- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
表达产物大小
28kDa 38KDa 28kDa 56kDa 27kDa 38kDa 28kDa 27kDa
蛋白形式 包涵体
分泌形 分泌形 分泌形 包涵体 包涵体 分泌形
表达率 18%
15 2% 20 5%
20% 40% 12%
产物活性 有溶栓活性
12000u mg 60u ml
2000u mg 有溶栓活性 有溶栓活性
120u ml
究, 已经初步能够利用基因工程菌生产纳豆激酶样 品。但是对于基因工程菌的发酵工艺、表达产物的 分离纯化工艺、表达产物的产量及收率方面仅进行 了一些探索性研究, 要想实现利用基因工程菌工业 化生产纳豆激酶, 还需更加深入的研究。
2 纳豆激酶基因结构和蛋白质结构
1992 年 Nakamura 等采用鸟枪法在大肠杆菌中 首次克隆到包括调控序列在内的 NK 全长基因, 并 对 1473bpNK 全长基因序列进行了分析。该基因以 GTG 为起始密码子, 随后是由 1143bp 组成的阅读 框架, 编码 29 个氨基酸的信号肽, 77 个氨基酸的前 导肽和 275 个氨基酸的成熟肽, 共 381 个氨基酸。 其结构基 因的 3 末端 是 3 个连 续的终 止密 码子 TAA, TAG, TAA, 其后一段序列可形成茎环结构, 起
中 国生 物 工 程 杂 志
第 23 卷
离纯化出高纯度的具有溶栓活性的纳豆激酶蛋白。
1999 年复旦大学医学院分子遗传学研究室的刘北 城等[ 8] 从纳豆芽孢杆菌基因组中采用 PCR 方法扩 增了纳豆激酶原基因, 其核苷酸序列与文献报道完 全一 致, 将该基 因重组 到温控 型表达 载体 pLY 4 上, 构建成表达质粒 pESX 1, 转化到 E . coli JF1125 受体菌中, 实现了在大肠杆菌中的表达。表达产物 为 38kDa 的纳豆激酶原和 28kDa 的纳豆激酶, 表达 总产 物 约占 菌 体 蛋 白 的 18% , 其 中 成 熟 NK 占 50% , 纤维 蛋白 法测 定显 示, NK 具 有纤 溶活 性。 2002 年又从纳豆芽孢杆菌基因组中克隆了包括启 动子, 信号肽, 成熟肽及 3 非翻译区在内的 NK 全 长基因, 构建了大肠杆菌 枯草杆菌穿梭表达质粒 pBLNK, 转化到枯草杆菌中并成功表达。表达产物 用超滤浓缩, 分子筛, 离子交换等技术多步纯化, 每 升发酵液可得纯度高达 95% 的重组 NK 约 100mg, 与 t PA 比较, 比活性达 12000U mg, 收率为 60% [9] 。 1999 年张淑梅等[ 10] 从分泌纳豆激酶的枯草杆菌基 因组 DNA 中克隆了 NK 成熟肽基因, 其核苷酸序列 与文献报道仅 有一个碱基不 同, 核苷酸 同源性达 99 8% , 重组到 融合谷 胱甘肽 的融合 型表达 载体 pRIT2T 上, 转化到 E . coli N4830 受体菌中, 在大肠 杆菌中得到表达, 表达的融合蛋白具有溶解纤维蛋 白活性, 表达蛋白占菌体蛋白的 15 2% 。近年来, 又成功克隆到与文献 报道完全一致的 NK 成熟肽 基因, 重组到高效表达载体 pET230 上, 在大肠杆菌 DH5 中的表达率达 20 5% , 并且将表达产物经过 DEAE Cellulose DE52 和 Sephadex G100 两个柱分离 纯化 出 NK 蛋白。每 升发 酵液可 得 100mg NK 蛋 白, 与尿激酶比较, 纤溶活性达 2000U mg[ 11] 。2002 年暨南大学生物工程研究所的谢秋玲等[12] 克隆了
始密 码 子 上 游 17bp 处 是 核 糖 体 结 合 位 点 AAAGGAG, SD 序列上游是 A T 含量高达 72% 的转 录调控区域。许多研究者根据 NK 基因的 DNA 序 列推出其氨基酸序列的一级结构, 确定纳豆激酶由 275 个氨基酸组成, 是一种单链多肽酶。含有 8 个 赖氨酸残基, 肽酶可将其水解成 9 个小肽, 该酶的 活性部位在 Asp32, His64, Ser221 处, 底物结合部位 在 Ser125, Leu26 和 Gly127 处。将其核苷酸序列和 氨基酸序列与其它枯草杆菌蛋白酶比较发现纳豆
纳豆激酶( nattokinase) 是日本学者须见洋行等 人于 1987 年首次从纳豆中发现的。该酶是一种枯 草杆菌蛋白激酶, 是在纳豆发酵过程中由纳豆杆菌 ( Bacillus subtillis natto ) 产生的一 种碱性丝 氨酸蛋 白酶[ 1] 。研究发现, 纳豆激酶具有纤溶活性, 能显 著地溶解体内 外血栓, 明 显缩短优球蛋 白溶解时 间, 并能激活体内血管内皮细胞产生纤维蛋白溶酶 原激活剂( t PA) , 从而增加内源性纤溶酶的量与作 用, 间接表现溶栓活性。因此, 纳豆激酶是一种很 有潜力的新型溶栓药物。目前常用的一些预防和 治疗血栓的药物, 如尿激酶、链激酶、组织纤溶酶原 激活剂( t PA) 等, 均存在一些缺陷, 如半衰期短, 用 药剂量大, 价格昂贵等等。与此相比, 纳豆激酶具 有安全性好, 体内作用时间长, 药效持久等优点, 极 有希望成为新一代理想的预防和治疗血栓的生化 药物[ 2] 。本文综述了纳豆激酶的基因工程研究进 展, 同时评述了基因与蛋白质结构, 探讨了不同的 表达系统对表达产物的产量、活性和遗传稳定性的 影响, 为用基因工程菌生产纳豆激酶的进一步研究 提供了一定的启示。
纳豆激酶原基因, 重组到温控 型表达载体 pBV220 上, 转化到 E . coli DH5 受体菌中, 温度诱导表达 后, SDS PAGE 电泳表明在 38kDa 处有一条明显的
表达带, 表达蛋白占菌体蛋白的 20% 左右, 表达蛋 白以包涵体形 式存在, 包 涵体经变 性, 复性 后, 用 CLT 法测定具有溶栓活性。同年四川大学生命科 学学院分子生物学实验室的 彭勇等[ 13] , 从解淀粉 芽孢杆菌 DC 4 基因组中克隆了豆豉溶栓酶成熟肽 基因( DFE) , 序列分析表明 DFE 基因长 825bp, 编码 275 个氨基酸, 与文献报道的纳豆激酶核苷酸和氨 基酸序列同源性分别为 80 0% 和 86 5% , 构建成 融合型表达载体 pET Nde, 转化 E . coli BL21 中, 在 IPTG 诱导下, 表达的融合蛋白以包涵体形式存在, 占菌体可溶性蛋白的 40% , 表明豆豉 溶栓酶可能 是一种新型的溶栓酶。同年, 又从纳豆杆菌基因组 DNA 中克隆了纳豆激酶成 熟肽基因, 与文献报道 的核 苷 酸 序 列 和 氨 基 酸 序 列 分 别 有 93 4% 和 94 5% 的同 源性, 重组 到 融 合型 表 达 载体 上, 经 IPTG 诱导后, 表达的融合蛋白占菌体可溶性蛋白 的 26% [ 14] 。2000 年华南理工大学的黄志立等[ 15、16] 从纳豆杆菌中克隆了纳豆激酶原基因, 其基因序列 与文献报道的核苷酸同源性达 99 08% , 重组到温 控型表达 载体 pBV220 上, 转化 E . coli HB101 中, 实现了在大肠 杆菌中表达, 表达产物的 表达率达 12% , 用 CLT 法测定具有溶 栓活性, 1ml 菌液的溶 栓活性相当于 120U 尿激酶。并研究了外源基因在 大肠杆菌中的遗传稳定性, 结果表明, 传代 21 代, 外源基因的缺失率达 52% 。2001 年又报 道, 克隆 了纳豆激酶结构基因, 其基因序列与文献报道的核 苷酸序列完全相同, 并将该基因重组到 pTCZaA 表 达载体上, 转化毕赤酵母 GS115 中, 研究了外源基 因在真核表达 系统酵母中的 遗传稳定性, 结果表 明, 传代 120 代, 外源基因的缺失率仍为 0% , 可见, 外源基因在酵母中具有 很好的遗传稳定性[ 17] ( 表 1、表 2) 。但没有报道外源基因在酵母中的表达情 况。综上所述, 我国学者对纳豆激酶基因的克隆、 表达及表达产物的活性方面进行了深入系统的研
第 23 卷第 9 期
中 国生 物 工 程 杂 志
CHINA BIOTECHNOLOGY
2003 年 9 月
纳豆激酶基因工程研究进展*
张淑梅* * 李 晶 王玉霞 王佳龙 赵晓宇
( 黑龙江省科学院应用微生物研究所 哈尔滨 150010)
摘要 纳豆激酶是由纳豆芽孢杆菌( Bacillus subtillis natto ) 分泌的一种具有纤溶作用的碱性丝氨 酸蛋白酶。对纳豆激酶基因的克隆与表达, 基因与蛋白质结构以及基因工程纳豆激酶的特性和 功能进行了综述。 关键词 纳豆激酶 基因结构 基因工程
纳豆激酶成熟肽基因 纳豆激酶成熟肽基因
纳豆激酶原基因 豆豉溶栓酶成熟肽基因
纳豆激酶成熟肽基因 纳豆激酶原基因
基因大小( bp)
1143 1473
825 825 1143 825 825 1143
同源性( % )
100 100
99 8 100 100
80 0 93 4 99 08
第9 期
张淑梅 等: 纳豆激酶基因工程研究进展
1 纳豆激酶基因克隆与表达
自从 N akamura 等[ 3] 于 1992 年首次克隆了纳豆 激酶基因并测定了全基因序列, 使得利用基因工程 技术提高纳豆激酶活性及产量成为可能。迄今为 止, 国外对纳豆激 酶基因的研究 仅限于 Nakamura
收稿日期: 2003 05 16 修回日期: 2003 08 05 * 黑龙江省自然科学基金资助项目( C01 23) * * 电子信箱: zsmhlj@ yahoo. com
等利用鸟枪法得到了 NK 基因, 并将 NK 基因重组 到 pUC19 质粒上, 转化到 E . coli HB101 受体菌中, 该基因工程菌发酵产物具有胞外蛋白酶活性, 但没 有检测其溶栓活性。至于对纳豆激酶基因的克隆、 表达及表达产物的研究还未见报道。但与纳豆激
酶同源性很高的枯草杆菌蛋白酶 E 和枯草杆菌蛋 白酶 amylosaccharit icus 都 已 有 基 因 克 隆 的 报 道。 Yoshimoto 等[ 4] 利用穿梭质粒载体 pHY300PLK 克隆 amylosaccharit icus( apr) 基因, 转化到 4 种不同的枯草 杆菌中( ISW1214, M1111, IA510, IA274) , 发 现转化 菌株( ISW1214 PTH1) 的蛋白水解酶的产率比宿主 菌和基因供给菌分别提高 20 倍和 4 倍。Mark 等[ 5] 将枯草杆菌蛋白 酶 E 基因克隆到穿梭载体 pBS42 上, 转化枯草杆菌, 表达的丝氨酸蛋白酶活性是野 生型的 5 倍。凌均建等[ 6] 通过质粒整合和噬菌体 pBS1 转导构建了枯草杆菌蛋白酶 E 基因图谱。研 究表明, 克隆化的枯草杆菌蛋白酶基因只在静止生 长期表达, 并且受 37 启动子的控制。T akagi 等[ 7] 将枯草杆菌蛋白酶 E 基因克隆到嗜热表达载体上, 实现了在嗜热杆菌中的表达。近年来, 我国掀起对 纳豆激酶的研究和开发热潮, 纳豆激酶的药用价值 日益突出, 我国学者渴望利用基因工程菌生产纳豆 激酶, 致使对纳豆激酶基因的克隆、表达、纯化及表 达产物的产量和活性方面的研究取得了很大进展。 已经从不同菌株( 枯草杆菌, 纳豆杆菌, 解淀粉芽孢 杆菌) 中克隆了纳豆激酶成熟肽基因, 包括前导肽 和成熟肽的纳豆激酶原基因, 以及包括启动子, 前 导肽, 信号肽和成熟肽的纳豆激酶全基因。分别重 组到温控型和诱导型质粒载体上, 实现了在大肠杆 菌, 枯草杆菌和酵母菌中的表达。并通过柱层析分
