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第三章层析概论一、层析以基质为固定相(柱状或薄层状)，以液体或气体为流动相，有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附或交换作用，最终结果是使混合物得到分离。
目前，这种方法已作为纯化或鉴定各种化合物的一种重要手段。
1903年俄国植物学家茨维特首先将碳酸钙细粉装入玻璃管内使其成柱形，然后把石油醚抽提的植物色素溶液倾入，让其通过碳酸钙柱，接着用石油醚洗涤发现，各种色层彼此可分开，柱上端呈黄色，较下端呈绿色，这就是早期的吸附层析碳酸钙细粉植物色素溶液石油醚洗涤二、层析类型层析方法可根据不同的标准分成若干类型：按流动相分类：液相层析和气相层析；按固定相“床”的形式分类：柱层析、薄板(层)层析、薄膜层析等等，详见表3~1。
三、层析常用术语1．固定相固定相是由层析基质组成的。
其基质包括：固体物质(如吸附剂、离子交换剂)液体物质(如固定在纤维素或硅胶上的溶液)，这些物质能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用。
2．流动相在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体称为流动相。
在柱层析时，流动相又称洗脱剂或洗涤剂(即推动有效成分或杂质向一定方面移动的溶液)。
在薄层层析时，流动相又称展层剂。
3．操作容量即在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量；一般以每克(或毫升)基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数来表示。
(mmol/g, mg/g, mmol/ml, mg/ml)其数值大，表明基质对某种成分的结合力强；否则反之。
4．床体积(Vt)通常床体积是指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积(Vt)。
Vt是基质的外水体积(V0)和内水体积(Vi)以及自身体积(Vg)的总和，即:Vt = V0+ Vi + Vg(详见图3-1)5．外水体积(V0)外水体积指基质颗粒之间体积的总和。
6．内水体积(Vi)内水体积是指基质颗粒内部体积的总和。
7．基质体积(Vg)基质体积是指基质自身所具有的体积。
层析的分类：
1. 按两相所处物理状态分类
气相层析：气液层析（固定相为液体）和气固层析（固定相为固体），流动相为气体。
液相层析：液液层析（固定相为液体）和液固层析（固定相为固体），流动相为液体。
2. 按层析方式分类
柱层析：固定相装于柱内，使样品沿着一个方向移动而分离。
薄层层析：将适当粘度的固定相均匀铺在薄板上，点样后，用流动相展开。
纸层析：用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开。
3. 根据层析原理分类：常用分类法
（1）吸附层析：固定相是固体吸附剂，通过对不同溶质吸附力强弱不同进行分离。
（2）分配层析：利用两相中的分配系数不同。
分配系数：当一种溶质在两种给定的互不相溶的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比值为一常数，即分配系数（Kd）
Kd＝Ca / Cb
Ca和Cb分别代表某一物质在互不相溶的两相，A相（动相）和B相（静相）中的浓度。
（3）离子交换层析：固定相是离子交换剂，各组分与其亲和力不同
（4）凝胶层析：固定相是多孔凝胶，根据流动相中溶质的分子量大小差异进行分离（5）亲和层析：利用固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的配基，与溶质分子发生可逆的特异性结合进行分离
（6）金属螯合层析
（7）疏水层析
（8）反相层析。
9种层析分离纯化方法详解层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。
所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质，如水和各种溶媒。
当待分离的混合物随溶媒（流动相）通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随溶媒向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。
与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。
反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。
分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。
按层析原理可将层析分为以下9种：1、亲和层析利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离的目的。
将可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含混合组分的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，性无关组分随流动相流出。
改变流动相组分，可将结合的亲和物洗脱下来。
亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称配基。
具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体，DNA与互补DNA或RNA，酶与底物、激素与受体、维生素与特异结合蛋白、糖蛋白与植物凝集素等。
亲和层析可用于纯化生物大分子、稀释液的浓缩、不稳定蛋白质的贮藏、分离核酸等。
亲和层析纯化的分离原理特点：亲和层析具有高选择性、高纯度、快速、浓缩等特点，在重组蛋白的分离中多作为第一步的粗纯，实现对绝大部分杂质蛋白的去除。
2、离子交换层析采用具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆交换的性质来分离离子型化合物的方法。
主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其他带电荷的生物分子。
不同蛋白质的等电点（pI，isoelectric point）特性，使在不同pH缓冲液条件下所带正/负净电荷不同，选择不同的离子交换柱实现分离。
四种层析方法层析方法是一种将混合物中的化合物分离出来的方法。
这种技术通过利用化合物在固定相和移动相之间的不同亲和性来实现分离。
层析方法因其简单性和广泛的适用性而成为化学、生物化学和制药学中最基本的分离技术之一。
本文将介绍四种常见的层析方法，包括薄层层析法、气相层析法、离子交换层析法和凝胶层析法。
这些方法将被讨论其原理、应用、实施步骤和优缺点。
一、薄层层析法薄层层析法（TLC）是一种快速、低成本的液相分离技术。
该技术将被分析物和固定相通过一个毛细管作为裂隙分裂（slit split），使用一层非极性或极性的固定相作为分离基质，包括硅胶、氧化铝和氢氧化铝。
被分离的化合物随着移动液相在固定相上移动，不同化合物基于其不同亲和性分配到不同位置上。
该方法的实施步骤包括样品的准备、涂抹和显色步骤。
样品通常被溶解在一个合适的溶剂中，并用玻璃毛细管将其施加到固定相上。
一旦样品施加到固定相上，被分离的化合物将随着移动液相在固定相上移动。
显色可以通过利用化学试剂或紫外线进行检测。
TLC 广泛应用于化学、生物化学和制药学中，用于分析中等大小的有机和无机化合物，如氨基酸、脂肪酸、天然产物和药物。
优点：TLC是一种快速、低成本的分离技术，对于中等大小的化合物具有很好的分离效果。
TLC可以用于大规模样品纯化，并且可以被用于对化合物混合物进行初步分析的快速筛选。
缺点：TLC存在分离效率低和灵敏度低的问题，并且与其他层析技术相比，其分辨率相对较低。
TLC在数据分析方面存在可重复性差的问题。
二、气相层析法气相层析法（GC）是一种对挥发性和半挥发性化合物进行分离的技术。
此方法使用长列的液体或固定相，将待分离的化合物从液态或气态的样品中吸附并分离出来。
通过加热样品，在固定相中获得了一个气态分离的组分，可以将化合物通过检测器进行检测。
该方法通常使用非极性液态或固态固定相，如聚硅氧烷或聚乙二醇。
GC也可以选择更具有极性的固定相，从而实现对更极性化合物的分离。
常见分离纯化技术原理---介绍离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析、分配层析和电泳原理1、离子交换层析法⏹原理:根据离子间作用力的不同而将物质分离的方法⏹离子交换剂可解离出阴离子或阳离子，当待分离的溶液中含有阳离子时可以与阳离子交换剂的阳离子交换吸附在离子交换介质上，带电量不同的物质与离子交换剂的结合力不同，解离的条件不同，可通过改变条件，促使其解离和分部收集待分离物。
Sampleapplication and wash Elution Equilibration Regeneration-------------------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++anion exchanger bead ----------离子交换层析步骤和发生的变化2、凝胶过滤层析技术●概念（排阻层析，分子筛层析）：当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。
●原理：凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外,在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。
⏹凝胶过滤法测定相对分子量◆蛋白质分子通过凝胶的洗脱体积取决于它的斯脱克半径；◆如果未知蛋白与理想的非水化球体有相同的洗脱体积，则认为这种蛋白质具有与球体相同的的斯脱克半径；◆因此，实验中只要测得标准蛋白的洗脱体积，再测得未知蛋白的洗脱体积就可以得到它的相对分子量。
3、疏水作用层析⏹非极性氨基酸残基组成的疏水区域可使蛋白质结合非极性分子，利用这种相互作用蛋白质可被吸附在基质上。
⏹在不带电荷的载体上偶联疏水基团而形成疏水吸附剂⏹利用载体和样品疏水基团间的相互作用使它们吸附在一起，然后改变层析条件，减弱疏水作用，使吸附的蛋白质从吸附剂上解吸下来。
