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第四章 酶的分子修饰

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酶工程电子教案第四章酶分子修饰教学目标：◆通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。

◆通过酶分子修饰，可以使酶分子结构发生某些改变，就有可能提高酶的活力，增强酶的稳定性，降低或消除酶的抗原性等。

◆通过酶分子修饰，研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响，可以进一步探讨其结构与功能之间的关系。

◆酶分子修饰主要包括金属离子置换修饰, 大分子结合修饰，侧链基团修饰，肽链有限水解修饰，核苷酸链有限水解修饰，氨基酸置换修饰，核苷酸置换修饰和酶分子的物理修饰等。

教学重点和难点大分子结合修饰的原理和方法；酶分子的定向进化。

教学方法教师讲授为主，结合一次上机实验，加深学生对酶分子结构与功能关系的认识，以及对酶分子修饰方法的掌握。

核酶的内容自学。

1、金属离子置换修饰◆把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。

◆有些酶分子中含有金属离子，而且往往是酶活性中心的组成部分，对酶催化功能的发挥有重要作用。

α-淀粉酶中的钙离子（Ca2+）谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+)过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)酰基氨基酸酶分子中的锌离子（Zn2+）超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+,Zn2+)等。

◆若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。

◆若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。

1.1金属离子置换修饰的方法：◆金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。

◆金属离子置换修饰的过程主要包括如下步骤：(1)酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。

(2)除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。

(3) 加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。

《酶分子的修饰》课件

《酶分子的修饰》课件
糖基化修饰通常发生在酶的特定氨基酸残基上，形成N-连 接或O-连接的糖链。糖基化修饰在多种生物学过程中发挥 重要作用，如蛋白质分选和分泌。
酶的甲基化修饰
甲基化修饰是指将甲基基团加到酶分子上的过程，通常由甲基转移酶催化。甲基 化修饰可以改变酶的活性、稳定性、定位和与其他分子的相互作用。
甲基化修饰常见于DNA、RNA和蛋白质中。在蛋白质甲基化过程中，甲基转移 酶将甲基基团加到蛋白质特定氨基酸残基上，影响蛋白质功能和稳定性。
酶分子修饰与疾病发生发展
酶分子修饰与多种疾病的发生 和发展密切相关，如肿瘤、神 经退行性疾病、心血管疾病等
。
酶分子修饰可以影响细胞代 谢、细胞周期、细胞凋亡等 生物学过程，从而影响疾病
的发展进程。
深入了解酶分子修饰在疾病发 生发展中的作用，有助于发现 新的治疗靶点，为疾病治疗提
供新的策略和方法。
酶分子修饰与药物研发
酶分子修饰是药物研发的重要靶点之一，通过调节酶的活性可以设计出具有特定治 疗作用的药物。
酶分子修饰在药物研发中具有广阔的应用前景，如开发新药、优化现有药物的治疗 效果等。
药物研发过程中需要深入研究酶分子修饰的机制和作用，以确保药物的安全性和有 效性。
04 酶分子修饰的研究方法
蛋白质组学技术
蛋白质谱分析
肿瘤治疗
利用酶分子修饰技术，可 以设计出针对肿瘤细胞特 异性的治疗策略，实现肿 瘤的精准治疗。
免疫调节
酶分子修饰可以用于调节 免疫细胞的活性，为免疫 相关疾病的治疗提供新的 思路。
酶分子修饰在农业生产中的应用
抗虫抗病
通过酶分子修饰技术，可以培育 出具有抗虫抗病性能的农作物新 品种，提高农作物的产量和品质 。
《酶分子的修饰》 PPT课件

第四章 酶蛋白的化学修饰

第四章 酶蛋白的化学修饰

（二）酶蛋白功能基团的超反应性
超反应性指的是蛋白质的某个侧链基团与 个别试剂能发生非常迅速反应的能力。
蛋白质中的功能基与简单氨基酸中的相同基团相 比，反应性要差。
但是,每个蛋白质分子中至少有一个基团对一定 的试剂显示出超反应性。超反应基团不一定是酶 活性部位上的基团。
影响超反应性的因素：
①改变蛋白质功能基团的pK值； ②蛋白质功能基团具有较大的亲核性； ③通过静电相互作用吸引试剂，并使其有适当取向； ④试剂与靠近修饰部位的蛋白质区域之间的立体化学
②意义：
A.天然酶的活性维持存在缺陷；（如：异体蛋白 的抗原性、易受蛋白酶水解、抑制剂抑制、活性 半衰期短）
B.天然酶的使用性能存在缺陷；（如： 酶蛋白抗酸、碱、有机溶剂变性及抗热 失活能力差，容易受产物抑制）
C.天然酶的应用存在潜力。（如：通过 酶的分子改造可提高酶的稳定性、解除 酶的抗原性、改变酶学性质(最适pH、最 适温度、Km值、催化活性和专一性等)、 扩大酶的应用范围）
四、酶蛋白修饰的方法
（1）酶分子的表面修饰： 1）化学固定：酶与惰性载体共价固定
（即共价固定化酶）；
2）小分子修饰：用化学小分子修饰酶的 表面基团；（如：对酶分子的侧链基团， 尤其酶活性中心的必需基团进行化学修 饰）
3）大分子修饰
非共价修饰:与大分子物质非共价结合，增加酶的稳定性; 共价修饰:用可溶性大分子共价连接于酶分子表面，形成覆盖
3、酶修饰途径
（1）分子生物学水平，即用基因工程方法对DNA 或RNA进行分子改造，以获得化学结构更为合理的 酶蛋白（蛋白质工程）。 （2）对天然酶分子进行改造，这包括一级结构中 氨基酸置换、肽链切割、氨基酸侧链修饰等（选择 性化学修饰）。
三． 酶化学修饰的基本原理

第四章：酶分子修饰

第四章：酶分子修饰

（6）分子结合修饰
定义 分子结合修饰：采用水溶性分子，与酶蛋白的侧 分子结合修饰：采用水溶性分子，与酶蛋白的侧 链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变， 从而改变酶的特性与功能的方法。 大分子结合修饰：对酶蛋白侧链基团的修饰反应 大分子结合修饰：对酶蛋白侧链基团的修饰反应 不仅可以使用小分子物质，也可使用大分子物质。 其中利用水溶性大分子与酶分子的侧链基团共价 结合，使酶分子的空间结构发生某些精细的改变， 从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结合 修饰法。
(1)肽链的水解引起酶活性中心的破坏，酶将丧失其 肽链的水解引起酶活性中心的破坏， 催化功能。 催化功能。 (2)肽链的一部分被水解后，仍然可以维持酶活性中 肽链的一部分被水解后， 心的空间构象， 心的空间构象，则酶的催化功能仍可以保持不变或 损失不多，但是其抗原性等特性将发生改变。 损失不多，但是其抗原性等特性将发生改变。这将 提高某些酶特别是药用酶的使用价值。 提高某些酶特别是药用酶的使用价值。 (3)肽链的一部分水解除去以后，有利于酶活性中心 肽链的一部分水解除去以后， 与底物的结合并且形成准确的催化部位， 与底物的结合并且形成准确的催化部位，则酶可显 示出其催化功能或使酶活性提高。 示出其催化功能或使酶活性提高。
+
O2N OOC S S NO2 COO
ENZ
SH
pH﹥ 6.8
DTNB
NO2 COO
ENZ
S S
+
S
NO2
+
COO
H+
（5）分子内交联修饰
定义：利用含有双功能基团的化合物， 与酶分子中两个侧链基团反应，形成共 价交联，可使酶分子的空间构象更为稳 定，提高酶的稳定性。 修饰剂：二氨基丁烷，戊二醛，己二胺 用途：在蛋白和酶的结构与功能的基础 研究，酶的催化机制等酶学研究方面有 重要作用。

Chapter 4 酶分子修饰与应用

Chapter 4 酶分子修饰与应用

第四章酶分子修饰与应用1 酶分子修饰(Modification of Enzyme Molecule)：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的过程。

2 酶分子修饰的意义？（1）提高酶的活力；（2）增强酶的稳定性；（3）降低或消除酶的抗原性；（4）研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响，进一步探讨酶分子的结构与功能之间的关系。

第一节酶分子的主链修饰1 酶分子的主链修饰：利用酶分子主链（肽链或核苷酸链）的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。

2 酶分子主链修饰的意义？（1）可提高酶的活力；（2）可降低或消除酶的抗原性；（3）可预测酶活性中心在主链上的位置，从而了解主链的不同位置对酶的催化功能的贡献。

（一）主链的切断修饰①主链断裂后，引起酶活性中心的破坏，酶的催化功能丧失（用于探测酶活性中心的位置）。

②主链断裂后，酶活性中心的空间构象维持不变，酶的催化功能也可以保持不变或损失不多，但是抗原性有发生改变。

这样可以提高药用酶的使用价值。

③主链断裂有利于酶活性中心的形成，则可使酶分子显示其催化功能或使酶活力提高。

（二）主链的连接修饰将两种或者两种以上的酶通过主链连接在一起，形成一个酶分子具有两种或者多种催化活性的修饰方法称为酶的主链连接修饰。

在一个酶分子上具有两种或多种催化活性的酶称为多酶融合体。

通过基因融合技术将两种或两种以上的酶的基因融合在一起形成融合基因，再经过克隆和表达，有可能获得各种多酶融合体。

第二节酶的侧链基团修饰采用一定的方法使酶的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法称为侧链基团修饰。

酶的侧链基团的意义：（1）可以研究各种基团在酶分子中的作用，并可以用于研究酶的活性中心中的必需基团。

如果某基团修饰后不引起酶活力的显著变化，则可以认为此基团属于非必需基团；如果某基团修饰后使酶活力显著降低或丧失，则此基团很可能是酶催化的必需基团。

酶的分子修饰

酶的分子修饰

DENATURATION 93°C - 95°C
EXTENSION 72°C
酶的分子修饰
优点： ✓抗体制备简单
任何一种酶都有它相对应的抗体，制备亦较简 单、迅速。所以，用抗体稳定酶的方法较普遍。
酶的分子修饰
缺点： ✓制备抗体花费较多，解决的办法是用微生物来生产。最 近报告表明，已经成功地由大肠杆菌生产具有完整功能 的重组抗体片段，而且用同一种微生物既能生产目的蛋 白又生产其抗体的可能性。 ✓在医学上要解决酶—抗体复合物在体内的抗原性。目前 采用降低抗体分子的大小制造嵌合抗体
酶的分子修饰
2.1.酶辅因子的置换修饰 通过改变酶分子中的辅因子，使酶的特性和功能
发生改变，主要是金属离子的置换，因此该方法又称 为离子置换法。
主要是二价离子的置换修饰
酶的分子修饰
置换修饰过程 酶液中加入Eபைடு நூலகம்TA
置换修饰酶
透析或超滤 加入金属离子
酶的分子修饰
置换修饰的要点 等价同荷置换
酶的分子修饰
酶的分子修饰
生物体中存在的酶分子修饰
❖酶原激活 ❖共价修饰
酶的分子修饰
酶原激活
Proteolytic Zymogen Activation.
酶的分子修饰
共价修饰
酶分子中的某些基团在其他酶的催化下，可共价结合或脱去， 引起酶分子构象改变而调节其活性，此类酶称为共价修饰调 节酶。
酶的分子修饰
酶的共价修饰方式
能与酶非共价地相互作用而有效地保护酶，既能通 过氢键固定在酶分子表面，也能通氢键有效地与外 部水相连，通过调节酶的微环境，保护酶的活力。 有些来自嗜热菌的酶具有较高稳定性，其原因正是 由于保护性大分子(如肽和聚胺)发挥作用的结果。

酶分子修饰精选


突变方法 易错PCR DNA改组 盒式诱变 易错PCR/DNA改组 盒式诱变 DNA改组 DNA改组 易错PCR/DNA改组 随机/定位诱变 DNA改组
4.7 酶分子修饰的应用（P152-157） ➢ 在酶学研究方面的应用 ➢ 在医药方面的应用 ➢ 在工业方面的应用 ➢ 在抗体酶研究开发方面的应用 ➢ 在核酸类酶人工改造方面的应用 ➢ 在有机介质酶催化反应中的应用
修饰中的应用。 6、酶分子的物理修饰有何特点？ 7、何谓酶定向进化？有何特点？ 8、简述突变基因定向选择的基本过程。 9、举例说明酶定向进化技术的应用。
•44
4.7 酶分子修饰的应用（P152-157） 1、在酶学研究方面的应用 酶活性中心的研究 酶的空间结构研究 酶的作用机制研究
4.7 酶分子修饰的应用（P152-157） 2、在医药方面的应用 降低或者消除酶的抗原性 增强医药用酶的稳定性（半衰期）
4.7 酶分子修饰的应用（P152-157） 3、在工业方面的应用 提高工业用酶的催化效率 提高工业用酶的稳定性 改变酶的动力学特性
苯乙二醛，1,2－环己二酮、丁二酮
Cys（半胱） 巯基 碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺
二硫键 巯基乙醇、DTT（二硫苏糖醇）
His（组） 咪唑基 焦碳酸二乙酯、碘乙酸
Tyr（酪） 酚羟基 碘、四硝基甲烷
Trp（色） 吲哚基 N-溴代琥珀酰亚胺
4. 酶蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰） ➢ 利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学
4.6 酶的定向进化
➢ 定向进化：模拟自然进化的过程，进行人工随 机突变，并在特定的环境条件下进行选择，使 进化朝着人们所需方向发展的技术过程。
分子定向进化 定向进化
细胞定向进化

4酶分子化学修饰2


8）吲哚基的化学修饰 来源：Trp色 修饰反应：氧化反应 修饰剂： N-溴代琥珀酰亚胺
各种氨基酸侧链的修饰剂
氨基酸 侧链基团
修饰剂
Lys
Asp、Glu Arg Cys
His Tyr Trp
氨基
羧基 胍基 巯基 二硫键 咪唑基 酚羟基 吲哚基
三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘 乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸 水溶性碳化二亚胺 苯乙二醛，1,2－环己二酮、丁二酮 碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺 巯基乙醇、DTT 焦碳酸二乙酯、碘乙酸 碘、四硝基甲烷 N-溴代琥珀酰亚胺
素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。 修饰方法：修饰前活化，然后在一定条件下与
酶分子共价结合。
Hale Waihona Puke 3. 应用： 如：PEG－超氧化物歧化酶（SOD）
PEG－溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等） PEG－天门冬酰胺酶（ASNase） • 消除了抗原性 • 延长了酶在体内的半衰期 又如：用Dextran 右旋糖酐 修饰-淀粉酶，－淀粉酶，胰 蛋白酶、过氧化氢酶，提高了酶的热稳定性。
但解释修饰效果须十分小心，因为： ①任何一种修饰剂不是绝对专一的。 ②有些修饰剂引起蛋白质构象变化——失活， 不一定是活性中心基团被共价修饰。 ③不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子 内部的必需基团，不易被修饰。
（三）交联修饰（交联法） 用双功能基团试剂(如戊二醛)，与酶分子内不同
肽链部分共价交联，使酶分子空间构象更加稳定。 （四）固定化修饰（共价偶联法）
E－SH ＋

5) 二硫键的化学修饰 还原：巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）
氧化：过甲酸:
6)咪唑基的化学修饰 来源：His组 修饰反应:酰基化与烷基化

酶分子的修饰

• 每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以 使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；
• 每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力 达到原有酶活力的5.1倍
15
• 聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水 溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并 可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产 生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。
• 另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用 时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作 用力，其稳定性也就增加了。
14
共价修饰
• 用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等， 通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。
• 例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶 ，不仅可以降 低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力， 延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。
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金属离子置换修饰的过程
a. 酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经分离纯化，除 去杂质，获得具有一定纯度的酶液。
b. 除去原有的金属离子：在纯化的酶液中加入一定量金属 螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金 属离子与EDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛 层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。此时酶 往往成为无活性状态。
Fe—SOD中的Fe被Mn取代后，酶的稳定性和抑 制作用发生显著改变：Mn-SOD对H2O2稳定性显 著增加．而对NaN3的抑制作用显著降低。
24
第二节 酶侧链基团的修饰
酶化学修饰的目的，主要是提高酶的稳定 性和消除作为外源物质在体内的抗原性。 要达到这些目的，在修饰原理、修饰剂和 反应条件的选择以及对酶学性质的了解等 方面，都必须有足够的了解。
3

6.酶的化学修饰

孙利芹 2013制作
二、修饰剂反应性的决定因素
1.选择吸附
化学修饰前，修饰剂是根据各自特点选择性的吸附 在低极性区或高极性区，并与蛋白质形成蛋白质-修饰剂 的复合物。一旦复合物形成后，修饰区的速度加强了。这 种速度的加强，部分是由于选择性吸附的结果。
例如,D-氨基酸氧化酶的巯基与一系列的N-马来酰亚 胺的反应表明,巯基的辛基化速度比乙基化速度高15倍. 这说明巯基处在非极性环境中,修饰剂先与蛋白质的巯基 疏水键合，然后烷基化.
N
O
N+HR O C N+HR＇
O—
+
H
C N+ R—
+
H+
pH5
ENZCຫໍສະໝຸດ HX（卤素）ENZ
O
N+HR X O C N+HR＇
C
+ H+
R,R’为烷基， HX 为卤素、一级或二级胺；ENZ为酶 孙利芹 2013制作
O
ENZ-C-O-
CH3
+
O+ BF4
PH≈5
H3C CH3
O
硼氟化三甲烊盐
ENZ-C-OCH3 + CH3OCH3 + BF4-

微环境（Microenvironment）：由于酶分子
表面外形的不规则、各原子间极性和电荷的不同、 各残基间相互作用的结果，是分子结构的局部形成 一种与酶活性有关的环境。
孙利芹 2013制作
§4.1 化学修饰的原理
基本概念
◆化学修饰：凡能通过化学基团的引入或除去而使蛋
白质共价结构发生改变，称为蛋白质的化学修饰。 ◆选择性化学修饰：指肽链侧链基团被化学试剂专一 性修饰，在较温和的条件下，以可以控制的方式使 一种蛋白质同某些化学试剂起特异反应，从而引起单个 氨基酸残基或其功能基发生共价的化学改变。
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酶分子修饰的目的
一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性
修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶 的天然构象产生“刚性”结构。
二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂
大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡 抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。
三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶
4.2.2 常见基团的化学修饰反应：羧基
碳二亚胺 硼氟化三甲烊盐
4.2.3 常见基团的化学修饰反应：巯基
5,5’-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB） 对氯汞甲苯酸（PMB）
4.2.4 常见基团的化学修饰反应：胍基
丁二酮
4.2.5 常见基团的化学修饰反应：酚基
四硝基甲烷 二异丙基氟磷酸（DFPA）
4.2.6 常见基团的化学修饰反应：咪唑基
焦炭酸二乙酯 碘乙酸
4.2.7 常见基团的化学修饰反应：吲哚基
2-羟基-5-硝基苄溴
4.2.8 分子内交联修饰
含有双功能基团的化合物（称为双功能试剂），如戊二醛、己 二胺、葡聚糖二乙醛等，可以在酶蛋白分子中相距较近的两个侧链 基团之间形成共价交联，从而提高酶的稳定性的修饰方法。
2. 大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成“缓冲外壳”， 抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。
酶分子修饰的设计
一、充分认识酶分子的特性，包括酶的——
1. 活性部位情况 2. 稳定条件及反应最佳条件 3. 侧链基团的化学性质及反应活泼性
二、 修饰剂的选择，要考虑—— 1.修饰剂的分子量及链的长度（要求有较大的分子量） 2.修饰剂上反应基团的数目及位置（要求有较多的反应活 性基团） 3.修饰剂上反应基团的活化方法与条件
第四章 酶的分子修饰
Chapter 4 Modification of Enzyme Molecule
酶在实际应用中有局限性：
1、酶蛋白经不起温度、酸碱、有机溶剂及时间的考验， 半衰期短、易变性失活； 2、酶的活性、作用专一性和最适条件不一定能适应生产 工艺要求，限制了酶制剂的应用范围； 3、作为异体蛋白在体内难于吸收、易引起免疫反应和被 识别降解 。
通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变 酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。
在体外将酶分子通过人工的方法 与一些化学基团（物质），特别是具 有生物相容性的物质，进行共价连接， 从而改变酶的结构和性质。
蛋白质水平：化学修饰 核酸水平：基因工程
通过基因工程方法 改变编码酶分子的基因 而达到改造酶的目的。
修饰剂）。
胃蛋白酶原 HCl
胃蛋白酶（从N端失去44个氨基酸残基）
pH1.5～2
自身激活
胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活
（二）核苷酸链剪切修饰 在核苷酸链的限定位点
进行剪切，使酶的结构发 生改变，从而改变酶的特 性和功能的方法。
4.2 酶的侧链基团修饰
采用一定的方法（一般为化学法） 使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改 变酶分子的特性和功能的修饰方法。
三、反应条件的选择，要注意—— 1. 酶与修饰剂的分子比例 2. 反应体系的溶剂性质、盐浓度、pH条件 3. 反应温度及时间
4.1 酶分子主链修饰
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其 空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。
（一）肽链有限水解修饰 蛋白主链修饰采用酶法（用专一性较强的蛋白酶或肽酶为
分离：
需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶 分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。
例：均三嗪活化法
PEG
活化的PEG
天然酶
修饰酶
大分子修饰的作用
（1）提高酶活力（空间构象改变）
一分子RNA酶 + 6.5分子右旋糖苷——酶活提高为原来的2.25倍。 一分子胰凝乳蛋白酶 + 11分子右旋糖苷——酶活提高原来的 5.1倍。 一分子胰蛋白酶 + 11分子右旋糖苷——酶活提高0.30倍
（2）增加酶的稳定性
SOD:属氧化还原酶类，能清除体内超氧负离子，具有保护 DNA、蛋白质和细胞膜的作用，使它们免受超氧负离子 的破坏。
治疗：类风湿性关节炎、白内障、膀胱炎、红斑狼疮、 皮肤炎等。
SOD在体内稳定性差，静脉注射方式给药SOD半衰期只 有6～30 min
双功能试剂
同型双功能基团化合物 异型双功能基团化合物
4.2.9 大分子结合修饰
利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些 精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。是目前应用 最广的酶分子修饰方法。
修饰剂的选择
修饰剂的活化
修饰
分离
修饰剂的选择 ：
大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。 如：聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物 （Ficoll）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚 氨基酸等。 要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶 性大分子。
酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶： 1. 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮
盖”酶分子上敏感键免遭破坏。 2. 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶
破坏的可能性。
四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境
1. 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。 破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除 “遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合
修饰剂的活化：
以聚乙二醇（PEG）为例： 用于酶分子修饰的主要聚乙二醇衍生物有： ①聚乙二醇均三嗪衍生物 ②聚乙二醇琥珀酰亚胺衍生物 ③聚乙二醇马来酸酐衍生物 ④聚乙二醇胺类衍生物
修饰：
将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以 一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间， 使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶 分子进行修饰。
酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质 的氨基酸残基上的功能团。主要包括氨 基、羧基、巯基、胍基、酚基等。这些 基团可以形成各种副键，对酶蛋白空间 结构的形成和稳定有重要作用。侧链基 团一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改 变，从而改变酶的特性和功能。
4.2.1 常见基团的化学修饰反应：氨基
2,4,6-三硝基苯磺酸 2,4-二硝基氟苯 丹磺酰氯