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未知基因的鉴定

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原核生物和真核生物目的基因的克隆并鉴定

摘要：要获得一个未知基因的功能，首先应构建其基因文库，分离目的基因，进而表达，筛选。

关键词：基因文库；基因克隆；筛选

一 真核生物目的基因的克隆并鉴定的方法

1 cDNA基因文库的构建 构建cDNA基因文库主要包括以下几个步骤：细胞总RNA

的制备及mRNA的分离、cDNA第一条链的合成、cDNA与载体

的连接和噬菌体颗粒的包装及转染或质粒的转化等。通过适当的

方法构建了一个完整的基因组DNA文库或cDNA文库，意味着包含

目的基因在内的所有基因都得以克隆，但这并不等于完成了目的

基因的分离。因为在基因文库中，不论是cDNA文库还是基因组

DNA文库，含目的基因的克隆子都只是数以万计的克隆子中的一

个，其中究竟哪一个克隆子含有我们所要研究的目的基因序列尚

不得而知。因此克隆一个基因的下一个步骤就是从基因文库中筛

选分离出含有目的基因的特定克隆子。

2 目的基因的分离 目的基因的分离的方法有很多，基因芯片技术分离目的基因基

因文库技术分离目的基因，mRNA差别显示技术分离差别表达基

因，插入突变分离克隆目的基因等等。 2.1 基因芯片技术分离目的基因 分离目的基因是是指从基因组中发现或找出某个目的（标）

基因。目前是通过①比较不同物种之间，或同一物种不同个体之

间；或同一个体在不同生长发育是期或不同环境条件下基因差异表达（基因表达平行分析）来实现的。采用基因芯片技术进行基

因差异表达研究可以通过杂交直接检测到细胞中mRNA的种类

及丰度，与传统的差异显示相比具有样品用量小，自动化程度高，

被检测目标DNA密度大及并行种类多等优点。②利用同源探针

从cDNA或EST微列阵中筛选分离目的基因。目前有DNA芯片、

cDNA芯片两种。其基本步骤包括：基因芯片的制备、靶样品制

备、杂交与检测、目的基因得分离并获得全长。

2.2 功能蛋白组分离目的基因

蛋白组是指细胞内全部蛋白的存在及活动方式，即基因组表

达产生的总蛋白质的统称。功能蛋白质组指那些可能涉及到特定

功能机理的蛋白质群体。主要研究方法为蛋白质双向电泳。通过

高效液相色谱、质普对蛋白质序列进行分析，在借用分子生物学

的手段则可以进行目的基因的分离。如：应用PCR进行分离目

的基因：通过对蛋白质的序列分析，可以通过密码子的简并性设

计简并引物，可利用RT-PCR得到目的基因的全长；应用核算杂

交筛选法分离目的基因：即利用简并寡核苷酸探针筛选cDNA或

基因组文库；免疫雪筛选法分离目的基因：是通过蛋白的特异抗

体与目的蛋白的专一结合，从表达文库中分离目的基因的蛋白基

因。

3目的基因与载体连接后导入受体细胞 3.1 根癌农杆菌Ti质粒介导法 农杆菌介导的Ti质粒载体转化法是目前研究最多、机制最清楚、技术

方法最成熟的基因转化途径。 3.2 高压电穿孔法

利用脉冲电场将DNA导入受体细胞的方法叫做高压电穿孔法。利用这种方法，可以将DNA导入动、植物及细菌细胞。具有简单方便、对细

胞毒性低以及转化效率高等优点。

此外还有聚乙二醇介导的原生质体转化法，磷酸钙或DEAE一葡聚糖

介导的转染，原生质体融合，脂质体法，显微注射法，颗粒轰击（particle bombardment）技术等等。

4 重组体的筛选 克隆的筛选可以根据载体类型、受体细胞特性的变化、外源DNA分子本身的特性，采用不同的方法。主要有遗传学检测、物

理特性检测、分子杂交以及免疫学分析等。从初步筛选直到分子

杂交，进一步到DNA测序和基于蛋白质功能的分析，使得对克

隆的检测逐步深入、精确。 4.1.1 抗药性筛选

这是利用载体DNA上组装的抗药性选择标记进行筛选的方法。

重组质粒DNA携带特定的抗药性基因，转化后赋予受体菌在含

有相应抗生素的培养基上正常生长，而不含此载体的DNA的受

体菌不能存活。在质粒载体中通常使用双抗药性标记。

例如：以质粒载体pBR322为例，pBR322含有Tetr和Ampr两个

抗性基因。非重组的野生型pBR322应该表现出对Tet和Amp两

种抗生素的抗性活性。能在其中之一下生长的受体菌，说明其受

体细胞已被转化。 4.1.2插入失活筛选法

检测克隆载体携带有外源DNA的通常方法是插入失活。经过抗

药性筛选获得的大量转化子中既包含所需要的重组子，也包含非

重组子。为了进一步筛选出重组子，可利用质粒载体的抗药性进

行再次筛选。 如：pBR322有四环素抗性基因（Tetr）和氨苄青霉素抗性基因

（Ampr），在Tetr基因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制酶位点，如

果在这两个位点中有外源DNA插入，都会导致Tetr基因失活。

将转化后的细胞分别培养在含氨苄青霉素和四环素的培养基中，

便可检出转化子细胞。

此外还有插入表达筛选法，环丝氨酸筛选，显色反应筛选法，

报告基因，物理检测法等等，在此不一一赘述。

5 目的克隆的鉴定

经过初步筛选获得的阳性克隆，下一步必须对带有目的序列

的克隆做进一步筛选和鉴定。鉴定一般有几种常用方法：（1）分

子杂交；（2）免疫学检测；（3）DNA测序；（4）蛋白质活性筛选；

（5）基因互补实验。 1. 分子杂交

核酸分子杂交有多种方法：原位杂交、点杂交及Southern杂

交等。 2. 免疫学检测

免疫学检测的前体是需要有目的蛋白质，一般从纯化的蛋白质制

备抗体。

3. 蛋白质活性和功能互补筛选 DNA杂交和免疫检测对于多数基因和基因产物都是有效的。

蛋白质活性作为克隆的指示标记有一定的难度。如果筛选的目的

蛋白是一种酶，也可以根据酶对底物的反应来设计克隆的检测。

功能互补法：该方法要求被转化的宿主细胞是某一特定基因

的缺陷株，携带来自野生型基因DNA的质粒，在宿主细胞中能

与缺陷基因互补，最终选择具有正常功能的转化细胞。 二 原核生物目的基因的克隆并鉴定的方法

1、原核生物基因文库的构建 基因组 DNA 文库的构建程序包含 5 个部分：① 载体的制

备；② 高纯度大分子量基因组 DNA （High molecular weight DNA,

HMW DNA）的提取；③高纯度DNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离；

④ 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；⑤ 重组克隆

的挑取和保存。

1、1载体的选择

构建大片段基因组 DNA 文库使用的载体主要有 λ 噬菌体

（λ phage）、粘粒载体（cosmid）、细菌人工染色体（Bacterial

Artificial Chromosomes, BAC）、酵母人工染色体 YAC（Yeast

Artificial Chromosomes, YACs）、 P1 （Bacteriophage P1）和

PAC 。根据特征，这些载体可以分为两类，一类是基于噬菌体改

建的，利用了噬菌体的包装效率高和杂交筛选背景低的优点；另

一类经改造的质粒载体或人工染色体，其主要优点在于可容纳超

过 100kb 以上的外源片段，按λ噬菌体DNA复制的方式繁殖，仍

只有按质粒DNA的进行复制。

2、应用核酸探针分离克隆的目的基因： 当把基因文库转移到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜之后，就可以

同特异性的核酸探针进行菌落或噬菌班杂交，以便筛选出具有目

的基因的阳性克隆。这个过程叫做克隆基因的分离或筛选。

原位杂交法：这一种利用特异探针的直接选择法，是一种十

分灵敏而且快速的方法。用于杂交的探针可以是双链DNA，也可

以是单链DNA，或是RNA。杂交的检测常用放射性同位素标记探针，通过自显影来进行。显然，有效进行杂交筛选的关键是获得特异

的探针。探针的获得有如下方法：

①如果目的基因序列是已知的，或部分序列是已知的，探针可以

从已有的克隆中制备，或用PCR方法扩增。

②如果目的基因是未知的，而有其他物种的同源序列，那么可以

用同源序列做探针。

③如果目的基因未知，但知道它对应的蛋白质序列，可根据蛋白

质序列设计相应的核酸探针.

3 目的基因的鉴定 原核生物目的基因常用的鉴定方法有遗传检测法、物理检测法、

菌落或噬菌斑杂交筛选法、免疫化学检测法、蛋白质筛选法、转

译筛选法 。

（1）蓝白斑筛选：根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、

抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA

的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146

个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点

（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半

乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳

糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段

虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋

白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有

完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-

互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物

X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA

插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重

组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物

转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的

细菌形成白色菌落。

（2）抗生素抗性原理。质粒载体一般都带有抗生素抗性基因，当

其携带目的基因转化入宿主细菌时，使宿主也带有抗生素的抗性。

置于含抗生素的培养基中培养，能够生长的就是含重组子的细菌。

（3）许多重组体的初选既不能用抗性筛选也不能用白斑筛选，只

能用PCR、电泳、酶切等方法进行，而这种筛选则需提取质粒后

才能进行。通常做法是将连接的产物涂在LB平板上，然后挑取菌

落进行培养，再提取其质粒进行PCR、电泳、酶切、测序等鉴定。

此方法虽然有效，但过程繁琐、试剂消耗多，而且对连接效率低，

重组体极少时则需要选择大量的菌落提取其质粒进行PCR

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获得未知基因的方法

获得未知基因的方法

染色体步移技术(Genome walking）：这是一项重要的分子生物学研究技术，使用这种技术可以有效获取与已知序列相邻的未知序列。染色体步移技术主要有以下几方面的应用：

①根据已知的基因或分子标记连续步移，获取人、动物和植物的重要调控基因，可以用于研究结构基因的表达调控。如分离克隆启动子并对其功能进行研究；

②步查获取新物种中基因的非保守区域，从而获得完整的基因序列；

③鉴定T-DNA或转座子的插入位点，鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导致的外源基因的插入位点等；

④用于染色体测序工作中的空隙填补，获得完整的基因组序列；

⑤用于人工染色体PAC、YAC和BAC的片段搭接。

对于基因组测序已经完成的少数物种（如人、小鼠、线虫、水稻、拟南芥等）来说，可以轻松地从数据库中找到某物种已知序列的侧翼序列。但是，对于大多数生物而言，在不了解它们的基因组序列以前，想要知道一个已知区域两侧的DNA序列，只能采用染色体步移技术。常用的方法有：

1. 反向pCR（reverse PCR）: 其基本点是用适当内切酶裂解核心区外分子，使这些酶切片段自身连接形成环状分子，从而将边侧区域转化为内部区域。用与核心区末端同源的引物，但其 3’端趄向未知区域，可以进步用pCR扩增环中的未知区域。

反向pCR程序

目前，反向pCR所扩增的片段的大小实际上限为3-4kb。在许多情况下，首先需要进行Southern杂交来确定内切酶用以产生大小适于环化及反向pCR的片段的末端片段。能裂解核心区的内切酶使反向pCR只能扩增引物所定模板(依赖于引物)的上游或上游区，而不裂解核心区的酶则使两上边侧序列都扩增，并带有由内切酶和环化类型决定的接点。对于扩增左翼或右翼序列，初试时最好靠近识别上个碱基位位的酶，并已知在核心区有其方便的裂解位点。如果用反向pCR从含有大量不同的克隆片段的同一载体中探测杂交探针，建议事先在载体中引入合适的酶切位点。

探索未知的身体-基因检测

探索未知的身体-基因检测

探索未知的身体：基因检测

现代医学认为，疾病是由外在因素(生活方式、社会、环境、医疗)和内在因素(遗传因素)共同决定的。外在因素通过内在因素起作用。基因检测通过检测人体内疾病易感基因，预测疾病的患病风险，从而指导生活方式、环境、医疗等外在因素的选择或调整，实现对疾病的针对性预防和监控，延缓甚至阻断疾病的发生。

一、基因检测概述

1990年，美、英、法、德、日、中六国启动人类基因组计划；十年后，最终绘制出完整的人类基因图谱。计划完成后，基因组学迅速发展，并逐步应用于人类的疾病治疗。同时，基因测序的产业链也在少数国家开始形成。

基因是DNA分子上的一个功能片断，是遗传信息的基本单位，是决定一切生物物种最基本的因子；基因决定人的生老病死，是健康、靓丽、长寿之因，是生命的操纵者和调控者。因此，哪里有生命，哪里就有基因，一切生命的存在与衰亡的形式都是由基因决定的，包括您的长相、身高、体重、肤色、性格等均与基因密不可分。

基因检测是通过血液、其他体液或细胞对DNA进行检测的技术，是取被检测者脱落的口腔黏膜细胞或其他组织细胞，扩增其基因信息后，通过特定设备对被检测者细胞中的DNA分子信息作检测，预知身体患疾病的风险，分析它所含有的各种基因情况，从而使人们能了解自己的基因信息，从而通过改善自己的生活环境和生活习惯，避免或延缓疾病的发生。

基因检测可以诊断疾病，也可以用于疾病风险的预测。疾病诊断是用基因检测技术检测引起遗传性疾病的突变基因。目前应用最广泛的基因检测是新生儿遗传性疾病的检测、遗传疾病的诊断和某些常见病的辅助诊断。

预测性基因检测即利用基因检测技术在疾病发生前就发现疾病发生的风险，提早预防或采取有效的干预措施。检测的时候，先把受检者的基因从血液或其他细胞中提取出来；然后用可以识别可能存在突变的基因的引物和PCR技术将这部分基因复制很多倍，用有特殊标记物的突变基因探针方法、酶切方法、基因序列检测方法等判断这部分基因是否存在突变或存在敏感基因型。

实验五 食品中未知成分的鉴定

实验五 食品中未知成分的鉴定

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实验五 食品中未知成分的鉴定

光谱技术在食品分析中的应用

实验五 食品中未知成分的鉴定-红外光谱法

一、实验目的

1、掌握红外压片法制样技术及傅立叶变换光谱仪器的简单操作。 2、学会查阅红外标准谱图库，定性分析化合物。

二、根本原理

物质分子中的各种不同基团，在有选择的吸收不同频率的红外辐射后，发生振动能级之跃迁，形成各自独特的红外吸收光谱。据此，可对物质进行定性和定量分析。特别是对化合物结构的鉴定，应用更为广泛。

三、仪器和试剂

1、仪器：

美国热电集团的Nicolet380型红外光谱仪、压片机、玛瑙研钵、红外灯。 2、试剂

待分析化合物试样，分析纯KBr。

四、实验步骤

1、样品的制备

①首先把分析纯KBr在玛瑙研钵中充分研细〔通常过200目筛〕，放在枯燥器中备用。 ②按比例取一定量〔如果是定量分析那么应准确称量〕样品2～5mg和研磨过筛的KBr粉100～120mg于玛瑙研钵中，充分研磨混合均匀，直到混合物中无明显样品颗粒存在为止。以上操作应在红外灯下进行，以防KBr吸水。

2、制样

①装模：戴上手套，从枯燥箱中取出备用的压片模具，将上模倒置，放在压圈上；在上模的孔中放入顶杆和压舌，放压舌前，认准光洁度高的一面，并把它朝上放平。在压舌上放置试样，再把另一压舌光洁度高的一面向下，放入上模孔中，防止粉末附着在模心的边缘，并将试样研平，使其中心略高出，然后将顶杆轻轻的放在样品上转动两三次以使样品分布均匀，将下模塞进上模孔中。 2 / 3

②压片：把装有试样的模具放在压片机的工作台中央，旋紧螺杆。顺时针旋紧压片机的阀门。用手柄上下缓缓加压至适当压力〔8吨即27MPa即可〕。让试样持续加压保持2min后，逆时针旋松阀门，放松螺杆，即可取下模具。

③去模：去掉下模，把压圈放入上模孔中，将模具放在压片机工作台上，旋紧螺杆，直到压舌脱出，即可。

随机引物法克隆未知序列基因

随机引物法克隆未知序列基因

随机引物法克隆未知序列基因

随机引物PCR(arbitrarily primed PCR,AP-PCR)首先被用于基因组DNA或RNA的指纹图谱(finger print)分析,后来也有人将这种方法用于克隆与表型相关的基因或mRNA。该方法的理论依据是:表型受基因支配,在一个生物体发生了表型变化后,其基因组DNA很可能发生变化或出现不同基因的激活或关闭等;另一方面,如在寄生虫的发育过程中,不同发育阶段的虫体所表达的基因很可能不同,如将不同发育阶段的虫体mRNA提取出来,用单一引物(随机引物,其长度不超过16 nt)对不同时期的虫体mRNA进行扩增比较,即可找出导致表型变异的遗传学依据。这种方法是一种比较PCR,它要求至少有2种来自不同表型但又很类似的基因组DNA或mRNA。AP-PCR扩增后的产物必须99%是一致的,只有个别特异的产物出现在特异的表型个体中。该方法对表型或种源关系相差甚远的生物个体之间没有比较意义

应用AP-PCR法进行2种或多种表型特征类似的个体间指纹图谱分析或表型相关基因克隆

箭头所指扩增带为特异于个体(Ⅱ)的扩增产物

AP-PCR的操作一般采用两步法,即前10个循环多以较低的退火温度(annealing temperature)进行扩增,后20个循环则采用较高的退火温度扩增。AP-PCR产物多较短,一般需高浓度的琼脂糖凝胶检测,也可用聚丙烯酰胺凝胶检测。如扩增的模板为mRNA,通过比较扩增产物的强度,可以得知该基因在2种生物或同一生物不同发育阶段的表达强度。另外,在AP-PCR检测到与某一表型相关的基因或基因产物(mRNA)以后,下一步工作就是克隆出整个基因或mRNA。主要操作程序为:(1)AP-PCR产物的提取、克隆及序列测定。首先将AP-PCR检测到的特定片段从凝胶中切下,提取DNA克隆到适宜的载体内(如TA载体),再测定其核苷酸组成。根据其核苷酸组成设计2个方向相反的引物(P-1,P-2)。引物长度多在20 nt以上；退火温度在60℃以上；(2)将基因组DNA做适当酶切,然后在其两端连接上相同的接头,。根据接头的序列扩增。