12用siRNA进行transient transfection不稳定，几代细胞以后，症状就会消失，所以在转染几天（１－３）后要立刻抽提蛋白，进行分析用质粒中的shRNA进行转染，如果质粒含有抗生素位点，可以进行筛选，获得较稳定的细胞株系，但需要时间较长用病毒中的shRNA进行感染（infection），抗生素筛选后，可以获得很稳定细胞株系瞬时RNAi短时转染是一种常见的简单生物手段，这种手段能够将外源性的siRNA或是能够编码siRNA的质粒通过非病毒感染的方式导入细胞中。
转染的细胞通常在细胞质膜表面有一个短时小孔或者一个“洞”，这些特殊的孔结够能够让基因物质通过细胞膜进入细胞质中。
转染过程中可以借助磷酸钙与形成极小的磷酸钙复合物沉淀黏附在细胞膜表面，而借助内吞作用加速基因物质进入细胞质。
或者也可以通过借助带正电荷的阳离子脂质体形成脂质体包含物体，然后经过内吞作用进入细胞质中。
.不过上述的这些转染技术所产生的沉默作用持续时间较短，因为所诱导的siRNA不能够进行自身复制而且会因为细胞的分化而被稀释或降解。
转染的外源DNA由于不能够插入核内基因组通常会在细胞经历有丝分裂过程中丢失。
一旦所转染的细胞中siRNA消失后，靶基因功能又重新恢复到转染前水平。
采用转染技术来产生基因沉默通常要在４８－７２小时才能达到高沉默率，而且根据不同转染效率也只能维持２４－９６小时。
因此，siRNA转染可作为短期分析基因功能的有效工具，而且可以方便快速去验证针对靶基因所设的siRNA干扰效率。
当前，由于siRNA转染技术易于制备、随时可用以及很短的操作时间等特点主要用于短时基因沉默。
长久RNAi由于表型改变通常和基因型改变在时间上不同步，许多分析试验就要求长时间对靶基因的沉默。
siRNA转染直接产生的沉默由于其短时性就不能用于长时间的实验研究，人工合成siRNA的转染手段由于其不稳定性和低转染效率不能广泛运用于其他类型细胞。
siRNA与RNAi综述1 前言RNA是生物体内最重要的物质基础之一，它与DNA和蛋白质一起构成生命的框架。
但长久以来，RNA分子一直被认为是小角色。
它从DNA那儿获得自己的顺序，然后将遗传信息转化成蛋白质。
然而，一系列发现表明——这些小分子RNA事实上操纵着许多细胞功能。
它可通过互补序列的结合反作用于DNA，从而关闭或调节基因的表达。
甚至某些小分子RNA可以通过指导基因的开关来调控细胞的发育时钟。
2 综述2.1 研究历史与发展前景2.1.1 定义双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RNA干预（RNA interference, RNAi ）双链RNA经酶切后会形成很多小片段，称为siRNA，这些小片段一旦与信使RNA(mRNA)中的同源序列互补结合，会导致mRNA失去功能，即不能翻译产生蛋白质，也就是使基因“沉默”了。
2.1.2 研究历史RNAi现象早在1993年就有报道：将产生紫色素的基因转入开紫花的矮牵牛中，希望得到紫色更深的花，可是事与愿违，非但没有加深紫色，反而成了白色。
当时认为这是矮牵牛本来有的紫色素基因和转入的外来紫色素基因都失去了功能，称这种现象是“共抑制”。
1995年，康奈尔大学的Su Guo博士用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现，反义RNA（anti sense RNA和正义RNA（sense RNA）都阻断了基因的表达，他们对这个结果百思不得其解。
直到1998年，Andrew Fire 的研究证明，在正义RNA阻断了基因表达的试验中，真正起作用的是双链RNA。
这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的。
于是提出了RNAi这个词。
2.1.3 作用机理目前RNAi的作用机理主要是在线虫，果蝇，斑马鱼等生物体内阐明的。
生物体内的双链RNA可来自于RNA病毒感染，转座子的转录产物，外源导入的基因。
这些来源的双链RNA诱发了细胞内的RNAi机制，结果是病毒被清除，转座子的表达被阻断，外源导入基因表达被阻断同时，与其同源的细胞基因组中的基因表达也被阻断。
rnai实验步骤RNAi实验步骤RNA干扰（RNAi）是一种基因沉默技术，通过RNA分子的介导，抑制特定基因的表达。
RNAi技术已经成为生命科学研究中的重要工具，可以用于研究基因功能、疾病治疗等方面。
本文将介绍RNAi实验的步骤。
1.设计siRNAsiRNA是RNAi技术中的重要组成部分，是一种双链RNA分子，可以介导RNAi反应。
在设计siRNA时，需要选择目标基因的靶点序列，并设计合适的siRNA序列。
siRNA序列应该具有一定的长度和GC含量，同时需要避免与非目标基因的序列发生杂交。
目前，有许多在线工具可以帮助设计siRNA序列，如siRNA Wizard、siRNA Target Finder等。
2.合成siRNA合成siRNA是RNAi实验的关键步骤之一。
siRNA可以通过化学合成或体外转录的方式进行合成。
化学合成是一种常用的方法，可以在短时间内合成大量的siRNA。
体外转录则是一种更加自然的方法，可以通过RNA聚合酶在体外合成siRNA。
无论采用哪种方法，合成的siRNA需要经过纯化和质量检测，确保其纯度和活性。
3.转染siRNA转染siRNA是RNAi实验的另一个重要步骤。
转染siRNA可以通过多种方式进行，如化学转染、电穿孔、病毒载体等。
其中，化学转染是最常用的方法之一，可以使用多种转染试剂，如Lipofectamine、RNAiMAX等。
在转染siRNA之前，需要确定最佳的转染条件，包括转染试剂的浓度、转染时间、细胞密度等。
4.检测RNAi效果检测RNAi效果是RNAi实验的关键步骤之一。
常用的检测方法包括实时荧光定量PCR、Western blot、免疫荧光染色等。
实时荧光定量PCR可以检测目标基因的mRNA水平，Western blot可以检测目标蛋白的表达水平，免疫荧光染色可以直接观察目标蛋白的表达情况。
在检测RNAi效果时，需要注意对照组的设置，以确保实验结果的可靠性。
