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第三章 荧光分析法

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荧光分析法实验版

荧光分析法实验版

后期作图 1.打开origin软件→ →x.txt→找到已保存的文件（两个通 道）→Add→OK 点击 → →Add→ →Add→OK。 出现光谱图 2.双击X AXTS TITLE，出现对话框，改为x/nm,双击y Ax改为 y/F.点击 图标，移动鼠标到峰点，再点T图标，再点左键 ，输入数值297nm 重复再输入另一峰值 重复输入excitation emission 即成 3.再点击File(电脑左上方) →（save project）点击，输入文件 名，点保存。 4．最后点击→Edit(在File后)，点击copy page,即可复制在 word文档。 这件完整的图形即可在用U盘拷贝了。
O C COO

荧光物质（荧光素）
菲荧光物质（酚酞）
取代基团
温度 溶剂 pH值
荧光熄灭 由于荧光物质分子间或与其它物质相互作用，引起荧光强度显著下降的 现象叫做荧光熄灭（quenching ）或猝灭。引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭 剂，如卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物和羧基化
光强度F（即激发光波长扫描）。然后以激发
光波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐标作图，
就可得到该荧光物质的激发光谱。
激发光谱上荧光强度最大值所对应的波长
就是最大激发波长，是激发荧光最灵敏的波长。 物质的激发光谱与它的吸收光谱相似，所不同 的是纵坐标。
2. 荧光光谱 荧光光谱，又称发射光谱。保持激发光波
由光源发出的光，通过激发单色器后变成单色光，而后照
在荧光池中的被测样品上，由此激发出的荧光被发射单色器收
集后。经单色器分散成单色光而照射在光电倍增管上转换成相
应的电信号，经放大器放大反馈入A/D转换单元，将模拟电信 号转换成相应的数字量。并通过显示器或打印机显示记录下被 测样品的图谱。这就是荧光光度计的基本工作原理。

荧光分析法的基本原理

荧光分析法的基本原理

荧光分析法的基本原理
荧光分析法是一种常用的分析化学方法，它利用物质在受到激发后发出的荧光
来进行定量或定性分析。

荧光分析法具有灵敏度高、选择性好、分析速度快等优点，因此在生物医学、环境监测、食品安全等领域得到了广泛的应用。

荧光分析法的基本原理是物质受到激发后发出的荧光强度与其浓度成正比。

当
物质受到特定波长的激发光照射后，其中的分子会吸收能量并处于激发态，随后分子会自发地返回基态并释放出能量，这种能量以荧光的形式发射出来。

荧光分析法利用荧光强度与物质浓度的关系来进行分析，通过测量样品的荧光强度，可以间接地推断出样品中目标物质的浓度。

荧光分析法的基本原理还包括激发光源、激发光和荧光检测器。

激发光源通常
采用紫外灯或激光器，用于提供足够的能量来激发样品中的分子。

激发光是指对样品进行激发的光线，其波长通常由样品的特性决定。

荧光检测器则用于测量样品发出的荧光强度，并将其转化为电信号进行处理和分析。

在实际应用中，荧光分析法可以应用于各种领域。

在生物医学领域，荧光分析
法可以用于检测生物标记物、药物浓度、蛋白质含量等，具有灵敏度高、特异性强的优点。

在环境监测领域，荧光分析法可以用于检测水体中的重金属离子、有机物污染物等，能够快速、准确地进行分析。

在食品安全领域，荧光分析法可以用于检测食品中的添加剂、农药残留、重金属等有害物质，为食品安全提供可靠的分析手段。

总之，荧光分析法作为一种灵敏度高、选择性好的分析方法，具有广泛的应用
前景。

通过深入理解荧光分析法的基本原理，结合实际应用需求，可以更好地利用这一分析方法，为各个领域的分析工作提供更加准确、快速、可靠的支持。

荧光分析法

荧光分析法
荧光分析法
光致发光：
吸收某种波长的光后发射出比吸 收波长更长的光的现象。 (荧光和磷光)
荧光分析法 (fluorormetry)
荧光光谱→定性分析 荧光强度→定量分析 分类： 原子荧光分析、分子荧光分析
紫外-可见荧光分析 红外荧光分析 X射线荧光分析
第一节 基本原理 一、分子荧光
（一）分子荧光的产生 1、分子的电子能级与激发过程
=
hc
E
2、荧光的产生
振动驰豫
内转换 体系间跨越
磷光
吸收
荧光
外转换
振动驰豫
发生在同一电子能级内，分子通过
碰撞以热的形式损失部分能量，从较高
振动能级下降到该电子能级的最低振动
能级上。无辐射跃迁。
内转换
即激发态分子将多余的能量转变 为热能，从较高电子能级降至较低的 电子能级。内转换也属于无辐射跃迁。
OHH+
NH-
pH<2
pH7~12 兰色荧光
pH>13
荧光熄灭
荧光熄灭（荧光猝灭）：由于荧光物质分子与 溶剂分子或其它溶质分子碰撞而引起荧光强度 降低或荧光强度与浓度不呈线性关系的现象。 荧光熄灭剂(quenching medium)：引起荧光熄灭 的物质。如卤素离子、重金属离子、氧分子以 及硝基化合物、重氮化合物、羰基、羧基化合 物均为常见的荧光熄灭剂。
外转换
荧光 较高激发态分子经无辐射跃迁降 至第一电子激发单重态的最低振动能 级后，仍不稳定，停留较短时间后
（约 10-8 s ，称作荧光寿命），以光
辐射形式放出能量，回到基态各振动
能级，这时所发射的光称为荧光。
系间跨跃
第一电子激发态的最低振动能级经过另一 个无辐射跃迁转移至激发三重态，称为系间跨 跃。

荧光分析法

荧光分析法

荧光分析法一、基本原理某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法（fluorescence analysis）。

荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点，它的测定下限通常比分光光度法低2~4个数量级，在生化分析中的应用较广泛。

在室温下分子大都处在基态的最低振动能级，当受到光的照射时，便吸收与它的特征频率相一致的光线，其中某些电子由原来的基态能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态中的各个不同振动能级，这就是在分光光度法中所述的吸光现象。

跃迁到较高能级的分子，很快（约10-8s）因碰撞而以热的形式损失部分能量，由所处的激发态能级下降到第一电子激发态的最低振动能级，能量的这种转移形式，称为无辐射跃迁。

由第一电子激发态的最低振动能级下降到基态的任何振动能级，并以光的形式放出它们所吸收的能量，这种光便称为荧光。

荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后，物质本身所发射的光的强度。

物质吸收的光，称为激发光；物质受激后所发射的光，称为发射光或荧光。

如果将激发光用单色器分光后，连续测定相应的荧光的强度所得到的曲线，称为该荧光物质的激发光谱（excitation spectrum）。

实际上荧光物质的激发光谱就是它的吸收光谱。

在激发光谱中最大吸收处的波长处，固定波长和强度，检测物质所发射的荧光的波长和强度，所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱（fluorescence spectrum）。

在建立荧光分析法时，需根据荧光光谱来选择适当的测定波长。

激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据。

对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。

荧光物质的线性范围一般在0.00005-100微克/ml,当荧光物质溶液的吸光度小于或等于0.05时荧光强度和浓度才成线性关系。

仪器分析原理3原子荧光光谱与X射线荧光光谱分析

仪器分析原理3原子荧光光谱与X射线荧光光谱分析

§3.2.3 X射线散射 X射线通过物质时的衰减现象部分是由散射引起的。根据 X射线的能量大小和原子内电子结合能的不同，散射可分 为弹性散射(瑞利散射)和非弹性散射(康普顿散射)。
1. 弹性散射(瑞利散射) 由相对能量较小(波长较长)的X射线与原子中束缚较紧 的电子(原子序数大的内层电子)发生弹性碰撞。
If =φIo A(1 – e–KlN)
括号内展开为级数，并忽略高次项，得到：
If =φIo AKlN
If =kC
在实验条件保持一定时，上式除了N之外，均可视 为常数。而且N和试样中被测元素的浓度C成正比。
此式为原子荧光定量分析的基础。
§3.1.3 量子效率和荧光猝灭
1. 量子效率 处于激发态的原子跃迁回到低能级时，可能发射共振 荧光，也可能发射非共振荧光，或者无辐射弛豫。 量子效率表示这些过程可能性的大小：
L层又产生一空穴。 因此，L→K的回落和Auger电子的逐出，使L层 出现两 空穴，即双重电离。
当出现双重电离时，会出现M→L跃迁，此跃迁放出的hυ 是卫星线。卫星线一般较弱，且随Auger增大而增大。对 重元素来说，卫星线的强度一般很低，因此，在X射线荧 光分析中没有什么重要意义。然而对轻元素来说，卫星线 可能相当强。
直跃荧光：激发态原子直接回到基态或高于基态的亚稳态 阶跃荧光: (1) 正常阶跃荧光为激发态原子先以非辐射方式失去部 分能量降到较低能级的激发态，然后去激发产生荧光。(2) 热助阶 跃荧光为被光照射激发的原子，跃迁至中间能级，又发生热激发
至高能级，然后返回至低能级发射的荧光。
3. 敏化荧光：激发态的原子D*不直接产生荧光，而是通 过碰撞原子A去激发，同时形成激发态A*，然后A*去 激发产生荧光。 D* + A → D + A*

荧光分析法

荧光分析法

第二节 基本原理
一、荧光与磷光的产生过程 二、激发光谱与荧光(磷光)光谱
2020/6/12
一、荧光与磷光的产生过程
1.电子激发态的多重度
电子激发态的多重度：M=2S+1
S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；
平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应 单重态能级低；
大多数有机分子的基态处于单重态；
1.荧光(磷光)的激发光谱曲线
固定荧光测量波长(选最大发射波长),测定得到的化合物 发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线 图中曲线I
激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光 强度最大；
2020/6/12
2.荧光光谱(或磷光光谱)
固定激发光波长(选
最大激发波长),测定得 到的化合物发射的荧光(
S0→T1 禁阻跃迁； 通过其他途径进入 (见能级图)；进入的 几率小；
2020/6/12
一、荧光与磷光的产生过程
2Hale Waihona Puke 分子能级与跃迁：分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；
基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：
吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速
T1 → S0跃迁）； 电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁）
S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1 发光速度很慢： 10-4～100 s 。
2020/6/12 光照停止后，可持续一段时间。
二、激发光谱与荧光(磷光)光谱
荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？
第一节 概述
一、什么是荧光？ 当某物质吸收特定波长的光之后，除产

荧光分析法

荧光分析法

3 2 1 V＝0
吸光
无辐射跃迁
3 2 1 V＝0
无辐射跃迁
吸光
荧光
3 2 1 V＝0
荧光的产生
蒽结晶体或乙醇溶液吸收 366nm 紫外光， 产生青紫色的荧光。
激发单重态
荧光
基态
（二）分子荧光的分类
• 紫外-可见光荧光 • X射线荧光 • 红外光荧光
二、荧光激发光谱(Excitation spectrum) 和荧光发射光谱(fluorescence spectrum)
使荧光效率提高；吸电子取代基，如－COOH、
NO2等使荧光减弱。
3. 荧光试剂
• 大部分化合物由于不吸收紫外光或荧光效率低 而不发生荧光或荧光很弱； • 为了提高荧光分析法的灵敏度、选择性，扩大 荧光分析的范围，研究了一类试剂，它们一些 化合物反应能生成强荧光性产物； • 常见的荧光试剂有：
– 荧光胺 能与脂肪胺或芳香胺生成强荧光物；
检测器
荧光分光光度计的结构示意图
I0
Il
F
溶液的荧光测定
• 激发光谱的测定 扫描激发单色器（发射单 色器固定在较长的波长）。 • 荧光光谱的测定 激发单色器固定在最大吸 收波长，扫描发射单色器。 • 定量分析条件的确定 最大激发波长和产生 的最大荧光波长（最灵敏的条件）。
二、荧光分析新技术
• 激光荧光分析 以激光作为光源，大大提高分析 的灵敏度和选择性； • 时间分辨荧光分析 利用不同物质的荧光寿命不 同，在激发和监测之间的延缓时间不同分别检测；
ex 205 nm em 278 nm 0.11
286 nm 321 nm 0.29
Байду номын сангаас
356 nm 404 nm 0.36

第三章 荧光分析法

第三章 荧光分析法
第3 章
荧光分析法
Analytical Chemistry 第3章 荧光分析法 章
第3章 荧光分析法
3.1 概述 3.2 基本原理 3.3 分子结构与荧光关系 3.4 环境因素对荧光强度的影响 3.5 定量分析方法 3.6 荧光分光光度计 3.7 应用
化学化工学院
Analytical Chemistry 第3章 荧光分析法 章
跨越后，荧光量子减弱，甚至会荧光熄灭。 跨越后，荧光量子减弱，甚至会荧光熄灭。
化学化工学院
Analytical Chemistry 第3章 荧光分析法 章
3.2 基本原理
一.分子荧光的发生过程 (5)磷光的产生： 磷光的产生： 磷光的产生 由第一电子激发态三线态的最低振动能级跃迁到基 态单线态任一振动能级发射的光量子为磷光。 态单线态任一振动能级发射的光量子为磷光。 磷光能量比荧光小，波长比荧光长 磷光能量比荧光小， 注： 磷光不干扰荧光的产生 体系间跨越 发磷光 ∴发射时间长（在三线态上逗留一段时间） 发射时间长（在三线态上逗留一段时间） 驰豫
Ft = F0e
− Kt
化学化工学院
Analytical Chemistry 第3章 荧光分析法 章
此时Ft （ ） 则上式为： 若t = τf , 此时 =（1/e）F0，则上式为：
F0 / e = F0 e
则K= 1/τf，将其带入 则得： 则得：
ln
− Kτ f
F0 t ln = Ft τ f
化学化工学院
Analytical Chemistry 第3章 荧光分析法 章
5.散射光的影响 散射光的影响 散射光： 散射光：光子与物质分子碰撞后使光传播的方向发生改变 而向不同角度散射。 而向不同角度散射。 瑞利光：发生弹性碰撞，无能量交换， 瑞利光：发生弹性碰撞，无能量交换，仅改变光子运动方 向的散射光。 向的散射光。 拉曼光：发生非弹性碰撞，有能量交换， 拉曼光：发生非弹性碰撞，有能量交换，改变光子运动方 向的散射光。 向的散射光。 散射光对荧光测定有干扰， 散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入射波长更长的 拉曼光，因其波长与荧光接近，干扰更大， 拉曼光，因其波长与荧光接近，干扰更大，必须采取措施消 除。

第三章 荧光分光光度法

第三章 荧光分光光度法

螯合物中金属离子的发光机理，通常是 螯合物首先通过配位体的*跃迁而被激 发，接着配位体把能量转移给金属离子，导 致d d*跃迁或f f*跃迁，最终发射的是 d*d跃迁或f*f跃迁光谱。
3.3 荧光分析的方法及影响因素 1. 荧光参数 （1）激发光谱和发射光谱 荧光的激发光谱和发射光谱是用荧光 法进行物质的定性、定量分析的基本参数 和依据。
b. 工作曲线法 先配制一系列不同浓度的标准溶液，分 别测定其荧光值，然后将减去试剂空白荧光 值的标准溶液荧光值与其相应浓度作图，即 得其工作曲线。 根据试液及试液空白荧光值，在此曲线 上即可找到试液的浓度。同时根据工作曲线 的线性情况，可以确定试液测定的最高浓度。
b. 分子的几何排布 物质的分子为平面型，且具有一定的刚 性结构，这样的分子荧光强烈。
对于顺反异构体，顺式分子的两个基团 在同一侧，由于位阻原因不能共平面，而没 有荧光。
c. 芳环上取代基的类型和位置 类型 • 有些取代基可增强荧光。如：-OH、-OR、 -NH2、-NHR、-NR2等；
•
有些取代基可减弱荧光。如：-COOH、 -C=O、-NO2、-Cl、-Br、-I等； 有些取代基影响不明显。如：-F、-SH、 -SO3H等。
不少有机化合物虽然具有共轭双键，但 由于不是刚性结构，分子处于非同一平面， 因而不发生荧光。
若这些有机化合物和金属离子形成螯合 物后，伴随着分子的刚性增强，平面结构增 大，常会发出荧光。
例如：8-羟基喹啉本身有很弱的荧光， 但其金属螯合物具有很强的荧光。这是由于 刚性和其平面性增加所致。
一般来说，能产生这类荧光的金属离子 具有硬酸型结构，如：Be2+、Mg2+、Al3+等。
•
位置 • 邻、对位取代，荧光增强；

《荧光分析法》课件

《荧光分析法》课件

通过改进技术手段，实现多组分的同步检 测，提高检测效率。
微型化与便携化
智能化与自动化
随着技术的进步，荧光分析仪器将更加微 型化和便携化，方便现场快速检测。
结合人工智能和自动化技术，实现荧光分 析的智能化和自动化，减少人为误差和操 作复杂度。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
成和含量。
荧光分析法的应用领域
环境监测
荧光分析法可以用于检测水体 、土壤和空气中的污染物，如
重金属、有机物和农药等。
生物医学研究
荧光分析法可以用于检测生物 体内的标记物、蛋白质、核酸 和细胞等，有助于生物医学研 究和诊断。
食品安全检测
荧光分析法可以用于检测食品 中的添加剂、农药残留和有害 物质等，保障食品安全。
高特异性
荧光分析法可以针对特定的化学物质 或生物分子，提供高度特异性的检测， 降低误报率。
可视化结果
荧光分析法的结果可以通过肉眼直接 观察或使用荧光显微镜进行观察，方 便快捷。
应用广泛
荧光分析法可以应用于多种领域，如 生物医学、环境监测、食品安全等。
荧光分析法的缺点
01
02
03
04
样品处理复杂
荧光分析法通常需要对待测样 品进行预处理，如提取、纯化
荧光寿命的测量
通过测量荧光物质在激发光停止后荧光强度随时间的变化，可以了解荧光物质从 激发态回到基态的速率常数和荧光寿命。
时间分辨荧光光谱的测量
通过测量不同时间点的荧光光谱，可以了解荧光物质在激发态的动态过程和能量 转移过程。
荧光量子产率的实验技术
荧光量子产率的测量
通过测量荧光物质在特定波长激发下的荧光发射光子数和激发光子数，可以计算出荧光量子产率，了 解荧光物质的光致发光效率。

荧光分析法基本原理和定量分析方法最新优质PPT课件

荧光分析法基本原理和定量分析方法最新优质PPT课件
瑞利光：光子和物质发生弹性碰撞，不发生能量交换，只 是光子运动方向发生改变。其波长与入射光波长相同。
拉曼光：√光子和物质发生弹性碰撞，发生能量交换，光子 把部分能量转移给物质分子或从物质分子获得部分能量。从 而发射出比入射光稍长或稍短的光。
散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入射光波长更长
的拉曼光，与荧光波长接近，对测定的干扰大，必须采取
波士顿大学和伍兹霍尔海洋生物 大的癌症肿瘤、跟踪阿尔茨海默氏症
实验所工作。他1962年从一种 对大脑造成的损害、观察有害细菌的
水母中发现了荧光蛋白，被誉为 生长，或是探究老鼠胚胎中的胰腺如
生物发光研究第一人。
何产生分泌胰岛素的β细胞。
·沙尔菲马丁·沙尔菲出生于194761岁，是美国哥伦比亚大学生物学 教授。他获奖的主要贡献在于向人们展示了绿色荧光蛋白作为发 光的遗传标签的作用，这一技术被广泛运用于生理学和医学等领 域。
磷光光谱
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
激发光谱与发射光谱的关系√
a. Stokes位移 荧光光谱总是位于物质激发光谱的长波一侧，即荧光波
长大于激发光波长的现象。 激发光谱与发射光谱之间的波长差值： 振动弛豫、外转换等无辐射跃迁损失了部分能量。
26
2.温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，分子运动速度加
快，分子间碰撞的几率增加，外转换去活的几率增加，荧光 效率降低。例如荧光素钠的乙醇溶液，在0℃以下，温度每降 低10℃，? f增加3％，在?80℃时， ? f为1。
27
3. 溶液pH
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制； 当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的pH值对该荧光物质的 荧光强度有较大影响，这主要是因为在不同酸度中分子和离子间的 平衡改变，离子结构发生变化，因此荧光强度也有差异。每一种荧 光物质都有它最适宜的发射荧光的存在形式，也就是有它最适宜的 pH值范围。例如苯胺在不同pH值下有下列平衡关系：

仪器分析各个章节小结

仪器分析各个章节小结

仪器分析各个章节小结仪器分析是对于物质进行定性、定量和结构分析的一种方法。

它是近几十年来发展迅猛的一门科学，已经成为当代化学、生物学、药学和地球科学等各类研究工作中不可缺少的分析技术。

在仪器分析课程中，涵盖了许多章节，如下。

第一章：分光光度法分光光度法是利用物质对光的吸收作用来分析物质的一种方法。

该方法是一种非常常用、快速准确的分析方法，可以用于测定有机和无机物质，例如测量肝素、胆固醇、蛋白质、染料、金属离子等的浓度。

分光光度法的测定方法有单波长法、多波长法和倒置分光光度法等。

单波长法测定速度快，但多波长法测定的结果更加准确。

第二章：原子吸收光谱法原子吸收光谱法利用物质吸收特定波长的光来分析物质的成分和浓度，这种方法是一种分析化学的经典技术。

原子吸收光谱法的主要优势是其选择性、准确性和精确程度都比较高。

原子吸收光谱法的应用范围广泛，可以用于测定钠、钾、镁、铜、铅、锌等元素的含量。

第三章：荧光分析法荧光分析法是利用物质对光的荧光特性来分析物质的一种方法。

这种方法对于非常微小的样本也具有极高的灵敏度，可以用于检测基于荧光信号的分子诊断，荧光标记的细胞和生物分子等。

在荧光分析法的范畴中，有几种不同的方法，包括比色融合法、固相光谱法和时间分辨荧光光谱法等。

每种方法都有其独特的应用领域和优劣点。

第四章：分析色谱法分析色谱法是一种广泛应用于分析化学、生物化学和环境科学中的方法。

该方法是通过将样品通过色谱柱来分离各种成分，再用检测器来检测成分的浓度来进行分析。

分析色谱法包括气相色谱法、液相色谱法和毛细管电泳法等。

它们的使用范围广泛，涉及到生物和药物的分析、环境监测等方面。

第五章：电化学分析法电化学分析方法是利用电化学反应的原理进行定量分析的方法。

在电化学分析领域中，包括电位滴定法、极谱法和循环伏安法等多种方法。

电化学分析法的优点在于对物质进行非常精确的定量分析，对样品的形状和大小没有要求。

这种方法可以应用于分析化学、电化学和材料科学中的很多方面。

第3章 荧光分析法

第3章 荧光分析法
11
3.1.2 激发光谱与荧光(磷光)光谱 激发光谱与荧光(磷光)
任何荧光（磷光） 1、任何荧光（磷光）化合物都具有两个特 征光谱：激发光谱和发射光谱。 征光谱：激发光谱和发射光谱。 激发光谱：以激发光波长为横坐标， 激发光谱 ： 以激发光波长为横坐标 ， 荧光 磷光）强度为纵坐标作图， （ 磷光 ） 强度为纵坐标作图 ， 即得到荧光 磷光）化合物的激发光谱。 曲线I （磷光）化合物的激发光谱。（曲线I） 发射光谱： 发射光谱 ： 将激发光波长固定在最大激发 波长处，然后扫描发射波长， 波长处 ， 然后扫描发射波长 ， 测定不同发 射波长处的荧（ 光强度，即得到荧（ 射波长处的荧 （ 磷 ） 光强度 ， 即得到荧 （ 光发射光谱。 磷）光发射光谱。
荧光猝灭：荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子
的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭。 的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭。 荧光猝灭的形式很多，主要的类型包括: 荧光猝灭的形式很多，主要的类型包括: 碰撞猝灭、静态猝灭、转入三重态的猝灭、 碰撞猝灭、静态猝灭、转入三重态的猝灭、发生电荷转 移反应的猝灭、荧光物质的自猝灭等。 移反应的猝灭、荧光物质的自猝灭等。
16
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200
250
300
350
400
450
蒽的激发光谱和荧光光谱
500 nm
17
3.1.3 荧光的产生与分子结构的关系
1. 分子产生荧光必须具备的条件 （1）具有合适的结构； ）具有合适的结构； （2）具有一定的荧光量子产率。 ）具有一定的荧光量子产率。 荧光量子产率（ 荧光量子产率（ϕ）：荧光物质发射光子数与吸收激 发光子数之比（当非辐射跃迁A返回基态的概率很小 发光子数之比（当非辐射跃迁 返回基态的概率很小 接近于1，在通常情况下， 总是小于1的 时， ϕ接近于 ，在通常情况下， ϕ总是小于 的）

现代生物仪器分析第三章 分子荧光光谱法

现代生物仪器分析第三章 分子荧光光谱法

第二节 荧光分析的原理
（一）荧光发生机理 物质的基态分子受一激发光源的照射， 被激发至激发态，在返回基态时，产生 波长与入射光相同或较长的荧光。 通过测定物质分子产生的荧光强度进行
分 析 的 方 法 称 为 荧 光 分 析 (fluorescence analysis)。
1、分子的激发态

荧光和磷光这两种光致发光过程的机理不同， 可从实验观察激发态分子寿命的长短来加以区 别： 对于荧光来说，当激发光停止照射后，发光 过程几乎立即停止（在10-9～10-6秒，荧光寿 命fluorescence life time ）。 磷光则将持续一段时间（在10-3～10秒）。
荧光分析法发展简史
2、分子荧光和磷光的产生


分子在室温时基本上处于电子能级的基态。当吸 收了紫外—可见光后，基态分子中的电子只能跃 迁到激发单线态的各个不同振动—转动能级，根 据自旋禁阻规律，不能直接跃迁到激发三重态的 各个振--转能级。 处于激发态的分子是不稳定的，它可能通过辐射 跃迁和无辐射跃迁等分子内的去活化过程释放多 余的能量而返回至基态，发射荧光是其中的一条 途径。


世界上第一次记录荧光现象是16世纪 西班牙的内科医生和植物学家 N.Monardes。 1575年他提出在含有一种木头切片的 水溶液中，可观察到极可爱的天蓝色。
1852年，stokes在考察奎宁和叶绿素的 荧光时，用分光光度计观察到其荧光的 波长比入射光的波长稍微长些，从而导 入了荧光是光发射的概念。 18工作。应用铝—桑色素配 合物的荧光进行铝的测定。 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行 的，直到1928年，才由Jette和West完成 了第一台荧光计。
激发单重态与激发三重态的性质不同

荧光分析法

荧光分析法
段时间，然后返回至基态的各个能级而发出光辐射，这种光辐射称为~ 磷光的波长比荧光的波长要长 发射磷光比发射荧光更迟一些，原因是分子在激发三线态的寿命较长 由于荧光物质分子与溶剂分子间相互碰撞等因素的影响，处于三线态的分子常常通过无辐射过程转移至基态，因此在 室温下溶液很少呈现磷光，必须采用液氦在冷冻条件下才能检测到磷光。因此磷光法不如荧光法应用普遍
能级 2 荧光光谱的形状与激发波长无关
分子的电子吸收光谱可能含有几个吸收带，但其荧光光谱却只有一个发射带 荧光发射通常发生于第一电子激发态的最低振动能级，而与激发至哪一个电子激发态无关，所以荧光光谱的形状通 常与激发波长无关 3 荧光光谱与激发光谱的镜像关系
三、分子结构与荧光的关系
物质的分子结构与荧光的发生及荧光强度密切相关
（一）荧光寿命与荧光效率
荧光寿命和荧光效率是荧光物质的重要发光参数
荧光寿命：分子的荧光强度降低到激发光量子产率）：指激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比，常用ψf
来表示
发射荧光的光子数
射于检测器上，通过发射单色器扫描以检测各种波长下相应的荧光强度，然后记录荧光强度（F）对发射 波长（λex）的关系曲线，所得到的图谱称为~ 荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度 激发光谱和荧光光谱可用来鉴别荧光物质，并作为进行荧光测定时选择适当波长的依据 溶液荧光光谱通常具有如下特征： 1 斯托克斯位移 斯托克斯位移：在溶液荧光光谱中，所观察到的荧光波长总是大于激发光波长 斯托克斯位移说明了在激发与发射之间存在着一定的能量损失 产生斯托克斯位移的主要原因：激发态分子通过内转化和振动弛豫过程而迅速到达第一激发单线态 S1*的最低振动
荧光分析法
第一节 概述
光致发光：有些物质收到光的照射时，除吸收某种波长的光之外，还会发射出波长相同或比吸收波长更长的光，这种 现象称为~

荧光分析法检测原理及应用举例

荧光分析法检测原理及应用举例

荧光分析法检测原理及应用举例荧光分析法是一种常用的分析方法，根据样品在受到激发光后所发射出的荧光信号来进行分析。

荧光分析法具有灵敏度高、选择性好、分析快速等优点，适用于各种领域的分析和检测。

本文将详细介绍荧光分析法的检测原理，并给出几个应用举例。

荧光分析法的原理主要包括荧光激发和荧光发射两个过程。

在荧光激发过程中，样品受到吸收光束的照射后，其中的一些分子受到激发，处于高激发能级。

在随后的荧光发射过程中，这些激发分子会从高激发能级跃迁到低激发能级，释放出能量的同时发出特定波长的荧光光谱。

通过测量样品发出的荧光光谱，可以确定样品的成分以及其含量。

以下是几个荧光分析法的应用举例：1.荧光酶标技术：荧光酶标技术是生物荧光分析法中的一种重要应用。

通过将荧光标记在特定的抗体、蛋白质或核酸上，可以实现对患者样品中特定生物分子的检测。

例如，在临床诊断领域中，可以利用荧光酶标技术检测病原体的存在，并通过荧光信号的强弱来确定病菌的数量。

2.荧光染料的分析：荧光染料广泛应用于材料科学、生命科学等领域中的分析和检测。

例如，在环境监测中，可以使用荧光染料来检测水体或土壤中的有害物质，如重金属离子、有机污染物等。

荧光染料在分析过程中的发光特性可以提供非常灵敏和选择性的检测结果。

3.荧光显微镜技术：荧光显微镜技术是生命科学研究中常用的一种技术手段。

通过给样品标记荧光探针，可以在显微镜下观察样品的荧光信号来研究细胞结构、蛋白质相互作用等生物过程。

荧光显微镜技术还可以用于检测细菌感染、癌细胞等疾病的诊断和研究。

4.荧光透射谱分析：荧光透射谱分析是一种常用的荧光分析技术，可以用于分析各种化合物的组成和浓度。

例如，在食品安全领域，可以通过荧光透射谱分析来检测食品中的有害添加物，如亚硝酸盐、农药残留等。

通过测量样品在特定波长下的荧光强度，可以快速、准确地确定样品中有害物质的含量。

除了以上几个应用举例外，荧光分析法还可以用于环境监测、药物研发、生物学研究等领域。

荧光分析法

荧光分析法

荧光 分子光谱 发射光谱 10-8~10-10g/ml
高
可见紫外 分子光谱 吸收光谱 10-5~10-7g/ml
一般
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11.2 根本原理
11.2.1 分子荧光光谱的产生 11.2.2 激发光谱与发射光谱 11.2.3 分子构造与荧光的关系 11.2.4 影响荧光强度的外部因素
11.2.1 分子荧光光谱的产生
荧光强度F，以F-λex作图得荧光物质的激发光谱。 发射光谱：〔荧光光谱〕固定激发光波长λex，依次改变发射
波长λem，测荧光强度F，以F-λem作图得荧光光谱。
➢激发光谱与荧光光谱上的λmax是定性定量的根据
1. 荧光光谱的特点〔重点〕
〔1〕斯托克斯位移：荧光发射波长总是大于激发波长。 原因：无辐射跃迁能量损失，包括振动弛豫和内部能量转换
续前
〔3〕荧光光电计与荧光分光光度计的比较
激发光源 激发单色器 发射单色器
检测器
样品池
光电荧光计 荧光分光光度计
汞灯
氙灯
第一滤光片
光栅
第二滤光片
光栅
光电倍增管
石英、玻璃池（低荧光的玻璃）
返回
小结： 掌握
根本概念：荧光、振动弛豫、内部能量转换、 外部能量转换、体系间跨越及磷光；激发光谱 与荧光光谱
发射波长
激发波长
激发光谱(excitation spectrum)： F~ ex 荧光光谱(fluorescence spectrum)： F~ em
激发光〔谱二：〕〔与激吸发收光光谱谱类与似荧〕表光示光不谱同激发波长的辐射引起
物质发射某一波长荧光所得的光谱。 方法：固定发射光波长λem，依次改变激发波长λex，测
特点：发生在非常靠近的两个电子能级间，他们的振动能级有 重叠；时间约10-1～10-13秒。
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图3.1 荧光和磷光体系能级图
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内转换 相同多重度等能态间的一种无辐射跃迁过程称为 相同多重度等能态间的一种无辐射跃迁过程称为 无辐射 内转换. 内转换. 当两个相同多重度电子能级的振动能层间有重叠 时,则可能发生电子由高能层电子激发态以无辐 射跃迁方式跃迁到低能层的电子激发态. 射跃迁方式跃迁到低能层的电子激发态.如由 S2 → S1 ,T2 → T1 . 时间10-13-10-11s 时间10 分子最初无论在哪一个激发单重态, 分子最初无论在哪一个激发单重态,都能通过振 动弛豫和内转换到达最低激发单重态(或三重态) 动弛豫和内转换到达最低激发单重态(或三重态) 的最低振动能层上. 的最低振动能层上.
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图3.1 荧光和磷光体系能级图
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系间跨越 不同多重度状态间的一种无辐射跃迁过程称为系间 不同多重度状态间的一种无辐射跃迁过程称为系间 无辐射跃迁过程称为 跨越. 跨越. 它涉及受激电子自旋状态的改变. 它涉及受激电子自旋状态的改变.如S1→ T1,使原 来两个自旋配对的电子不再配对, 来两个自旋配对的电子不再配对,这种跃迁一般是 禁阻的. 禁阻的. 但如果两个不同多重度电子能态的振动能层有 较大的重叠时则可能通过自旋—轨道耦合等作用使 较大的重叠时则可能通过自旋 轨道耦合等作用使 其实现. 其实现.
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振动驰豫 当分子吸收光辐射后可能从基态的最低振动能层 =0)跃迁到激发态 跃迁到激发态S =i)的较高的振动能层 S0(ν=0)跃迁到激发态Sn(ν=i)的较高的振动能层 上去.然而在液相或压力足够高的气相中, 上去.然而在液相或压力足够高的气相中,分子间 碰撞的几率很大, 碰撞的几率很大,激发态分子可能将过剩的振动能 量以热的形式传递给周围的分子,而自身从S 量以热的形式传递给周围的分子,而自身从Sn或Tn 的高振动能层( =i)失活到该电子能级的最低振动 的高振动能层(ν=i)失活到该电子能级的最低振动 能层( =0)上 这一过程称为振动弛豫 振动弛豫( 能层(ν=0)上,这一过程称为振动弛豫(振动松 弛). 时间10 时间10-12s 即各振动能级间的小箭头. Sn或Tn的νi→ ν0 ,即各振动能级间的小箭头.
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3.分子去活化 分子去活化 处在激发态的分子是不稳定的, 处在激发态的分子是不稳定的,它可能通过辐射跃迁和 非辐射跃迁等去活化过程返回基态,其中以速度最快, 非辐射跃迁等去活化过程返回基态,其中以速度最快,激发 态寿命最短的途径占优势.有以下几种基本的去活化过程. 态寿命最短的途径占优势.有以下几种基本的去活化过程. 振动驰豫 内转换 荧光发射 系间跨越 磷光发射 外转换
光致发光
物质因吸收光能而激发发光的现象. 物质因吸收光能而激发发光的现象.
荧光
当紫外光照射到某些物质的时候,这些物质会发射出 当紫外光照射到某些物质的时候, 各种颜色和不同强度的可见光,而当紫外线停止照射时, 各种颜色和不同强度的可见光,而当紫外线停止照射时, 所发射的光线也随之很快地消失,这种光线——荧光. 荧光. 所发射的光线也随之很快地消失,这种光线 荧光
激发光谱
选择:荧光和磷光都是光致发光,因此必须选择合适 选择:荧光和磷光都是光致发光, 的激发光波长,这可从它们的激发光谱曲线来确定. 激发光谱曲线来确定 的激发光波长,这可从它们的激发光谱曲线来确定. 绘制:固定测量波长(选荧光/磷光的最大发射波 绘制:固定测量波长(选荧光/ ),改变激发光的波长 测量荧光强度的变化, 改变激发光的波长, 长),改变激发光的波长,测量荧光强度的变化,以 激发光波长为横坐标,荧光强度为纵坐标作图, 激发光波长为横坐标,荧光强度为纵坐标作图,即得 到荧光(磷光)化合物的激发光谱. 到荧光(磷光)化合物的激发光谱.
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图3.1 荧光和磷光体系能级图
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磷光发射 当从单重态到三重态的分子系间跨越跃迁发生后, 当从单重态到三重态的分子系间跨越跃迁发生后, 接着发生快速的振动弛豫而到达三重态的最低振动 能层上,当没有其他过程同它竞争时, 能层上,当没有其他过程同它竞争时,分子将发生 磷光跃迁回基态,这一过程称为磷光发射. 磷光跃迁回基态,这一过程称为磷光发射. 跃迁回基态 磷光发射 荧光与磷光的根本区别是 荧光与磷光的根本区别是: 根本区别 荧光:由激发单重态 单重态最低振动能层至基态各振动能 荧光:由激发单重态最低振动能层至基态各振动能 层的跃迁产生. 层的跃迁产生. 磷光:由激发三重态 三重态最低振动能层至基态各振动能 磷光:由激发三重态最低振动能层至基态各振动能 层的跃迁产生的. 层的跃迁产生的. E荧>E磷,λ荧<λ磷 时间10 时间10-4-10s
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图3.1 荧光和磷光体系能级图
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荧光发射 当分子处于单重激发态的最低振动能级S =0)时 当分子处于单重激发态的最低振动能级S1(ν=0)时, 单重激发态的最低振动能级 发射一个光子返回基态S 光子返回基态 发射一个光子返回基态S0(ν=i) ,这一过程称为 荧光发射. 荧光发射. 由于溶液中振动弛豫效率很高, 由于溶液中振动弛豫效率很高,它在荧光发射之前 和发射之后都可能发生. 和发射之后都可能发生.因此发射荧光的能量比分 子所吸收的能量要小, 子所吸收的能量要小,即荧光的特征波长比它所吸 收的特征波长要长. 收的特征波长要长. 时间10 时间10-9-10-7s 荧光多为S 跃迁. 荧光多为S1→ S0 跃迁.
图3.1 荧光和磷光体系能级图
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2.电子激发多重度 M 电子激发多重度数和,数值为0 s: 电子自旋量子数代数和,数值为0或1.
单重态 分子轨道中的电子都是自旋配对的,自旋方向相反. 分子轨道中的电子都是自旋配对的,自旋方向相反. s=0,M=1 s=0, 用符号S 用符号S表示 三重态 电子跃迁过程中伴有自旋方向的改变 s=1,M=3 s=1, 用符号T 用符号T表示
荧光分析已成为一种十分重要且有效的光 谱分析手段
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§3-2 荧光分析基本原理
一,荧光和磷光的产生
发光
室温下,大多数分子处在基态的最低振动能层. 室温下,大多数分子处在基态的最低振动能层. 处于基态的分子吸收能量(电能,热能, 处于基态的分子吸收能量(电能,热能,化学能或 光能等)后被激发,跃迁到激发态,激发态不稳定, 光能等)后被激发,跃迁到激发态,激发态不稳定, 分子将很快衰变到基态. 分子将很快衰变到基态.若返回到基态时伴随着光 子的辐射,这种现象称为"发光" 子的辐射,这种现象称为"发光".
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仪器: 仪器:
19世纪前,荧光观察靠肉眼. 19世纪前 荧光观察靠肉眼. 世纪前, 1928年,哲蒂(Jette)和维斯特(West)研制出第 1928年 哲蒂(Jette)和维斯特(West) (Jette)和维斯特(West)研制出第 一台光电荧光计. 一台光电荧光计. 如今,已有各式各样新型的荧光分析仪问世. 如今,已有各式各样新型的荧光分析仪问世.
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1867年,瑞士,高贝尔斯莱德(F.Goppelsr der)进行 1867年 瑞士,高贝尔斯莱德(F.Goppelsr der)进行 (F.Goppelsrder) 了首次的荧光分析工作,应用铝了首次的荧光分析工作,应用铝-桑色素配合物的荧光 进行铝的测定. 进行铝的测定. 1880年,莱伯曼(Liebeman)提出了最早关于荧光与化 1880年 莱伯曼(Liebeman)提出了最早关于荧光与化 (Liebeman) 学结构关系的经验法则. 学结构关系的经验法则. 19世纪末,人们已经知道了600种以上的荧光化合物. 19世纪末 人们已经知道了600种以上的荧光化合物. 世纪末, 600种以上的荧光化合物 20世纪以来,荧光现象的研究就更多了: 20世纪以来,荧光现象的研究就更多了: 世纪以来 1905年,伍德(Wood)发现共振荧光. 1905年 伍德(Wood)发现共振荧光. (Wood)发现共振荧光 1914年,弗兰克(Frank)和赫兹(Hertz)利用电子冲击 1914年 弗兰克(Frank)和赫兹(Hertz) (Frank)和赫兹(Hertz)利用电子冲击 发光进行定量研究. 发光进行定量研究. 1922年,Wawillous 进行荧光产率的绝对测定. 1922年 Waw 进行荧光产率的绝对测定. 1926年,盖维奥拉(Gaviola) 进行了荧光寿命的直接 1926年 盖维奥拉(Gaviola) 测定. 测定. ……
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◆
原理: 原理: 1.分子能级 分子能级
每个分子具有一系列 严格分立的能级,称为电 严格分立的能级, 子能级, 子能级,而每个电子能级 中又包含一系列的振动能 层和转动能层. 层和转动能层. So:基态 S1:第一电子激发单重态 S2:第二电子激发单重态 T1:第一电子激发三重态 T2:第二电子激发三重态 =0,1,2,3…振动能层 ν=0,1,2,3 振动能层
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图3.1 荧光和磷光体系能级图
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二,激发光谱和发射光谱
任何荧光(磷光)化合物都具有两个特征光谱: 任何荧光(磷光)化合物都具有两个特征光谱:激发 特征光谱 光谱和发射光谱.它们是荧光(磷光) 光谱和发射光谱.它们是荧光(磷光)定性和定量分析的 基本参数和依据. 基本参数和依据.
第三章
荧光分析法
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目录
§ 3-1 § 3-2 § 3-3 § 3-4 概述 荧光分析基本原理 荧光分析仪器 荧光分析方法及应用
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§3-1 概述