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实验三香菇多糖的分离提取实验三香菇多糖的分离提取一、实验目的让学生了解香菇多糖的理化性质及提取工艺流程，掌握真空浓缩技术。
二、实验原理香菇是一种药食两用真菌，具有提高免疫力、抗癌、降糖等多种生理功能。
水溶性多糖作为香菇主要活性成分之一，主要以β-1,3-葡聚糖的形式，分子量从几万到几十万不等。
通过有机溶剂提取，真空浓缩技术进行分离提取。
三、实验材料与试剂原料：干香菇500g试剂：氯仿、正丁醇、医用纱布、浓硫酸、苯酚、工业酒精四、实验仪器组织捣碎机、水浴锅、旋转蒸发器、1cm比色皿、751分光光度计、电子天平、台式离心机、试管、量筒、烧杯、玻璃棒五、提取工艺流程1. 1kg干香菇切成小块，以1：10（重量比）加入水，用组织捣碎机进行均质；2. 取200mL均质液放入1L烧杯中，再加入300mL蒸馏水，加热至沸后，温火煮沸1小时，（注意：煮沸过程中用玻璃棒不断搅拌，以免烧杯底部发生糊结；并间歇加入少量水，使杯内液体体积保持在500mL左右；3. 加热完毕后，将杯内液体用8层纱布过滤，除去残渣，上清液转入另一烧杯中；4. 将上清液倒入圆底烧瓶中，在旋转浓缩仪上进行浓缩，浓缩条件为-0.1MPa 、60℃，浓缩液体积至100mL左右停止；5. 将浓缩液在1×10000g离心10min，将上清液转入另一烧杯，除去残渣；6. 上清液中加入等体积的氯仿正丁醇浓液（体积比为4：1），搅拌5min，静置30分钟；7. 将混合液体在1×5000g下离心20min,分离水相；8. 在水相中加入终浓度为80%的酒精，搅拌均匀，静置20min，1×5000g下离心10min；9. 取出沉淀物，放入已称重的干燥表面皿中，在真空干燥箱中80℃下真空干燥；10. 干燥后，称重，计算多糖的产率；11. 准确称取干燥后多糖20mg于500ml容量瓶中，加水定容；12. 取定容液2ml加入6%苯酚1ml，混匀，再加入浓硫酸5ml，混匀，放置20min后，于490nm测吸光度；13. 葡萄糖标准曲线的制定：准确称取葡萄糖20mg定容于500ml 容量瓶中，分别取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml，补水至2ml，依12步骤反应液，并分别测吸光度，根据葡萄糖浓度和吸光度绘制标准曲线；14. 根据香菇多糖吸光度和葡萄糖标准曲线，计算多糖纯度。
提取香菇多糖测的实验设计----生物091班曹雅淇实验目的：掌握水溶醇沉法分离多糖类化合物的原理和方法。
实验原理：在组织中，多糖多与蛋白质以共价相结合，所以在生化产品制备工艺中，往往第一步多用酶降解蛋白质部分或用碱使多糖—蛋白质间的键裂开，以促进多糖在提取时的溶解。
碱性提取可避免多糖中硫酸基团水解而破坏。
现多采用碱性提取的同时用蛋白质水解酶处理组织。
提取液中存在的蛋白质可用普通蛋白质沉淀剂使之沉淀，也可用其他方法使变性沉淀，如适当调pH和加热等。
实验用具：离心机漏斗铁架台案板、刀洗耳球量筒平底锅烧杯 98%酒精酒精灯天平研钵电炉子香菇石油醚实验方法步骤：1.样品的处理1）称量：将新鲜的香菇洗净后用托盘天平称量其质量，记为m1；2）切碎：称量后的香菇用刀再案板上尽量切碎；3）研磨：切碎后的香菇再放入研钵中研磨，2、香菇汁液的提取1）加水预热：用量筒量取体积为五倍于香菇质量数的蒸馏水，记体积数为v1,然后倒入铝锅中。
随后打开电炉给锅内蒸馏水加热至沸腾；2）装锅：再把研磨后的香菇放进煮沸的蒸馏水中，边煮边搅拌以防香菇粘在锅底。
当水分减少时，在适当时候往锅内加适量的蒸馏水，定容至v1；3）出锅：大约煮1.5h后关掉电路的开关，冷却后将香菇汁液倒出，边倒出边进行过滤；3、过滤漏斗下放置一烧杯并使漏斗管贴着烧杯内壁，接着用四层纱布过滤，过滤时尽量把纱布内的和浸到纱布里的汁液过滤到烧杯中，记下过滤后的体积数为v2；4、蒸发浓缩打开电路的开关，使盛有过滤液的烧杯隔着石棉网在电炉上加热蒸发浓缩，直至体积数为=v35、多糖的提取5.1沉淀1）酒精的配置：配置95%浓度的酒精，酒精的量与v3成1：5的比例，记体积为v4。
盛装酒精的烧杯并用封口膜密封以免酒精挥发；2）静止沉淀：将配置的酒精与浓缩液混合后静置24h，每隔一定时间观察混合液的变化；5.2离心1）多糖的分离：静止后的多糖混合液分别把上清液倒入烧杯中，剩下用酒精沉淀的絮状物装入烧杯里；2）装瓶：拿一只离心用的瓶子装入絮状物和少许上清液总体积约占瓶子的2/3，并用电子天平称出其质量再拿另一只瓶子装入同等质量的上清液。
香菇多糖提取工艺和含量测定方法研究报告1. 研究目标本研究旨在探索香菇中多糖的提取工艺和含量测定方法，以提供一种高效、可行的工艺流程和准确的测定方法，为香菇多糖的应用开发提供科学依据。
2. 方法2.1 香菇多糖提取工艺研究2.1.1 提取试剂选择根据文献综述和前期实验结果，筛选出适合香菇多糖提取的试剂。
常用的试剂有热水、酶解液、强酸、强碱等，选择合适试剂对香菇进行水解提取。
2.1.2 提取工艺优化基于单因素实验和正交实验设计原理，优化香菇多糖提取的工艺参数，包括提取温度、提取时间、料液比等因素。
通过测定提取液中多糖的含量，确定最佳的提取工艺条件。
2.2 香菇多糖含量测定方法研究2.2.1 选择合适试剂反应根据香菇多糖的特性，选用适合的试剂进行反应。
常用的试剂有硫酸、酚硫酸、费林试剂等，可以选择适合的试剂。
2.2.2 建立标准曲线选取不同浓度的香菇多糖标准品，按照测定方法进行测定，记录各标准样品的吸光度或色素生成情况。
根据实验数据，建立标准曲线。
2.2.3 样品预处理将香菇样品经过适当的处理，如研磨、溶解等，使样品中的多糖保持在可测量范围内。
2.2.4 多糖含量测定根据建立的标准曲线和样品的吸光度值，计算出香菇中多糖的含量，并进行统计分析。
3. 发现3.1 香菇多糖提取工艺发现经过实验研究，发现采用热水提取是一种较为有效的香菇多糖提取工艺。
最佳提取条件为提取温度80℃，提取时间2小时，料液比1:10。
3.2 香菇多糖含量测定方法发现在已有的试剂中，硫酸试剂反应较为敏感，可以用于香菇多糖的含量测定。
建立的标准曲线表明，香菇多糖的浓度与吸光度呈现良好的线性关系。
4. 结论本研究通过对香菇多糖的提取工艺和含量测定方法进行深入研究，得出以下结论：1.香菇多糖的热水提取工艺在提取温度80℃，提取时间2小时，料液比1:10的条件下，可获得较高的提取产率。
2.硫酸试剂是一种适用于香菇多糖含量测定的试剂，建立的标准曲线可用于准确测定香菇多糖的含量。
香菇多糖的分离提取一、实验目的掌握水溶醇沉法分离多糖类化合物的原理和方法。
二、实验原理在组织中，多糖多与蛋白质以共价相结合，所以在生化产品制备工艺中，往往第一步多用酶降解蛋白质部分或用碱使多糖—蛋白质间的键裂开，以促进多糖在提取时的溶解。
碱性提取可避免多糖中硫酸基团水解而破坏。
现多采用碱性提取的同时用蛋白质水解酶处理组织。
提取液中存在的蛋白质可用普通蛋白质沉淀剂使之沉淀，也可用其他方法使变性沉淀，如适当调pH和加热等。
苯酚试剂可与香菇多糖中的已糖及其糖醛酸起显色反应，生成橙黄色化舍橱，于49Ohm处比色，定量。
三、实验材料1.实验器材循环水式真空泵；旋转蒸发仪；粉碎机；恒温水浴锅；纱布；搪瓷缸；真空干燥器；721型分光光度计；15ml具塞试管。
2．实验试剂（1）95%乙醇；甲醇（化学纯）；乙醚（化学纯）；木瓜蛋白酶（中性）；纤维素酶；0.2 mol/L十六烷基三甲基氢氧化铵水溶液；10 mol/L 氢氧化钠溶液；葡萄糖标准溶液(1mg/ml，10m/m])；苯酚试液。
（2）复合酶液：以PBS缓冲液做溶剂，其中蛋白水解酶浓度为8 %，纤维素酶浓度为4%；（3）苯酚溶液：称取苯酚(AR级)10 g加水190 g溶解后，置于棕色瓶，备用。
四、实验方法步骤（一）香菇多糖的分离1、预处理：取干香菇4 g，用粉碎机粉碎或捣碎。
2、提取：将捣碎的干香菇置于250 ml三角瓶中，在搅拌的条件下加7倍量水混匀, 加热至90℃，搅拌保温60 min，降温至40℃时转移到40℃水浴保温；并加入适量0.45 ml 复合酶（蛋白水解酶浓度为8 %，纤维素酶浓度为4%），pH值为自然(pH 6.4)，搅拌反应60 min，然后迅速升温到90-100 ℃，灭活1min，降温后纱布过滤，收集滤液。
3、浓缩：将以上滤液置于旋转蒸发仪中，然后减压浓缩至l/5体积时，停止浓缩。
4、沉淀：将浓缩液置于搪瓷缸中，在搅拌的条件下，加1 倍量乙醇，然后静置过夜。
香菇、金针菇、黑木耳多糖的提取与测定作者：杜娟时文静来源：《江苏农业科学》2016年第08期摘要：以香菇、金针菇及黑木耳3种常见食用菌为主要原料，研究了食用菌多糖的提取条件和测定方法。
采用热水浸提、乙醇沉淀的方法提取多糖，然后运用苯酚-硫酸法测多糖含量。
分别从液料比、浸提温度、浸提时间、乙醇浓度进行了单因素试验，在此基础上，设计L9（34）的正交试验，得出3种食用菌多糖提取的最优组合。
结果表明，影响香菇和金针菇多糖提取的主次因素是一致的，依次为浸提温度、乙醇浓度、液料比；而对于黑木耳，液料比是最显著的影响因素，其次为乙醇浓度、浸提温度。
最终测定的多糖含量香菇最高，为3.51%；其次为黑木耳，为3.50%；最低是金针菇，为2.94%。
关键词：香菇；金针菇；黑木耳；多糖；提取；苯酚-硫酸法中图分类号： R284.2文献标志码：文章编号：1002-1302（2016）08-0347-03食用菌中的多糖类物质是增强免疫活性和抗衰老的有效成分之一，具有抗肿瘤、抗病毒、抗突变、抗辐射和降血压等功能[1]。
从食用菌中提取的多糖可作为配料添加到食药保健品中，不仅没有毒副作用，而且还能提供功效高、质量好的产品。
现代医学研究发现，食用菌中显著增强癌症患者抵抗力的生理活性物质即为食用菌多糖[2]。
香菇、金针菇、黑木耳都是日常生活中常见的食用菌，均含有十分丰富的多糖物质。
香菇多糖是一种天然人体免疫调节剂，具有调节人体免疫系统、抗病毒、抗感染以及延缓衰老等作用；金针菇多糖不仅能有效提高人体免疫力，而且还有抗感染、抗氧化、保肝保湿、辅助改善记忆和缓解体力疲劳等保健作用[3]；木耳多糖同样是一类重要的活性物质，在抗肿瘤、抗凝血、抗病毒等方面均有一定的生物活性。
本研究主要以香菇、金针菇、黑木耳为原料，利用水提醇沉法提取多糖，并对提取条件进行优化，分别从液料比、浸提温度、浸提时间、乙醇浓度进行单因素试验，在此基础上设计正交试验，以确定最佳提取条件。
香菇多糖的提取实验报告一、实验目的本实验旨在探索从香菇中提取多糖的有效方法，并对提取得到的香菇多糖进行初步的定性和定量分析。
二、实验原理香菇多糖是一种水溶性的大分子化合物，其在热水中具有一定的溶解性。
通过热水浸提的方法，可以使香菇中的多糖溶解到水中，然后经过离心、过滤等操作去除杂质，再通过醇沉的方法使多糖沉淀出来，最后经过干燥得到香菇多糖的粗品。
三、实验材料与仪器1、实验材料新鲜香菇（市售）、无水乙醇（分析纯）、丙酮（分析纯）、石油醚（分析纯）、葡萄糖标准品、浓硫酸（分析纯）、苯酚（分析纯）等。
2、实验仪器电子天平、恒温水浴锅、离心机、旋转蒸发仪、真空干燥箱、分光光度计、容量瓶、移液管、具塞刻度试管等。
四、实验步骤1、原料预处理将新鲜香菇洗净，去除杂质和根部，切成小块，置于通风处晾干。
然后用石油醚回流脱脂2 次，每次2 小时，以去除香菇中的脂类物质。
脱脂后的香菇用丙酮回流脱色 2 次，每次 2 小时，以去除香菇中的色素。
2、热水浸提将预处理后的香菇放入圆底烧瓶中，按料液比 1:20 加入蒸馏水，在90℃的恒温水浴锅中浸提 3 小时。
期间每隔 30 分钟搅拌一次，以提高提取效率。
3、离心分离浸提结束后，将提取液冷却至室温，然后在 4000 r/min 的转速下离心 15 分钟，取上清液。
4、过滤将上清液用滤纸过滤，去除其中的不溶性杂质。
5、醇沉向过滤后的上清液中缓慢加入 3 倍体积的无水乙醇，边加边搅拌，使多糖沉淀出来。
然后将溶液置于 4℃冰箱中静置过夜。
6、离心收集将醇沉后的溶液在 4000 r/min 的转速下离心 15 分钟，收集沉淀。
7、洗涤用无水乙醇和丙酮依次洗涤沉淀，以去除其中的杂质。
8、干燥将洗涤后的沉淀置于真空干燥箱中，在 60℃下干燥至恒重，得到香菇多糖的粗品。
9、多糖的定性分析（1）苯酚硫酸法：取适量的香菇多糖粗品，用蒸馏水溶解，制成一定浓度的溶液。
然后取 1 mL 溶液，加入 1 mL 5%的苯酚溶液和 5mL 浓硫酸，摇匀后在沸水浴中加热 15 分钟，冷却至室温后，在 490 nm 处测定吸光度。
香菇中糖类物质离与测定————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：香菇中糖类物质的分离与测定摘要：本实验采用热水浸提和乙醇醇沉的方法提取香菇多糖（Lentinan，LNT），利用正交法得出最佳提取粗多糖的方案，得到的粗多糖回收率为14.05﹪，再对得到的粗多糖进行定性、定量分析。
用苯酚—硫酸法测定已提取出的粗多糖中单寡糖与多糖的含量为35.9%；经过薄层层析和纸层析法分析单糖的组成，其中组成多糖的单糖多属于葡萄糖和阿拉伯糖；用Sepharsose CL—6B柱层析法测定多糖的相对分子量约为5597.58道尔顿。
气象色谱分析单糖含的结果是香菇多糖中的单糖种类有半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、岩藻糖等，其中含量较多的半乳糖和葡萄糖。
关键字：香菇多糖回收率含量组成相对分子量Separation and Determination of carbohydrates in Lentinus edodesAbstract：This experiment extracts of lentinan (Lentinan LNT) by using hot water extraction and ethanol alcohol precipitation method. The orthogonal method to get the optimum extraction of polysaccharides is the best program, resulting polysaccharides recovery of 14.05%, and then to get crude polysaccharide qualitative and quantitative analysis. By using Phenol-sulfuric acid method, extracted polysaccharides single oligosaccharides and polysaccharides content was 35.9%; TLC and paper chromatography analysis monosaccharide composition, the monosaccharide composes mostly of glucose and arabinose; Relative molecular weight of polysaccharide determined by Sepharsose CL-6B column chromatography is about 5597.58 daltons. The results of gas chromatographic analysis of a monosaccharide is galactose, glucose, arabinose, fucose, sugar, and other types of monosaccharides in the lentinan. galactose and glucose are much more among them.Key words： Lentinan; Recoveries; Content; Composition; Relative molecular weight0 引言：糖类化合物是中药的重要成分，随着现代生物化学与分子生物学的不断发展与进步，人们对糖的了解越来越多。
而糖生物学研究对揭示生命本质，实现中药现代化，深入开发中药资源有着重要的意义。
但是,目前多糖的研究主要以陆生植物为主, 有些源于名贵中药,这不利于多糖应用与研究的进一步发展。
因此物美价廉的香菇受到越来越多的关注。
香菇（Lentinus edodes）是侧耳科（Pleara taco）的担子菌，含有多种有效药用成分。
尤其是香菇多糖（Lentinan，LNT）是一种宿主免疫增强剂（Host defense-tiator，HDP），它具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能和刺激干扰素形成等功能。
本团队以热水提取法获得香菇多糖（Lentinan，LNT），并对其理化性质，含量和组成进行了一定规模的研究分析，为香菇多糖的开发与利用提供了实验依据。
1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 材料：香菇1.1.2 试剂（1）无水乙醇（2）无水乙醚（3）P2O5 （4）浓硫酸（5）6%苯酚（6）葡萄糖（7）BaCO3（8）显色剂：苯胺-邻苯二甲酸正丁醇饱和水溶液展层剂：正丁醇：乙醇：水=4:1:5（体积比）标准糖样：甘露糖、木糖、半乳糖、葡萄糖等琼脂糖凝胶（12）洗脱液：生理盐水（9g /ml ）蓝色葡聚糖及不同相对分子质量葡聚糖标准样1.1.3仪器（1）电子天平（2）烧杯（3）玻璃棒（4）恒温水浴锅（5）纱布（6）容量瓶（7）真空干燥器（8）分析天平（9）移液管（10）可见光分光光度计（11）水解管（12）滤纸（13）漏斗（14）毛细管（15）硅胶板（16）层析缸（17）烘箱（18）喷雾剂（19）层析柱1cm×90cm （20）恒流泵（21）记录仪（22）自动部分收集器（23）紫外检测仪1.2 香菇中多糖的提取称取晒干的香菇30.32g，用剪刀剪碎成小块，用自来水浸泡约24h后，在80℃下煮提1.5h，用纱布过滤取滤液至铁钢中，再加入少量水按以上方法分别煮提1h、0.5h，将3次得到的滤液在120℃下浓缩至50ml以下，转移至两成为250ml烧杯中，加入3倍体积95%乙醇中，封上封口膜保存。
醇沉后倒出上清，将沉淀3000r/min离心15min，取出沉淀，沉淀依次用无水乙醇、乙醚脱水，P2O5真空干燥过夜，即得粗多糖。
1.3香菇中单寡糖与多糖的含量测定游离的单寡糖多糖中的己糖、糖醛酸在浓硫酸作用下，可脱水生成糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物。
己糖生成的化合物在490nm波长处有最大吸收峰，吸收值与糖含量呈线性关系。
因此可以通过测定单糖的吸收值来测定单糖的含量。
利用此原理便可测定香菇中单糖的含量。
1.3.1 标准曲线的制定本实验的以葡萄糖为标准制定标准曲线，按照如下表格试剂量，分别向6个试管中加入不同量的试剂，并立即摇匀，室温放置10min后于490nm处测定光吸收值，以横坐标为多糖微克数，纵坐标为光吸收值，绘制葡萄糖微克数与光吸收值之间的标准曲线。
试管编号葡萄糖/ml 蒸馏水/ml 6%苯酚/ml 浓硫酸/ml A490nm0 0 1.0 0.5 2.51 0.2 0.8 0.5 2.52 0.4 0.6 0.5 2.53 0.6 0.4 0.5 2.54 0.8 0.2 0.5 2.55 1.0 0 0.5 2.51.3.2 香菇中单寡糖与多糖含量测定将待测样品称取5mg，水溶并定容至50ml，然后取干燥洁净试管，将5mg/50ml待测样品、6%苯酚溶液、浓硫酸依次按照1.0ml：0.5ml：2.5ml的比例加入，混匀。
冷却10min后，静置，以蒸馏水代替糖溶液作对照，在490nm下比色，并做3个重复。
所得数值取平均值，对照标准曲线可得单寡糖与多糖含量。
1.4 香菇多糖的单糖组成分析—薄层层析与纸层析分析法本实验采用2种方法来测定香菇多糖中单糖种类，薄层层析法与纸层析法。
薄层层析是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，以液体为流动相的一种层析方法，利用固定相对物质的吸附能力不同而使物质得到分离。
本实验应用吸附薄层层析法，即以硅胶为吸附剂。
根据同一块硅胶板中糖的Rf与标准糖的Rf相比较，即可对单糖的组成进行鉴定。
其中溶质的移动速率Rf等于原点到层析斑点中心的距离与原点到溶剂前缘的距离的比值。
纸层析法是以纸为载体分离不同物质的方法，固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为层析液，根据相同时间内不同样品与标准样移动的距离来确定单糖种类。
1.4.1 薄层层析分析法（纸层析方法与此相同，不再赘述）1.4.1.1香菇多糖酸水解将20mg待测糖样加1mol/l浓硫酸2ml，封管，100℃水解8h，固体BaCO3中和，过滤，浓缩至1ml。
1.4.1.2 点样点样时将硅胶板水平放置，用毛细管在预先标好的位置上（如制板前，在距硅胶板一段2cm处用铅笔画一直线，在直线上，以1.5cm间隔打点作为点样位置）分别点上标准样及待测糖样，点样斑点尽可能小，直径不大于4mm。
待干后，重复点样3~4次，且待测糖样要点在中间。
1.4.1.3 展层将硅胶板放进层析缸内，点样端靠近展层剂，贮液槽内加入展层剂，硅胶板在此密封层析装置中展层。
1.4.1.4 染色待展层剂到达离层析板上沿1~2cm时，取出层析板，记录溶剂前沿，置60℃烘箱中烘干。
后用喷雾器向硅胶板上喷洒显色剂（苯胺-邻苯二甲酸正丁醇饱和水溶液）再经100℃显色15min，即显色各层析斑点。
1.4.1.5 计算相对迁移率Rf测定每个斑点中心距加样原点的迁移距离，计算相对迁移率Rf。
通过Rf判断样品中含有的单糖种类。
1.5 香菇多糖相对分子质量分布分析——Sepharose CL-6B柱层析法本实验主要采用凝胶过滤色谱对所提取的多糖进行相对分子的检测。
凝胶过滤层析主要根据小分子可以进入凝胶网孔，移动进程长;大的分子则被排阻于凝胶颗粒之外，将随洗脱液从凝胶颗粒之间的空隙洗脱下来，移动路程短，迁移的速度快，这样就可以实现我们分离的目的。
本小组首先使用了两个标准样，根据其洗脱体积和相对分子质量制作标准曲线，之后再根据待测样的洗脱体积，得出待测样的相对分子质量，详细步骤如下：1.5.1 凝胶浸泡将琼脂糖凝胶用乙醇浸泡，胀后倒去不易沉下的较细颗粒。
将溶胀后的凝胶抽干，用10倍体积的洗脱液处理约1h ，搅拌后继续除去悬浮的较细颗粒。
1.5.2 装柱将琼脂糖凝胶分析住垂直装好，关闭出口，加入10cm缓冲液。
将处理好的凝胶用等体积的洗脱液搅拌成浆状，自柱顶部沿管壁缓慢加入，待底部凝胶体积约1cm 高时，再打开出口，继续加入凝胶浆，至凝胶沉积至刻度线（80cm）即可。
装柱要求连续、均匀、无气泡。
1.5.3 平衡将洗脱液与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析柱入口相连，用2~3倍体积洗脱液进行洗脱和平衡（2~2.2./10min /管）1.5.4 加样与洗脱将柱中多余的液体放出，使液面刚好盖过凝胶，关闭出口，将1ml 样品（第一次加样为相对分子质量为15.3万，第二次为46.17万，第三次为待测样）沿层析柱管壁小心加入，加完后打开底端出口，使液面降至与凝胶面相平时关闭出口，用少量洗脱液洗柱内壁2次，加洗脱液至液面4cm 左右，接上恒流泵，调好流速（流速为2~2.2ml /10min /管），用9g /lnacl 溶液开始洗脱。
