纸片法 KB 药敏实验原理及实际操作方法

药敏试验方法药敏试验方法：K-B法：1 从孵育了16-24小时的琼脂平板上（血平板），挑出单个菌落，直接用生理盐水制成0.5麦氏单位。

2 在15分钟内，用无菌棉拭子蘸取调好的菌液，在液面上方管壁处旋转并用力挤压几次，以从中挤出过多的菌液。

3 用棉拭子在无菌的M-H培养基表面化线接种，再重复操作两次，每次将平板转动60度，每次接种都应保证接种物均匀分布，最后用棉拭子涂抹平板的边缘。

4 将确定好的药敏纸片分贴到平板表面。

每个纸片都应压一下，以保证与平板表面完全接触。

每个纸片中心间距24mm。

纸片一旦与平板接触，不应再移动。

5 贴完纸片后，应在15分钟内放入35度孵箱。

嗜血杆菌属，链球菌属放入3%-5%的CO2烛缸。

6 孵育24小时以后，测量各药敏纸片抑菌圈直径，与NCCLS手册比较，作出结果判断。

说明：细菌药敏结果的判断以NCCLS为标准，所以药敏试验的每一步都应严格按照NCCLS操作，否则将失去意义。

链球菌、奈瑟菌属、流感嗜血杆菌、除铜绿假单孢菌和不动杆菌外的假单孢菌属不用K-B 法.肺炎链球菌胶乳凝集测定法1. 在一干净玻片上分别滴两滴生理盐水。

2. 从冰箱取出鉴定试剂(Slidex pneumo-kit)于室温。

3. 在其中一滴生理盐水上滴加R1试剂，在另外一滴上滴加R2试剂，用搅拌棒混匀。

4. 轻轻晃动玻片2分钟，观察结果。

5. 2分钟内，如R1出现凝集为阳性；如R1和R2均未出现凝集为阴性。

注：R3为阳性对照。

药敏纸片的选择1、革兰阴性杆菌（肠杆菌科）头孢噻肟（CTX）头孢唑林（CZ）头孢他定（CAZ）氨苄西林（AM）哌拉西林（PIP）阿米卡星（AN）头孢噻吩（CF）环丙沙星（CIP）头孢呋辛（CXM）庆大霉素（GM）头孢噻肟/棒酸（CTX/CA）头孢他定/克拉维酸（CAZ/CA）羧苄青霉素（CB）奥格门丁（AMX/CA）哌拉西林/三唑巴坦（PIP/TZ）亚安培南头孢匹肟（FEP）头孢克罗（CEC）2、铜绿假单孢菌/不动杆菌妥布霉素（TM）阿米卡星（AN）安曲南（AZT）头孢哌酮（CFP）哌拉西林（PIP）头孢匹肟头孢噻肟（CTX）环丙沙星（CIP）头孢他定（CAZ）左旋氧氟沙星（OFL）亚安培南哌拉西林/三唑巴坦3、金黄色葡萄球菌苯唑西林（OX）青霉素G（P）头孢唑林（CZ）阿米卡星（AN）红霉素（E）头孢噻肟（CTX）环丙沙星（CIP）万古霉素奥格门丁（AMX/CA）哌拉西林/三唑巴坦头孢噻吩（CF）4 、肠球菌氨苄西林（AM）万古霉素环丙沙星（CIP）庆大霉素（GM）红霉素（E）氧氟沙星（OFL）5、除肺炎链球菌外链球菌氨苄西林（AM）头孢噻肟（CTX）万古霉素红霉素（E）氧氟沙星（OFL）克林霉素(CM)肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和大肠杆菌ESBLs的检测MH培养基上贴头孢他定，头孢他定/克拉维酸，头孢噻肟/棒酸，安曲南。

纸片扩散法药敏试验(KB法)纸片扩散法药敏试验，又称为KB法，是一种广泛应用于临床微生物实验室的抗生素敏感性检测方法。

通过该方法，可以快速、准确地评估病原菌对抗生素的敏感性，为临床医生提供治疗选择的依据。

纸片扩散法药敏试验的基本原理是将含有定量抗生素的纸片贴在接种有病原菌的培养基上，抗生素在培养基中扩散形成浓度梯度，抑制病原菌的生长。

通过测量纸片周围形成的抑菌圈直径，可以判断病原菌对抗生素的敏感性。

抑菌圈直径越大，表示病原菌对该抗生素越敏感。

纸片扩散法药敏试验具有操作简便、成本低廉、结果易于判读等优点，是目前临床上使用最广泛的药敏试验方法之一。

然而，该方法也存在一定的局限性，如受环境因素影响较大，结果受操作人员技术熟练程度影响等。

1. 选择合适的培养基：纸片扩散法药敏试验需要使用含有适量营养物质的培养基，以保证病原菌的生长。

2. 控制接种量：接种量过多或过少都会影响试验结果，因此需要严格控制接种量。

3. 选择合适的抗生素纸片：根据病原菌的种类和临床需求，选择合适的抗生素纸片进行试验。

4. 观察抑菌圈：在规定时间内观察抑菌圈的形成情况，测量抑菌圈直径，判断病原菌对抗生素的敏感性。

5. 结果报告：根据抑菌圈直径，按照相应的标准判断病原菌对抗生素的敏感性，并将结果报告给临床医生。

纸片扩散法药敏试验(KB法)是一种简单、实用的抗生素敏感性检测方法，在临床微生物实验室中具有广泛的应用。

通过规范操作，可以提高试验结果的准确性，为临床治疗提供有力支持。

纸片扩散法药敏试验(KB法)的进一步探讨我们需要了解KB法的基本操作步骤。

将含有特定抗生素的纸片贴在已经接种了细菌的琼脂平板上。

随着时间的推移，抗生素会从纸片中扩散到琼脂中，形成抗生素浓度梯度。

如果细菌对该抗生素敏感，那么在纸片周围就会形成一个无细菌生长的区域，即抑菌圈。

抑菌圈的大小与抗生素的浓度和细菌的敏感性有关。

KB法的准确性受到多种因素的影响。

纸片的抗生素含量必须准确，以保证试验的重复性。

平板霉素类似物生物活性评价平板霉素对耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和耐万古霉素肠球菌(VREF)等耐药菌具有很好的抑制活性。

抗菌活性的测试主要针对MRSA和VREF进行测定和相比。

最小抑制浓度（MIC）被确定抑制细菌生长的最低浓度。

通过生物活性数据的反馈，进一步指导平板霉素类似物的合成方向，希望获得活性更高、药效活性更好的抗耐药菌抗生素和药物先导化合物。

纸片扩散法测定抗生素敏感试验及MIC：1.原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。

纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后不断地向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。

在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制,从而形成透明的抑菌圈。

抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度,并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关关系,即抑菌圈愈大,MIC愈小。

2.仪器及试剂仪器：纸片、试管、移液枪、烘箱、培养皿、培养箱、镊子、pH试纸、量筒、天平、高压灭菌锅、三角瓶、打孔器、超净工作台试剂：样品溶液、培养基3.菌液的配置从琼脂平板挑取新鲜分离的菌落数个或从保存的斜面上移种至3～5mL LB肉汤培养液中37℃培养2～8h，以待生长至轻微或中等浊度。

也可直接从孵育18～24h的琼脂平板上挑去纯菌落制成肉汤。

为保证药敏试验的准确度和精度，必须对接种菌液的浓度做相应的控制。

因此，将菌液稀释并校正浊度至0.5麦氏标准浓度，稀释时使用无菌肉汤或生理盐水，此时菌液的浓度约为1.5×108CFU/mL。

4.接种平板在超净工作台中，用量筒量取15mL配置好的灭菌培养基，倒在平板中，冷却凝固。

吸取稀释好的菌液500μL于洁净的灭菌试管中，加入4500μL的培养基，冷却到不烫手，摇匀，均匀倾倒置已凝固的平板表面，放置冷却至凝固。

5.粘贴药敏纸片用纸片分配器或无菌镊子取纸片（直径6mm，厚度1mm），贴于平板表面，并用镊子尖轻压一下纸片，使其贴平。

每张纸片的间距不小于24mm，纸片的中心距平板的边缘不小于15mm。

纸片扩散法药物敏感试验若只根据是否出现抑菌环而不考虑抑菌环的直径大小来判断细菌是否对抗菌药物敏感的实验方法，其结果是不正确的。

而纸片扩散法试验是应用标准的方法学原理，根据抑菌环直径大小与最低抑菌浓度的相关性，结合临床上已知敏感或耐药菌株的状态，其结果是可靠的。

WHO推荐K-B法，其目的在于技术的简单和可重复性。

本法特别适用于肠杆菌科细菌，也可用于快速生长的致病菌，但不适用于其他细菌，如嗜血杆菌、奈瑟菌、专性厌氧菌及酵母样菌等。

无论用哪种方法接种，只要质控菌株的抑菌环在预期范围内，均可按同一解释标准报告结果。

但并非从感染患者分离到的微生物都必须做敏感试验，对于污染、机体共生的正常细菌群和那些与感染无关的细菌，可不必做敏感试验，只有那些被认为引起感染的微生物，应先分离提纯、鉴定菌种后再做敏感试验。

试验方法：一、试验材料：(一)培养基：Kirby-Bauer法指定用Mueller-Hinton琼脂。

多年大量的有关敏感试验的方法学研究，均采用该培养基；维持细菌正常发育，绝大多数细菌在此培养基上生长良好。

此培养基不拮抗抗菌药物活性以及商品的批次间差异等方面均优于其他培养基。

若检测肺炎链球菌的敏感性时，须在培养基中加5％的脱纤维羊血，制成血平板。

测嗜血杆菌及淋病奈瑟菌的敏感性时，在培养基中须加入1％血红素和 2.5mg/ml 辅酶I后应校正pH 7.2～7.4。

制备MH琼脂平板应用直径90cm平皿。

在水平的实验台上倾制。

琼脂厚为4mm，允许误差为土1mm。

琼脂凝固后，应测一下pH。

琼脂于板应放4℃保存，在7日内用完。

若当天不用，用塑料袋密封包装贮藏于冰箱（2-8℃）。

每批平板都应抽样，在30-50℃下培养24h或更长时间检查是否被感染。

MH琼脂培养基配方(1L)：Beef Extract 2.0g Acid Hydrolysis of Casein 17.5gStarch 1.5g Agar 17.0gFinal PH 7.3 at 25℃高压灭菌后立即水浴冷却至45-50℃。

kb法药敏试验流程KB法药敏试验是一种常见的药物敏感性检测方法，它可以用来检测细菌对不同抗生素的敏感性。

这种方法可以帮助医生选择最有效的治疗方案，从而提高治疗效果，减少药物滥用和耐药性的发展。

KB法药敏试验的流程大致如下：1. 培养细菌首先需要从患者样本中分离出病原菌，并在培养基上进行细菌培养。

通常会选择含有营养物质丰富的琼脂培养基，让细菌在其中生长繁殖。

2. 制备药物接下来需要准备不同种类的抗生素药物。

这些药物可以是单一的化合物，也可以是混合物。

通常会选择一些常用的抗生素，如青霉素、头孢菌素、氨基糖苷类等。

3. 稀释药物为了确定细菌对不同浓度的药物的敏感性，需要将药物进行稀释。

通常会选择两倍稀释法，即每次将药物浓度减半，直到得到一系列不同浓度的药物。

4. 加入细菌将不同浓度的药物加入到含有细菌的琼脂培养基上，并在恒温箱中进行培养。

通常会选择37℃左右的温度，让细菌在其中生长繁殖。

5. 观察结果观察不同浓度的药物对细菌生长的影响，可以通过肉眼或显微镜进行观察。

如果药物浓度过低，细菌可以正常生长；如果药物浓度过高，细菌无法生长；如果药物浓度适中，细菌可以生长但速度较慢。

6. 计算MIC值MIC（最小抑菌浓度）是指能够抑制细菌生长的最低药物浓度。

通过观察不同浓度药物对细菌生长的影响，可以确定MIC值。

通常会选择MIC为药物敏感性的判断标准，MIC值越小表示细菌对该药物越敏感。

总之，KB法药敏试验是一种简单而有效的药物敏感性检测方法。

通过这种方法可以快速、准确地确定细菌对不同抗生素的敏感性，为医生选择最佳治疗方案提供了重要依据。

纸片扩散法药敏试验纸片扩散法（K-B法）药物敏感试验是在涂有细菌的琼脂平板培养基上按照一定要求贴浸有抗菌药的纸片，培养一段时间后测量抑菌圈大小，并根据相关解释标准进行结果分析，从而得出受试菌株药物敏感性的结论。

中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论目录.1试验原理.2试验步骤.3结果分析.4注意事项基本信息中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论试验原理纸片扩散药敏试验的原理：将含有定量的抗菌药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过抗菌药物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制细菌的生长。

药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。

试验步骤1. 待测菌株接种物制备（1）通用情况：从过夜孵育的平板，优先选择哥伦比亚血琼脂平板上的菌落上挑取数个单个菌落，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。

（2）特殊情况：嗜血杆菌属（本程序中所指的嗜血杆菌仅包括流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌）：从过夜孵育的HTM平板，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。

2.接种平板（1）调整好悬液的浊度后，用无菌棉签浸入悬液内，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，除去棉签上多余的液体，但也应适度。

（2）用拭子划线整个琼脂表面，从平板顶部到底部，均匀涂布，重复两次此过程（一共三次）每次旋转平板约60度，确保每次接种菌液均匀分布，最后在琼脂平板的边缘涂抹一圈，防止有流动的菌悬液，并使菌液涂布于整块平板的每个角落。

（3）涂布菌液完成的平板，可在室温放置一会（3-5分钟），以便在放置含有药物的纸片前使琼脂吸收表面多余的水分，但放置时间不应超过15分钟。