第三章基因工程的酶学基础

生物基因工程酶知识点总结酶是生物体内的一类特殊蛋白质，它能够在生物体内催化化学反应，而不参与其中。

酶在生物基因工程中起着重要的作用，可以用于基因重组、DNA合成、蛋白质表达等方面。

本文将介绍一些关于生物基因工程酶的知识点。

一、酶的分类 1. 氧化还原酶：如过氧化氢酶、过氧化物酶等，能够参与氧化还原反应。

2. 水解酶：如淀粉酶、脂肪酶等，能够将底物分解成较小的分子。

3. 缩合酶：如DNA连接酶、RNA聚合酶等，能够将小分子合并成较大的分子。

4. 转移酶：如转移酶、糖基转移酶等，能够将官能团转移到其他底物上。

5. 氨基酸酶：如氨基转移酶、脱氨酶等，能够催化氨基酸间的转移反应。

二、酶的活性调节 1. 温度：酶的活性随温度的变化而变化，通常在适宜的温度范围内活性最高。

2. pH值：不同的酶对pH值有不同的适应范围，酶的活性随pH值的变化而变化。

3. 金属离子：某些酶的活性需要特定的金属离子的参与，如锌、铁、铜等。

4. 辅因子：有些酶需要辅因子的参与才能发挥活性，如维生素B12等。

5. 底物浓度：酶的活性随底物浓度的增加而增加，但达到一定浓度后活性趋于饱和。

三、酶在基因重组中的应用 1. 切割酶：如限制性内切酶，能够识别特定的DNA序列并切割DNA链，为基因重组提供切点。

2. 连接酶：如DNA连接酶，能够将DNA片段连接成完整的DNA分子，用于合成重组DNA。

3. 标记酶：如绿色荧光蛋白，能够将目标基因与标记序列融合，以便在转基因研究中进行检测。

四、酶在蛋白质表达中的应用 1. DNA聚合酶：能够在体外合成DNA分子，用于合成目的蛋白质的基因。

2. RNA聚合酶：能够将DNA转录成mRNA，为蛋白质合成提供模板。

3. 翻译酶：如核糖体，能够将mRNA翻译成蛋白质。

五、酶在药物研发中的应用 1. 酶的抑制剂：可以通过抑制特定酶的活性来治疗疾病，如抗癌药物中的酪氨酸激酶抑制剂。

2. 酶的活化剂：可以通过激活特定酶的活性来治疗疾病，如生物合成抗生素中的β-内酰胺酶活化剂。

如 EcoR I限制性内切酶和EcoR I甲基化酶
前者：5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’
后者：5’-GAA*TTC-3’ 3’-CTT*AAG-5
作用的位点也不相同
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（4） II型限制性内切酶对单链DNA的切割
定义为切割双链DNA，但有一些还可以特 异识别并切割单链DNA的相应位点，只是 切割效率比较低
U代表嘌呤；Y代表嘧啶。
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Sau 3A
5’-GATC----3’ 3’----CTAG-5’
同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点 一般不能再被原来的酶识别。
BamH I 5’-G 3’-CCTAG
GATCT-3’ A-5’
Bgl Ⅱ
BamH I
5’-GGATCT-3’ 3’-CCTAGA-5’
产生平齐末端
产生粘性末端
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[1] 粘性末端（sticky ends，cohensive ends）
含有几个核苷酸单链的末端。 分两种类型：
ⅰ） 5’端凸出（如EcoR I切点）
5’-
GAATTC
-3’
3’-
CTTAAG
-5’
5’-
G
AATTC
3’-
CTTAA
G
-3’ -5’
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ⅱ） 3’端凸出（如Pst I切点）
识别位点处
切开双链DNA，形成粘性末端（sticky end）或 平齐末端（blunt end）。如：
EcoR I 5’-GAATTC-3’ EcoR V
3’-CTTAAG-5’
5’-GATATC-3’ 3’-CTATAG-5’
Pst I
5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’

目录基因工程重点 (1)第1章绪论 (1)第2章基因工程的酶学基础 (1)第3章基因工程载体 (3)第4章基因工程的主要技术及其原理 (4)第5章目的基因的获得 (7)第6章DNA重组的操作 (8)第7章外源基因的表达及其优化策略 (8)酶工程重点 (13)第一章绪论 (13)第二章酶工程基础 (13)第三章酶的发酵工程 (15)第四章酶的分离工程 (16)第五章固定化酶和固定化细胞 (18)第六章化学酶工程 (19)第七章非水相酶催化 (20)第八章核酶 (22)第十章酶抑制剂 (22)第十一章酶的应用 (23)细胞工程重点 (25)第一章绪论 (25)第四章细胞培养 (25)第五章细胞融合与单克隆抗体 (27)第六章胚胎工程 (28)第七章干细胞与组织工程 (29)第八章核移植技术和动物克隆 (31)第九章转基因动物和生物反应器 (32)第十章动物染色体工程 (34)第十一章植物组织培养 (34)第十二章植物的快速繁殖 (36)I第十三章单倍体诱导和育种 (37)第十四章植物胚胎培养 (38)第十五章体细胞胚发育和人工种子 (38)第十六章植物原生质体融合技术 (39)第十七章植物染色体工程 (41)第十八章植物转基因技术 (42)II基因工程重点第1章绪论一、基因工程概念(Conception )：基因工程(gene engineering)：就是对不同生物的遗传物质，在体外进行剪切、组合和拼接，使遗传物质重新组合，然后通过载体转入微生物、植物和动物细胞内，进行无性繁殖，并使所需要的基因在细胞中表达，产生出人类所需要的产物或组建成新的生物类型。

二、基因工程一般操作步骤：1、目的既赢得获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测和表达产物的测定三、基因工程四大要素（Four elements）：1、供体基因2、载体3、工具酶4、受体细胞（细菌、植物和动物）第2章基因工程的酶学基础一、名词解释：1.限制/修饰系统(R-M, Restriction-modification system)——任何一种生物体都存在防御外界物质进入的机制。

DNA甲基化对酶活性的影响 •大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶 和Dcm甲基化酶。 •Dam可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上 引入甲基 •Dcm在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5 位置上引入甲基。 •部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切 割，如FbaI和MboI等。
通常有两种方法： ①选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA 识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化 影响； ②利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA 的制备，如E. coli & nbsp; JM110和链霉菌 等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲除，而 后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细 胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。
CATG
SAGE Tag 5
CATG
SAGE Tag 2
SAGE Tag 4
SAGE Tag 6
•II型限制性内切酶的酶切位点位于识别位点之中或
附近，产生以下4种情况。 ① 5’粘性末端；② 3’粘性末端；③ 平末端和 ④ 非互补的粘性末端 •无论DNA的来源如何，只要是使用同一种限制性内 切酶，所留下的残端都是一样的。 •经酶切后，5’端总是保留一个磷酸根；3’端总是 保留一个OH
第二讲 基因工程的酶学基础
本节内容
•限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 •DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 •核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 •核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 •核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 •核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 •其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、 检测等。
Ⅱ型限制性内切核酸酶的基本特性
1.具有高度特异性的识别位点与酶切位点。 2.辅基： Mg++。 特定识别序列一般长4 - 8对碱基； 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧；