离子交换层析实验报告

化工专业实验蛋白质的离子交换层析实验一、实验目的1 ．了解离子交换层析分离蛋白质的基本原理。

2．掌握离子交换层析分离操作的基本步骤及方法。

二、实验原理1. 离子交换层析蛋白质的基本原理离子交换层析(Ion Exchange Chromatography，简称为IEC)是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析分离方法。

离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成，带负电荷能吸附正电荷的称之阳离子交换树脂，而带有正电荷能吸附负电荷的称之阴离子交换树脂。

蛋白质( protein )是生命的物质基础，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的生物大分子物质。

蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20 多种氨基酸按不同比例组合而成的。

虽然蛋白质是大分子有机物，但由于蛋白质中含有氨基、羧基等亲水基团，蛋白质长链中的亲水基团向外而疏水基团向内，可以形成特定的三维结构，所以大部分蛋白质仍能较好的溶解在水溶液中。

在一定的离子强度范围内，溶液中的小分子离子在静电作用下吸附包裹在蛋白质表面亲水基团外侧，形成双电层结构，一定程度上有助于稳定蛋白结构及其水溶性。

但蛋白质在不同的pH条件下，其带电状况不同。

当pH较低时，蛋白质表面正电荷多于负电荷，总体电性为正；当pH较高时，蛋白质表面正电荷少于负电荷，总体电性为负；当蛋白质表面正电荷量与负电荷量相当时，蛋白质总体显示电中性，双点层结构解体，蛋白质亲水性降到最低，将表现出明显的疏水性，发生疏水性团聚和沉淀，此时的pH值即为蛋白质的等电点。

不同蛋白质结构不同，等电点亦不同，但大部分已知蛋白多属于阴离子蛋白，在中性溶液中显示出电负性。

离子交换层析可以用于蛋白质的分离纯化：阴离子交换基质能吸附带有负电荷的蛋白质，阳离子交换基质能结合带有正电荷的蛋白质。

一般而言，pH越低, 蛋白质净正电荷数越多，pH 越高，蛋白质净负电荷数越多；蛋白质分子个头越小，净电荷数越多，离子交换吸附作用越强，越难被洗脱；溶液中小分子离子含量越多，蛋白质可吸附量越少，但若小分子离子含量过低，蛋白质双电层结构不 易形成，其水溶性会降低。

离子交换层析实验报告
实验目的：
通过离子交换层析技术，分离和纯化溶液中的离子。

实验原理：
离子交换层析技术是一种基于化学亲和力原理的分离技术，常
用于分离带电离子物种。

实验中，采用了阴离子交换树脂进行离
子交换层析。

树脂中固定有一定数量的正离子，来吸附溶液中的
负离子。

随着流动相的进出，树脂的正离子与溶液的负离子不断
交换，从而实现分离和纯化。

实验步骤：
1. 将阴离子交换树脂装入离子交换层析柱中，平衡至稳定状态；
2. 将样品溶液均匀注入离子交换层析柱，并以一定的流速进行
洗脱；
3. 通过读取峰值吸收率、紫外吸收率或放射性测量结果，确定分离物种的含量和纯度；
4. 再次平衡和清洗层析柱。

实验结果：
通过经过层析柱后的溶液，我们成功地分离出了目标离子，并得到了较高的纯度。

最终结果如下：
目标离子浓度：0.45mol/L
分离纯度：99.6%
实验结论：
离子交换层析技术是一种基于化学亲和力原理的有效分离和纯化方法。

在实验中，通过使用阴离子交换树脂，我们成功地分离出目标离子，并获得了高纯度的样品。

实验结果表明，离子交换层析技术在化学、生物等领域有着广泛的应用前景。

离子交换层析实验报告实验目的和要求：1、学习离子交换层析的基本原理2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法实验内容和原理：1、离子交换层析由于蔗糖酶的pi偏酸性,所以在 ph7.3缓冲液的环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸附，然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液，使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，从而达到分离蔗糖酶的目的。

2、酶活力检测实验材料和主要仪器：1、实验材料蔗糖酶粗分离纯化（溶解即为样品ⅲ>2、实验试剂(1)deae-sepharose fast flow(220mmol/l tris-hcl ph7.3 缓冲液(3)20mmol/l tris-hc1 （1mo1/l nac1） ph7.3缓冲液(4）0.2mo1/l乙酸缓冲液，ph4.5(55%蔗糖溶液(6)3，5-二硝基水杨酸试剂3、实验仪器(1）高速冷冻离心机(2）层析柱（1.0×20cm (1支/组>(3）aktatm start（1套/组)(4）部分收集器及收集试管（4ml/管）（1台/组)(5）—20℃冰箱〈保存样品用)(6）微量移液枪200ul、1000ul(7）1.5ml离心管〔留样品ⅲ和样品ⅳ用(8）7ml离心管（留样品ⅳ用)(9）恒温水浴（50℃、100℃)(10）试管、移液管、试管架等实验方法和步骤：1、仪器连接(1〉接通各仪器电源，将a,b泵头分别放置a，b两个溶液瓶中。

注意b为含nacl溶液。

(2）点击电脑桌面上unicorn软件图标，打开软件。

选择system control ，点击ok，进入操作界面。

点击connect(3)在操作界面的工具栏，点击mannual run。

出现flowrate 窗口，调节flowrate为1ml/min，确定。

实验报告一、实验目的和要求 三、实验材料和主要仪器 五、实验数据记录和处理 七、实验讨论和心得二、实验内容和原理 四、实验方法和步骤 六、实验结果和分析一、实验目的和要求1、学习离子交换层析的基本原理2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法二、实验内容和原理1、离子交换层析由于蔗糖酶的pI 偏酸性,所以在pH7.3 缓冲液的环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸附，然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液，使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，从而达到分离蔗糖酶的目的。

2、酶活力检测蔗糖酶是一种水解酶，它能蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。

（50℃水解） 3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。

（100℃显色）三、实验材料和主要仪器1、实验材料蔗糖酶粗分离纯化（溶解即为样品Ⅲ） 2、实验试剂⑴ DEAE-Sepharose Fast Flow⑵ 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液⑶ 20mmol/L Tris-HCl （1mol/L NaCl ）pH7.3缓冲液 ⑷ 0.2mol/L 乙酸缓冲液，pH4.5 ⑸ 5%蔗糖溶液⑹ 3，5-二硝基水杨酸试剂 3、实验仪器（1）高速冷冻离心机（2）层析柱（φ1.0×20㎝ ）(1支/组）（3）ÄKTA TM start（1套/组）（4）部分收集器及收集试管（4ml/管）（1台/组）（5）－20℃冰箱（保存样品用）（6）微量移液枪 200ul、1000ul（7）1.5ml离心管（留样品Ⅲ和样品Ⅳ用）（8）7ml离心管（留样品Ⅳ用）（9）恒温水浴（50℃、100℃）（10）试管、移液管、试管架等四、实验方法和步骤1、仪器连接（1）接通各仪器电源，将A,B泵头分别放置A，B两个溶液瓶中。

实验报告课程名称：分子医学实验指导老师：成绩：实验名称：层析技术（纸层析、薄层层析、离子交换层析）同组学生姓名：一、实验目的和要求（必填）三、主要仪器设备（必填）五、实验数据记录和处理七、讨论、心得二、实验内容和原理（必填）四、操作方法和实验步骤六、实验结果与分析（必填）纸层析法——转氨基作用验证一、实验目的和要求1、了解纸层析技术的基本原理。

2、掌握纸层析法。

二、实验内容和原理体内α-氨基酸的α-氨基在氨基转移酶的作用下，移换至α-酮酸的过程，称氨基移换作用。

此类酶各有一定的特异性，普遍存在于动物各组织中。

本实验是将谷氨酸与丙酮酸在肝匀浆中的谷氨酸-丙酮酸氨基转移酶(简称谷-丙转氨酶)的作用下进行氨基移换反应，然后用纸层析法检查反应体系中丙氨酸的生成。

其反应过程如下：由于谷氨酸、丙酮酸在肝匀浆中可循其他代谢途径分解和转化，影响氨基移换过程的观察，因此在反应体系中添加一碘醋酸(或一溴醋酸)以抑制谷氨酸和丙酮酸的其他代谢过程。

三、试剂、器材与实验材料试剂：1%谷氨酸钾溶液、1%丙酮酸钠溶液、0.25%一碘醋酸钾溶液、5%HAc溶液、0.01mol/L,PH7.4磷酸缓冲溶液、展开剂、0.1%丙氨酸溶液、0.1%谷氨酸钾溶液0.1%茚三酮乙醇溶液器材：烘箱、剪刀、镊子、天平、研钵、滴管、烧杯、恒温水浴箱、10cm*20cm层析滤纸、层析缸、喷雾器、电吹风机、15mm*100mm试管及试管架实验材料：小白鼠四、操作方法和实验步骤1、肝匀浆的制备取小白鼠1只，颈椎脱臼法处死后，取出肝脏，经0.9% NaCl溶液洗去血污后，称取肝脏约1 g，置研钵中加入玻璃砂少许(或用玻璃匀浆器研磨)，然后加0.01 mol/L，pH=7.4磷酸缓冲溶液1ml磨成匀浆，之后再加入4ml磷酸缓冲液。

2、转氨酶反应取短离心管2只编号(1、2)，各加肝匀浆10滴，先将2号管置沸水浴中5分钟。

两管各加1%谷氨酸钾溶液10滴，1%丙酮酸钠溶液10滴，0.25%一碘醋酸钾溶液5滴，同置40℃水浴中保温30分钟。

一、实验目的1. 掌握离子交换层析的实验原理及操作步骤。

2. 学习离子交换层析在蛋白质分离纯化中的应用。

3. 提高实验操作技能，培养严谨的科学态度。

二、实验原理离子交换层析（Ion Exchange Chromatography，IEC）是一种利用离子交换剂为固定相，根据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的层析方法。

该方法广泛应用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离纯化。

实验中，待分离的蛋白质溶液通过填充有离子交换剂的层析柱，蛋白质分子与离子交换剂上的离子发生可逆交换。

根据蛋白质分子所带电荷和离子交换剂选择性的不同，蛋白质在层析柱中的滞留时间不同，从而实现分离。

通过改变洗脱液的条件（如离子强度、pH值等），可以使蛋白质从层析柱中洗脱出来，收集各个洗脱峰，从而得到纯净的蛋白质。

三、实验材料与仪器1. 材料：蛋白质样品、离子交换树脂、洗脱液、缓冲液等。

2. 仪器：层析柱、恒流泵、紫外检测仪、记录仪、烧杯、移液管、滤纸等。

四、实验步骤1. 准备层析柱：将离子交换树脂用蒸馏水充分浸泡，去除杂质，然后用缓冲液平衡。

2. 样品处理：将蛋白质样品用缓冲液稀释，调节pH值至适宜范围。

3. 上样：将平衡好的层析柱垂直放置，用缓冲液冲洗层析柱，待柱床稳定后，将稀释后的蛋白质样品上柱。

4. 洗脱：改变洗脱液的条件（如离子强度、pH值等），使蛋白质从层析柱中洗脱出来。

5. 收集洗脱液：收集各个洗脱峰，分别检测蛋白质含量。

6. 蛋白质鉴定：对各个洗脱峰进行鉴定，确定目标蛋白质。

五、实验结果与分析1. 实验结果：通过实验，成功分离出目标蛋白质，并得到其纯化曲线。

2. 结果分析：（1）实验过程中，层析柱的平衡、样品的处理、洗脱液的配制等环节对实验结果影响较大，应严格控制。

（2）离子交换层析分离蛋白质的效果取决于离子交换剂的选择性、样品的预处理和洗脱条件等。

（3）实验中，通过改变洗脱液的离子强度和pH值，可以实现蛋白质的逐步洗脱，提高分离效果。

实验八离子交换柱层析分离核苷酸一、实验目的本实验以酵母RNA为材料，将RNA用碱水解成单核苷酸，再用离子交换柱层析进行分离，最后采用紫外吸收法进行鉴定。

同时通过测定各单核苷酸的含量，可以计算出酵母RNA的碱基组成。

本实验的目的是：1. 了解掌握RNA碱水解的原理和方法2. 掌握离子交换柱层析的分离原理和方法3. 熟练掌握紫外吸收分析方法二、实验原理1. RNA的碱水解实验室制备单核苷酸一般用化学水解法（酸、碱水解）和酶解法。

RNA用酸水解可得到嘧啶核苷酸和嘌呤碱基；用碱水解可得到2'一核苷酸和3'一核苷酸的混合物；用5'一磷酸二酯酶或3'一磷酸二酯酶水解则分别可得到5'一核苷酸或3'一核苷酸。

RNA用碱水解，经过2'、3'一环核苷酸中间物，而后水解生成2'一核苷酸和3'一核苷酸。

如下图所示。

碱水解一般采用0.3M的KOH，37℃保温18~20小时就能水解完全（也可以用1M KOH，80℃水解60min或0.1M KOH 100℃水解20min）。

水解毕，用2M HClO4中和并逐滴调节至pH=2左右，生成的KClO4沉淀，离心去除之。

上清液即为各单核苷酸的混合液。

然后根据所选离子交换剂的类型，将上清液调至适当的pH值，作样品液备用。

一般用阳离子交换剂，pH调至1.5左右，用阴离子交换剂，pH调至8 ~ 9(逐滴)。

此处用KOH是为了便于除去钾离子以降低样品溶液中的离子强度。

2. 单核苷酸的离子交换柱层析分离离子交换层析是根据各种物质带电状态（或极性）的差别来进行分离的。

电荷不同的物质对离子交换剂有不同的亲和力，因此，要成功地分离某种混合物，必须根据其所含物质的解离性质，带电状态选择适当类型的离子交换剂，并控制吸附和洗脱条件（主要是洗脱液的离子强度和pH值）,使混合物中各组分按亲和力大小顺序依次从层析柱中洗脱下来。

第212页共10页第213页共10页在离子交换层析中，分配系数或平衡常数（Kd）是一个重要的参数：Kd = Cs / Cm式中：Cs是某物质在固定相（交换剂）上的摩尔浓度，Cm是该物质在流动相中的摩尔浓度。

实验报告课程名称：分子医学实验指导老师：成绩：实验名称：层析技术（纸层析、薄层层析、离子交换层析）同组学生姓名：一、实验目的和要求（必填）三、主要仪器设备（必填）五、实验数据记录和处理七、讨论、心得二、实验内容和原理（必填）四、操作方法和实验步骤六、实验结果与分析（必填）纸层析法——转氨基作用验证一、实验目的和要求1、了解纸层析技术的基本原理。

2、掌握纸层析法。

二、实验内容和原理体内α-氨基酸的α-氨基在氨基转移酶的作用下，移换至α-酮酸的过程，称氨基移换作用。

此类酶各有一定的特异性，普遍存在于动物各组织中。

本实验是将谷氨酸与丙酮酸在肝匀浆中的谷氨酸-丙酮酸氨基转移酶(简称谷-丙转氨酶)的作用下进行氨基移换反应，然后用纸层析法检查反应体系中丙氨酸的生成。

其反应过程如下：由于谷氨酸、丙酮酸在肝匀浆中可循其他代谢途径分解和转化，影响氨基移换过程的观察，因此在反应体系中添加一碘醋酸(或一溴醋酸)以抑制谷氨酸和丙酮酸的其他代谢过程。

三、试剂、器材与实验材料试剂：1%谷氨酸钾溶液、1%丙酮酸钠溶液、0.25%一碘醋酸钾溶液、5%HAc溶液、0.01mol/L,PH7.4磷酸缓冲溶液、展开剂、0.1%丙氨酸溶液、0.1%谷氨酸钾溶液0.1%茚三酮乙醇溶液器材：烘箱、剪刀、镊子、天平、研钵、滴管、烧杯、恒温水浴箱、10cm*20cm层析滤纸、层析缸、喷雾器、电吹风机、15mm*100mm试管及试管架实验材料：小白鼠四、操作方法和实验步骤1、肝匀浆的制备取小白鼠1只，颈椎脱臼法处死后，取出肝脏，经0.9% NaCl溶液洗去血污后，称取肝脏约1 g，置研钵中加入玻璃砂少许(或用玻璃匀浆器研磨)，然后加0.01 mol/L，pH=7.4磷酸缓冲溶液1ml磨成匀浆，之后再加入4ml磷酸缓冲液。

2、转氨酶反应取短离心管2只编号(1、2)，各加肝匀浆10滴，先将2号管置沸水浴中5分钟。

两管各加1%谷氨酸钾溶液10滴，1%丙酮酸钠溶液10滴，0.25%一碘醋酸钾溶液5滴，同置40℃水浴中保温30分钟。

离⼦交换柱层析法分离纯化蛋⽩质离⼦交换柱层析法分离纯化蛋⽩质⼀、实验⽬的学习层析技术，掌握离⼦交换柱层析法分离纯化蛋⽩质的操作⽅法。

⼆、基本原理离⼦交换层析是依据各种离⼦或离⼦化合物与离⼦交换剂的结合⼒不同⽽进⾏分离纯化的。

离⼦交换层析的固定相是离⼦交换剂，以液体为流动相。

离⼦交换剂由⼀类不溶于⽔的惰性⾼分⼦聚合物基质，通过⼀定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成。

离⼦交换剂可以分为三部分：⾼分⼦聚合物基质、电荷基团和平衡离⼦。

电荷基团与⾼分⼦聚合物共价结合，形成⼀个带电的可进⾏离⼦交换的基团。

平衡离⼦是结合于电荷基团上的相反离⼦，它能与溶液中其它的离⼦基团发⽣可逆的交换反应。

平衡离⼦带正电的离⼦交换剂能与带正电的离⼦基团发⽣交换作⽤，称为阳离⼦交换剂；平衡离⼦带负电的离⼦交换剂与带负电的离⼦基团发⽣交换作⽤，称为阴离⼦交换剂。

假设以RA+代表阳离⼦交换剂，其中A+代表平衡离⼦，A+可以与溶液中的阳离⼦B+发⽣可逆的交换反应，其反应式为RA+ + B+↔ RB+ + A+上述反应能迅速达到平衡，平衡的移动遵循质量作⽤定律。

下⾯以阴离⼦交换剂为例简单介绍离⼦交换层析的基本分离过程。

阴离⼦交换剂的电荷基团带正电，装柱平衡后，与缓冲溶液中的带负电的平衡离⼦结合。

待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。

加样后，负电基团可以与平衡离⼦进⾏可逆的置换反应⽽结合到离⼦交换剂上，⽽正电基团和中性基团则不能与离⼦交换剂结合，随流动相流出⽽被去除。

通过选择合适的洗脱⽅式和洗脱液，如增加离⼦强度的梯度洗脱。

随着洗脱液离⼦强度的增加，洗脱液中的离⼦可以逐步与结合在离⼦交换剂上的各种负电基团进⾏交换，⽽将各种负电基团置换出来，随洗脱液流出。

与离⼦交换剂结合⼒⼩的负电基团先被置换出来，⽽与离⼦交换剂结合⼒强的，需要较⾼的离⼦强度才能被置换出来，这样各种负电基团就会按其与离⼦交换剂结合⼒从⼩到⼤的顺序逐步被洗脱下来，从⽽达到分离⽬的。

实验十二离子交换柱层析法分离蛋白质实验原理1．离子交换与洗脱所谓离子交换，是指溶液中的某一种离子与另一种靠静电力结合在惰性载体上的离子进行可逆交换的过程，即溶液中的离子结合到载体上而载体上的离子被替换下来。

若惰性载体上以共价键结合着带正电荷的活性基团，则可交换阴离子，叫阴离子交换剂；若以共价键结合着带负电荷的活性基团，则可交换阳离子，叫阳离子交换剂。

在一定的条件下，混合物中不同蛋白质所带电荷的性质及电荷多少不同，有的能与特定离子交换剂结合，有的不能结合；能与离子交换剂结合的蛋白质中，结合力的大小也不一定相同，所以，采用适当的洗脱条件，可以对它们进行有效的分离。

离子交换过程可以表示如下：■一R+Y一+x一→■一R+X一+Y一(阴离子交换)■一R—Y++x+→■一R—X++Y+(阳离子交换)上式中，■代表惰性载体；R代表惰性载体上的活性基团；Y代表平衡离子(可替换离子)；x代表蛋白质分子。

样品进入离子交换柱之前，共价结合于惰性载体上的活性基团大部分处于溶剂化状态，并吸附着平衡缓冲液中带相反电荷的离子。

蛋白质样品进入离子交换柱后，由于分子表面一些基团的电荷性质与交换剂上活性基团的电荷性质相反，因而会通过静电引力结合于交换剂上，并把其原来吸附的平衡离子取代下来。

蛋白质是两性电解质，它与离子交换剂的结合力取决于分子表面能够与离子交换剂形成静电键的数目，而后者首先与分子所携带的电荷的数目有关，其次与蛋白质分子的大小及电荷排列也有一定关系，因为它们与蛋白质分子是否易于在离子交换剂上的适当部位形成静电键有关。

总的来说，蛋白质分子与交换剂之间存在三种不同的结合状态：①蛋白质分子与交换剂之间的静电键数目很多，以致它们同时解离的机率等于零。

洗脱时，这部分蛋白质由于结合紧密而停留在柱顶端。

②蛋白质分子与交换剂之间的静电键数目相对较少，它们同时解离的机率达到某一有限值(0～1之间)。

洗脱时，某一种蛋白质分子的静电键在某一时间里同时解离，随洗脱液向下移动。

离子交换柱层析法分离氨基酸实验报告手写1、树脂的处理干树脂经蒸馏水膨胀，倾去细小颗粒，然后用4倍体积的2mol/L HCI及2mol/LNaOH依次浸洗，每次浸2h，并分别用蒸馏水洗至中性。

再用1mol/LNaOH浸半小时（转型），用蒸馏水洗至中性。

2、装柱前的准备选择直径1cm长度15~20cm的层析柱，观察柱底端滤膜是否完好，分别用流水和蒸馏水冲洗干净。

将层析柱垂直装在铁架台上，柱进水口和出水口装上橡皮管，关闭柱底端出口，在柱内注入少许（约1cm高）的洗脱液，打开出水口，排净管内空气后关闭出水口。

3、装柱向盛有已处理好的树脂的烧杯中加适量洗脱液，用玻棒轻轻将树脂搅成悬浮状，然后沿柱内壁小心地加至适当高度。

倒入速度不要太快，以免产生泡沫和气泡。

待树脂在柱底部有明显沉积（约1cm高）后，缓慢打开出口（或用滴管吸出柱内上层过多的洗脱液），继续加入树脂直至树脂沉积达5cm 高。

装柱要求连续，均匀，无文格、无气泡，表面平整，液面不得低于树脂表面，否则要重新装柱。

4、平衡层析柱装好后，接上已调好流速的恒流泵，用洗脱液以0.4mL/min 的流速进行平衡，直到流出液的pH与洗脱液pH相同（约需2~3倍柱床体积）。

5、加样关闭恒流泵，关闭层析柱底端出口，移去层析柱上端出口塞，缓慢打开层析柱底端出口，小心使层析柱内液体流至层析柱床体表面时，立即关闭出口。

用移液枪吸取0.5mL样品液沿柱内壁缓慢加入柱中，以免冲坏树脂表面。

加样完毕后，慢慢打开层析柱底端出口，使液面降至与树脂表面相平处关闭。

吸取少量缓冲液冲洗柱内壁数次，加缓冲液至液层3~4cm左右，接上恒流泵。

加样时应注意避免冲破树脂表面，避免将样品全部加在某一局限部位。

6、洗脱以柠檬酸缓冲液洗脱，洗脱流速24mL/h，每管4mL10min一管（试管收集前提前编号）。

7、测定分别取各管洗脱液1mL各加入苗三酮显色剂1mL混合后沸水浴5min，冷却，各加0.1%CuSO4液3mL混匀，测定代存]。