固相亚磷酰胺法——简易讲解模板

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在进行 DNA 化学合成之前，需要进行充分的准备。

Invitrogen 合成生物学服务产品手册•高品质引物和探针合成生物学服务合成生物学是什么？合成生物学是分子生物学与系统生物学的组合，使用工程学的原则来设计生物系统和生物工厂，其目的是创造出改进的生物功能以应对当前与未来的挑战。

我们相信合成生物学将会改变我们获取能源、生产食物以及优化工业过程的方式，并能检测、预防与治愈疾病。

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通过科学与工程，这一独特的领域能让科研人员研究、修改、创造和再创造高度复杂的生化途径、DNA 序列、基因以及自然生物系统，以便能够理解并解答一些关于生命最有挑战性的问题。

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第四章目的基因的制取内容提要•目的基因的制取策略•鸟枪法制取目的基因•物理化学法分离目的基因•化学合成基因•反转录合成DNA第一节目的基因制取的策略一、外源基因与目的基因基因工程主要是通过人工方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而进行遗传研究或是获得表达产物。

通常我们把插入载体的DNA片段称为“外源基因”；将那些已被或准备要被分离、改造、扩增或表达的DNA片段称为“目的基因”。

原核细胞含有上千个基因，真核细胞基因组内的基因数目更是庞大。

目的基因一般都很小，都仅由几千或几百甚至更少的碱基对组成（人生长激素释放抑制因子的基因仅有42bp）。

要想获得某个特定的目的基因，必须对其性质、结构有所了解，根据其特点来制定分离方案。

二、目的基因制取的策略目的基因制取的策略可分为直接制取和间接制取。

一般来说，大部分低等生物基因组的碱基序列已测定，可以直接制取目的基因（确切定位）。

对于高等哺乳动物来说，目的基因在DNA上无法定位，只能间接制取。

获取目的基因的方法：1、直接制取法：以机械的方法或是限制性内切酶对总DNA进行切割，再直接分离特点位点的DNA分子。

2、逆转录法（互补cDNA法）：以RNA为模板，逆转录合成cDNA。

缺点是cDNA中不含天然基因的内含子。

3、PCR扩增法：对于含极微量mRNA的细胞大多采用PCR扩增，再进行目的基因的制取。

4、鸟枪法（散弹法）：可快速和高纯度地从单拷贝或多拷贝基因中筛选获得天然的目的基因。

5、人工化学合成法。

6、其它方法：mRNA差异显示法、限制性片段长度多态性探针技术等。

目前，真核基因，利用DNA合成仪合成目的基因的成本较高；利用cDNA文库获得目的基因需大量前期工作；直接以生物细胞染色体DNA为模板可获得目的基因，但模板的扩增会产生非特异性产物；一般通过构建完整的基因文库，再从文库中“钓取”出目的基因。

第二节鸟枪法制取目的基因一、“鸟枪法”的概念“鸟枪法”是指将基因组按染色体分开后，将它全部打乱，切成碎片，进行随机测序，测序后再将它们拼接起来的方法。

引物设计（特别有用,良心推荐）引物篇1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。

DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。

亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。

亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。

第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。

第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。

第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。

再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。

合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。

通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。

沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。

2.引物纯化方式有哪些，如何选择？◆C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。

Oligo DNA 合成
固相亚磷酰胺三酯法是目前最常用的Oligo DNA化学合成方法，它具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。

亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。

合成步骤：
1、脱保护：将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团DMT，获得游离的5′-羟基；
2、缩合：合成DNA的原料-单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应；
3、带帽(capping)反应：缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应；
4、氧化：在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯；
通过上述步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。

再重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被连接上去。

合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率；
5、氨解：通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来；
6、纯化：切下来的Oligo粗品根据实验目的不同选择不同的纯化手段进行纯化，OD260定量及抽干后根据定单要求对Oligo进行分装。

一、引物的合成和纯化1. 引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺y三酯法。

该方法具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。

主要是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。

固相亚磷酰胺三酯法合成引物的具体步骤如下：1) 将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基。

2) 合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。

3) 带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。

4) 在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。

再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。

合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。

通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC、PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩，脱盐，沉淀。

沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。

2. DNA合成粗产物中含有什么杂质？主要是合成反应过程中产生的失败片段以及脱保护基团时产生的铵盐。

3. 引物纯化方式有哪些？引物常用的纯化方式C18脱盐、OPC纯化、PAGE纯化、HPLC纯化。

纯化方式详细说明C18柱脱盐又称为简易反相柱，对DNA有特异性吸附，可被有机溶液洗脱，但不会被水洗脱，因此能有效地去除盐分，但不能有效去除比目的片段短的小片段。

DNA化学合成基因是由具有特定的核苷酸顺序的核酸组成的功能单位，它携有特定的遗传信息，在染色体上按一定的顺序排列。

基因的基本单位为核苷酸，每个核苷酸包含三种成分：碱基、戊糖和磷酸。

DNA的单体单位为脱氧核苷酸，其中戊糖是D-2-脱氧核糖。

四种碱基分别为腺嘌呤(A) 、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。

在核苷酸中两类杂环化合物嘧啶和嘧呤具有很明显的芳香族特性。

嘌呤本身可以认为是嘧啶的1种衍生物，它是1个嘧啶环和咪唑环耦合在一起组成的。

在大多数细胞中，碱基只有少数呈游离或不结合形式存在，而且它们通常是酶水解核苷酸的产物。

游离嘧啶和嘌呤碱基在水中是相对难溶解的，是弱碱性化合物，随pH不同能以两种或多种互变异构的形式存在。

嘧呤碱基的第九氮原子或嘧啶碱基的第一氮原子与戊糖的第一碳原子形成β-N糖苷酸通称核苷。

核苷按所含糖的不同分为：D-核糖核苷类和2-脱氧-D-核糖核苷类。

在大多数细胞中只有微量的游离核苷存在。

核苷比相应的碱基易溶于水，在不同pH条件下存在与碱基类似的互变异构，N-糖苷键对酸不稳定。

核苷的磷酸酯称核苷酸。

核糖有3个游离羟基，所以核糖核苷酸有2′、3′和5′核苷酸。

脱氧核糖只有2个羟基可以酯化，故脱氧核糖核苷酸只有3′和5′核苷酸。

核酸分子是由核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接而成。

DNA的化学合成研究始于50年代。

1952年阐明核酸大分子是由许多核苷酸通过3′－5′磷酸二酯链键连接起来的这个基本结构以后，化学家们便立即开始尝试核酸的人工合成。

英国剑桥大学Todd实验室于1958年首先合成了具有3′→5′磷酸二酯键结构的TpT和pTpT，此后，Khorana等人对基因的人工合成作出了划时代的贡献，不仅创建了基因合成的磷酸二酯法，而且发展了一系列有关核苷酸的糖上羟基、碱基的氨基和磷酸基的保护基及缩合剂和合成产物的分离、纯化方法。

到目前为此，使用的DNA合成方法有磷酸三酯法、亚磷酸酯法及亚磷酸酰胺法。

2018年06月亚磷酰胺试剂的合成赵晓峰1于洋2韩利涛1张莉1（1.东北制药集团股份有限公司，辽宁沈阳110026；2.沈阳长城润滑油制造有限公司，辽宁沈阳110121）摘要:亚磷酰胺单体是合成基因的必需品，主要包括DNA系列和RNA系列以及他们的衍生物。

亚磷酰胺法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。

本文采用三氯化磷和二异丙胺等简单易得的原料合成亚磷酰胺试剂，在低温和惰性气体保护下，操作简单，收率高，成本低，是一种合成亚磷酰胺试剂的有效途径。

关键词：亚磷酰胺；合成基因亚磷酰化试剂是亚磷酰胺法必不可少的一种试剂。

目前随着DNA片段研究应用的逐渐深入，最常用的亚磷酰化试剂是甲氧基-双（N,N-二异丙基）亚磷酰胺。

但是这种酰化试剂在完成脱氧核苷缩合以后其后处理较为复杂，不利于大范围应用。

为解决这些问题，Koster[1]等引入了3-羟基丙腈，氰乙基在核苷缩合完成以后用氨水即可脱去，使DNA得合成更为方便。

本文采用三氯化磷与3-羟基丙腈反应生成2-腈乙氧基二氯化磷后，再采用不同的摩尔比合成2-腈乙氧基-N，N-二异丙氨基氯化磷和2-腈乙氧基-双（N，N-二异丙基）亚磷酰胺。

反应路线如下：1实验部分1.1主要试剂三氯化磷，分析纯（重蒸后使用）；乙醚：分析纯（经钠丝预干燥处理后，重蒸）。

吡啶：分析纯（用K2CO3预干燥,钠丝回流）。

二异丙胺：分析纯（K2CO3干燥，重蒸）。

分子筛：马弗炉活化。

1.2仪器3L和5L三口瓶，机械搅拌，250ml和500ml恒滴，漏斗，保温锅，旋转蒸发仪。

1.3操作步骤1.3.1合成2-腈乙氧基二氯化磷[2]向3L三口瓶中加入100g4A分子筛。

在氩气保护下，依次加入1L乙醚，105ml三氯化磷（1.2mol），97ml吡啶（1.2mol），搅拌130r/min，向保温锅里加入液氮至EA固体生成，当温度降到-78℃以下开始滴加82ml（1.2mol）3-羟基丙腈，溶液为白色，1h滴加完毕。