 ml双蒸水中，用4 mol/L盐酸调节pH值6.8，再用双蒸水加至50 ml。

垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质一、实验目的学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。

二、实验原理蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。

当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。

聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。

本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。

由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。

这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。

同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris —HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子；CI-是前导离子。

在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离子，而在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。

不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。

由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。

如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质—SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。

S D S聚丙烯酰胺凝胶电泳S D S P A G E实验原理和操作步骤The pony was revised in January 2021SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤实验原理：SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。

该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。

SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。

SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。

在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。

蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。

试剂和器材：试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。

可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。

2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。

过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。

3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml，4℃保存。

4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml，4℃保存。

5. TEMED（四乙基乙二胺）原液6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。

置4℃保存，临用前稀释10倍。

8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳目的要求（1）学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。

（2）掌握SDS-PAGE测定蛋白质分子量的操作方法。

原理SDS-PAGE是PAGE是一种特殊形式，SDS是带负电荷的阴离子去污剂。

用SDS-PAGE 测定蛋白质分子量时，蛋白质需经样品溶解液处理。

在样品溶解液中含有巯基乙醇及SDS，各种蛋白质样品在巯基乙醇作用下，还原成单链，再进一步与SDS结合形成带大量负电荷的SDS-蛋白质复合物。

因此各种蛋白质分子在SDS-PAGE中，只能按其分子量大小而分离。

SDS-PAGE有连续体系（b）及不连续体系两种(d)，这两种体系有各自的样品溶解液及缓冲液，但加样方式，电泳过程及固定、染色与脱色方法完全相同。

聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。

这种凝胶是以丙烯酰胺单体（Acrylamide，简写为Acr）和交联剂N，N'-甲叉双丙烯酰胺（N,N'-Methylena Bisacrylamide，简写为Bis）在催化剂的作用下聚合而成的。

Acr 和Bis 在它们单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避免接触皮肤。

但在具有自由基团体系时，它们聚合。

引发产生自由基团的方法有两种，即化学法和光化学法。

化学聚合的引发剂是过硫酸铵(NH4)2S2O3（Ammonium persulfate，简写为Ap），催化剂是N，N，N',N'-四甲基乙二胺（Tetramethylenediamine，简写为TEMED）。

在催化剂TEMED的作用下，由过硫酸铵（Ap）形成的自由基又使单体形成自由基，从而引起聚合作用。

TEMED 在低pH 时失效，会使聚合作用延迟；冷却也可使聚合速度变慢；一些金属抑制聚合；分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用。

这些因素在实际操作时都应予以控制。

光聚合以光敏感物核黄素（即V B2）作为催化剂，在痕量氧存在下，核黄素经光解形成无色基，无色基被氧再氧化成自由基，从而引起聚合作用。