脯氨酸(PRO)含量测定试剂盒说明书

植物中脯氨酸含量的测定实验报告及结果本实验的目的是测定植物中脯氨酸的含量。

脯氨酸是一种非常重要的氨基酸，它在植物中起着调节渗透压、抗逆性、保护细胞膜完整性等多种生理功能。

因此，测定植物中脯氨酸含量对于研究植物生理学和生物化学具有重要意义。

实验所需材料和仪器设备有：植物组织样品、乙醇、脯氨酸标准物质、离心机、溶液混合器、超声波清洗器、显微管、比色皿、分光光度计等。

实验步骤如下：1.准备样品：收集植物样品后，在洁净条件下取样品约10克，稍微清洗并切碎成小片，以利于提取脯氨酸。

2.浸提脯氨酸：将植物样品放入超声波清洗器中，加入适量的乙醇，使乙醇能充分接触到样品。

使用超声波清洗仪提取样品中的脯氨酸，提取时间为30分钟。

3.离心处理：将乙醇提取液离心10分钟，将上清液转移至显微管中。

4.标准曲线的制备：取不同浓度的脯氨酸标准物质，分别加入适量的乙醇，制备不同浓度（如0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL）的标准品溶液。

5.比色测定：取0.2~1.0 mL标准品溶液，分别加入10%冰醋酸溶液（2.3 mL），然后加入15%草酸溶液（2.5 mL），混合均匀。

再加入0.2%法拉第试剂（0.2 mL），充分混合，并静置15分钟。

测量样品的最大吸收波长为535 nm。

6.吸光度测定：使用分光光度计进行吸光度测定，按照比色皿中的液体，即可得到对应吸光度值。

7.测量样品中脯氨酸的含量：根据标准曲线上的吸光度值，可以通过光谱仪测得样品溶液的吸光度值，然后将其代入标准曲线中计算脯氨酸的含量。

通过以上步骤，我们可以测定植物中脯氨酸的含量。

实验的结果按照以下格式进行记录：表1植物样品中脯氨酸含量的测定结果样品编号吸光度值脯氨酸含量(mg/mL)--------------------------------10.320.120.450.230.520.340.570.450.620.5通过实验测定的结果，我们可以发现不同植物样品中脯氨酸含量的差异，并进一步探究其对于植物生长和生理功能的影响。

产品名称：L-脯氨酸(L-Proline)•国药准字：H20043212•性状：本品为白色结晶或结晶性粉末；微臭，味微甜。

•分子式：C5H9NO2•分子量：115.13•CAS号：147-85-3•产品描述•扩展属性详细描述：包装规格：内包装铝塑复合袋，外包装25kg全纸桶储存：遮光、密封保存，有效期两年质量标准【Quality Standard】检测项目Item CP2010EP5AJI92USP24含量Assay≥99.0%98.5～101.0%98.5～101.0%98.5～101.5%酸度pH 5.9～6.9 5.9～6.9比旋度Specific rotation[a]D020-84.5°～-86.0°-84.0°～－86.0°-84.5°～-86.0°[a]D025-84.3°～－86.0°溶液的透光度Transmittance(T430)clear&colorless≥98.0%clear&colorless≥98.0%≥98.0%氯化物Chloride(Cl)≤0.02%≤0.02%≤0.02%≤0.05%铵盐Ammonium(NH4)≤0.02%≤0.02%≤0.02%硫酸盐Sulfate(SO4)≤0.02%≤0.03%≤0.02%≤0.03%铁盐Iron(Fe)≤10ppm≤10ppm≤10ppm≤30ppm重金属Heavy metals(Pb)≤10ppm≤10ppm≤10ppm≤15ppm其他氨基酸Other amino acids≤0.5%≤0.5%Conforms Conforms 干燥失重Loss on drying≤0.30%≤0.50%≤0.30%≤0.40%炽灼残渣Residue on ignition≤0.10%≤0.10%≤0.10%≤0.40%内毒素Endotoxin≤10EU/g产品用途：L-脯氨酸是合成人体蛋白质的重要氨基酸之一，是氨基酸输液的重要原料，也是合成卡托普利、依那普利等一线降压药物的主要中间体，已被广泛应用于食品与医药工业。

脯氨酸脱氢酶（ProDH）活性检测试剂盒说明书货号：UPLC-MS-4460可见分光光度法规格：50T/48S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称规格保存条件提取液一液体60mL×1瓶4℃保存提取液二液体0.6mL×1支4℃保存试剂一液体40mL×1瓶4℃保存试剂二粉剂×1瓶4℃保存试剂三粉剂×1瓶4℃保存试剂四粉剂×1瓶-20℃保存溶液的配制：1、试剂二：临用前加入5mL蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂4℃保存；2、试剂三：临用前加入4mL蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂4℃保存；3、试剂四：临用前加入10mL蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂可分装-20℃保存，避免反复冻融。

4、工作液的配制：首先将试剂三和试剂四配成溶液，临用前根据用量按照试剂一（V）：试剂二（V）：试剂三（V）=1.6（mL）：0.2（mL）：0.15（mL）的比例充分混匀。

（注意：现配现用，用多少配多少）产品说明：ProDH是存在于线粒体内的催化脯氨酸降解的关键酶。

降低ProDH活性对于调节渗透平衡、防止渗透胁迫对植物造成伤害、清除自由基、保护细胞结构具有重要意义。

ProDH催化脯氨酸脱氢生成延丙酮酸，脱下的氢通过吩嗪二甲酯硫酸（PMS）传递还原2,6-二氯酚靛酚（DCPIP），并且在600nm处具有特征吸收峰，通过600nm吸光度的下降，测定2,6-DCPIP的还原速度，代表ProDH 活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：天平、低温离心机、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、丙酮、匀浆器/研钵、冰、蒸馏水。

操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、组织：按照组织质量（g）：提取液一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g样本，加入1mL 提取液一），进行冰浴匀浆，1500g4℃离心15min，取上清液于一支新的EP管中，加入10μL提取液二，涡旋混匀，冰浴放置30min后，15000g4℃离心20min，取上清置冰上待测。

测定脯氨酸药品配制及操作一、药品二、试验用具电子天平、烧杯、蒸馏水、容量瓶（250ml）1个、50ml容量瓶6个、试管6支（制作标曲应用）、水浴锅、试管若干、药品、标签、研钵、称量纸、注射器。

三、溶液配制酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol/L的磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解贮于冰箱中。

6mol/L磷酸：浓度为85%的磷酸大约是14mol/l，如果要配置6M的磷酸大约稀释到原来体积的2.3倍即可。

3%的磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。

冰醋酸甲苯四、试验步骤1、标准曲线的制作(1)在分析天平上精确称取25 mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250 ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100 μg。

(2)系列脯氨酸浓度的配制取6个50 ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0 ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6 μg·ml-1。

(3)取6支试管，分别吸取2 ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2 ml冰醋酸和3 ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30 min。

表2-5脯氨酸标准曲线表试剂 1 2 3 4 5 6系列Pro 溶液(mL) 2 2 2 2 2 2冰醋酸 2 2 2 2 2 2酸性印三酮溶液 2 2 2 2 2 2Pro 含量 2 4 6 8 10 12(4)冷却后各试管准确加入5 ml甲苯，振荡30 s，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。

(5)用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520 nm波长处进行比色。

(6)标准曲线的绘制：先求出吸光度值(Y)依脯氨酸浓度(X)而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2 ml测定液中脯氨酸的含量(μg·2 ml-1)。

脯氨酸（Pro ）含量检测试剂盒说明书可见分光光度法注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC0290规格：50T/48S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称规格保存条件提取液液体60mL×1瓶4℃保存试剂一液体45 mL×1瓶（自备）4℃保存试剂二液体45 mL×1瓶4℃保存标准品粉剂×1支4℃保存溶液的配制：1．试剂一：自备冰乙酸。

2．标准品：脯氨酸10 mg ，临用前加入1 mL 蒸馏水，配成10 mg/mL 标准品。

产品说明：脯氨酸（Pro ）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，逆境条件下，植物体内Pro 含量显著增加。

Pro 增加量在一定程度上反映了抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。

因此，脯氨酸增加量可以作为抗逆育种的生理指标之一。

用磺基水杨酸（SA ）提取Pro ，加热处理后，Pro 与酸性茚三酮溶液反应生成红色，在520nm 测定吸光度。

技术指标：最低检出限：0.1791 μg/mL 线性范围：0.5-40 μg/mL注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器及用品：可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、冰乙酸、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、细胞、细菌或组织样本的制备：细菌或细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3秒，间隔10秒，重复30次），之后置沸水浴振荡提取10min ；10000g ，常温离心10min ，取上清，冷却后待测。

组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆；之后置沸水浴振荡提取10min，10000g，常温离心10min，取上清，冷却后待测。

实验一脯氨酸含量的测定实验一脯氨酸含量的测定一、目的了解脯氨酸与植物逆境、衰老的关系;掌握脯氨酸测定原理和常规测定方法。

二、原理在正常环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量较低，但在逆境(干旱、低温、高温、盐渍等)及植物衰老时，植物体内游离脯氨酸含量可增加10~100倍，并且游离脯氨酸积累量与逆境程度、植物的抗逆性有关。

因此，测定植物体内游离脯氨酸的含量，在一定程度上可以判断逆境对植物的危害程度和植物对逆境的抵抗力。

在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，此缩合物在515nm处有最大吸收峰，可以用分光光度法测定。

三、实验材料，主要仪器和试剂1(实验材料植物组织。

2(主要仪器(1)分光光度计(2)水浴锅(3)大试管(18mm×200mm)(4)具塞刻度试管(20mL)3(试剂(1)酸性茚三酮溶液:称取1.25g茚三酮溶于30mL冰乙酸和20mL 6M磷酸溶液中，搅拌加热(低于70?)溶解，冷却后置棕色瓶中，4?保存可使用2~3天。

(2)80%乙醇(分析纯)。

(3)脯氨酸标准溶液:称取10mg脯氨酸，用少量80%乙醇溶解，蒸馏水定容至100mL(100μg/mL)。

再用蒸馏水释释成1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0μg/mL 的系列溶液。

四、操作步骤1(脯氨酸标准曲线制作取7支具塞试管，分别加入各浓度的标准脯氨酸系列溶液2mL，冰乙酸2mL，茚三酮溶液2mL，混匀后沸水浴中加热20min，冷却后，以0号管为对照在515nm 光波长下比色测定光密度。

以光密度OD为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线。

515nm管号标准脯氨酸(μg) 冰乙酸(mL) 茚三酮溶液(mL) OD 515nm1 02 22 1 2 23 2.5 2 24 5.0 2 25 10 2 26 15 2 27 20 2 22(样品制定(1)称取0.2~0.5g植物样品放入研砵中，用总量为10mL 80%的乙醇(少许)研磨成匀浆，将匀浆移入大试管并用剩余80%乙醇洗研砵，试管加盖，黑暗下浸提1h(样品为绿色叶片时，应加入少许活性炭)。

脯氨酸脱氢酶（ProDH）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

货号：BC4160规格：50T/48S产品内容：提取液一：液体60mL×1瓶，4℃保存；提取液二：液体0.6mL×1支，4℃保存；试剂一：液体40mL×1瓶，4℃保存；试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入5mL蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂4℃保存；试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入4mL蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂4℃保存；试剂四：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入10mL蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂可分装-20℃保存，避免反复冻融。

产品说明：ProDH是存在于线粒体内的催化脯氨酸降解的关键酶。

降低ProDH活性对于调节渗透平衡、防止渗透胁迫对植物造成伤害、清除自由基、保护细胞结构具有重要意义。

ProDH催化脯氨酸脱氢生成延丙酮酸，脱下的氢通过吩嗪二甲酯硫酸（PMS）传递还原2,6-二氯酚靛酚（DCPIP），并且在600nm处具有特征吸收峰，通过600nm吸光度的下降，测定2,6-DCPIP的还原速度，代表ProDH活性。

自备实验用品及仪器：天平、低温离心机、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、丙酮、匀浆器/研钵。

操作步骤：一、样本处理：组织：按照组织质量（g）：提取液一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g 样本，加入1mL 提取液一），进行冰浴匀浆，1500g 4℃离心15min，取上清液于一支新的EP 管中，加入一滴提取液二（用10μL 的枪头加入），涡旋混匀，冰浴放置30min 后，15000g 4℃离心20min，取上清置冰上待测。

细胞或细菌：按照细胞数量（104个）：提取液一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL 提取液一），冰浴匀浆，1500g 4℃离心15min，取上清液于一支新的EP 管中，加入一滴提取液二（用10μL 的枪头加入），涡旋混匀，冰浴放置30min 后，15000g 4℃离心20min，取上清置冰上待测。

羟脯氨酸（HYP ）含量检测试剂盒说明书微量法货号：BC0255规格：100T/96S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称规格保存条件提取液液体200 mL×1瓶（自备）常温保存试剂一液体8 mL×1瓶4℃保存试剂二液体8 mL×1瓶4℃保存标准品液体0.5 mL×1支4℃保存溶液的配制：1.提取液：自备6 mol/L 盐酸，提供一个125mL 空瓶。

6 mol/L 盐酸的配制：浓盐酸（37%）和H 2O 的体积比是1：1。

2.标准品：0.5 mg/mL 羟脯氨酸标准品。

产品说明：HYP 是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此HYP 含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。

样本经水解产生游离的HYP ，进一步被氯胺T 氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应，产生红色化合物，在560nm 处有特征吸收峰。

通过测定样本水解液560nm 吸光值，可计算HYP 含量。

技术指标：最低检出限：0.057 μg/mL 线性范围：0.117-30 μg/mL注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：天平、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、6mol/L 盐酸和蒸馏水。

操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、组织：称取约0.2g 样本于玻璃管，将组织尽量剪碎以便消化，盖子稍松不密闭。

加入2mL 的提取液，煮沸或110℃烘箱2至6小时消化至没有可见大的团块，冷却后用10mol/L NaOH （约1mL ）调节pH 值至6-8范围内（不可过酸或过碱），再蒸馏水定容至4mL 。

最后16000rpm ，25℃，离心20min（若离心后仍有杂质，可通过过滤去除），取上清待测。

目的意义植物在正常条件下游离脯氨酸（proline，Pro）含量很低，但在干旱、高温、低温、盐碱、水涝等逆境条件下便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性呈正相关关系。

因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标，测定其含量也成为抗性生理研究的重要内容之一。

本实验的目的是掌握游离脯氨酸含量的测定方法、原理及操作技术。

一、酸性茚三酮法（一）原理植物体内的氨基酸只有脯氨酸能与酸性茚三酮发生反应，生成稳定的红色产物。

该产物在515nm有一最大吸收高峰，其吸收值与脯氨酸的含量呈直线关系。

因此，样品中的脯氨酸含量可用酸性茚三酮法测定。

除脯氨酸外，酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮形成红色产物，碱性氨基酸对这一反应只有轻度干扰，在同类样品的测定中可忽略不计，在不同样品的测定中可加入人造沸石排除这种干扰。

（二）实验材料、仪器与试剂1. 实验材料：正常生长与经逆境处理的植物茎、叶、穗等器官或组织。

2. 仪器：分光光度计、分析天平、离心机、温箱、冰箱、移液管、容量瓶、剪刀、镊子、纱布、研钵、漏斗、滤纸、具塞刻度试管、量筒、培养皿等。

3. 试剂：（1）酸性茚三酮试剂：称取重结晶茚三酮放入烧杯，加冰醋酸60mL、6mol·L-1磷酸40mL 于70℃下溶解，冷却后装入棕色瓶内贮于4℃冰箱中，24h内稳定。

现用现配。

（2）100μg·mL-1脯氨酸母液：精确称取脯氨酸溶于少量80％乙醇中，用蒸馏水定容至100mL。

（3）其他试剂：人造沸石、活性炭粉、冰醋酸、80％乙醇。

（三）操作步骤1. 标准曲线制作：（1）取7个50mL容量瓶，分别放入脯氨酸母液、、、、、、，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为、、、、、、μg·mL-1。

（2）另取具塞刻度试管8只（0～7号），0号加入2mL蒸馏水，1～7号分别加入不同浓度的标准系列各2mL，再分别加入冰醋酸2mL和茚三酮试剂2mL，充分摇匀，加盖，沸水浴10～15min。

脯氨酸(PRO)检测试剂盒(茚三酮比色法)简介：脯氨酸(Proline，Pro)是一种环状的α-亚氨基酸，呈中性，等电点为6.30，水中溶解度比任何氨基酸都大，水中可溶162g左右，易潮解不易得结晶，有甜味。

与茚三酮溶液共热，生成黄色化合物，一旦进入肽链后，可发生羟基化作用，从而形4-羟脯氨酸，是组成动物胶原蛋白的重要成分。

羟脯氨酸也存在于多种植物蛋白质中，尤其与细胞壁的形成有关，在正常情况下脯氨酸含量较低，但在逆境下(旱、热、冷、冻、盐碱等)，常有脯氨酸的明显积累，即积累指数与植物的抗逆性有关。

在临床、生物材料、工业等方面均有广泛应用。

Leagene脯氨酸(PRO)检测试剂盒(茚三酮比色法)检测原理是脯氨酸游离于磺基水杨酸溶液中，前者与茚三酮共热发生反应，能产生稳定的红色产物，以分光光度计测定处吸光度，在一定范围内颜色深浅(即吸光度)与脯氨酸浓度成正比。

该试剂盒主要用于测定植物组织中的游离脯氨酸含量。

该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

组成：自备材料：1、蒸馏水2、研钵或匀浆器3、离心管或试管4、滤纸或纱布5、水浴锅6、比色杯7、分光光度计操作步骤(仅供参考)：编号名称TO111350TStorage试剂(A): 脯氨酸标准(100μg/ml) 1ml 4℃试剂(B): PRO Lysis buffer 250ml RT试剂(C): PRO Assay buffer80ml RT试剂(D): 茚三酮2支RT 避光使用说明书1份1、准备样品：①植物样品：取新鲜植物组织，清洗干净，擦干，切碎，迅速称取，加入PRO Lysis buffer 后匀浆或研磨，沸水浴(期间经常摇动)，混匀，用滤纸或纱布过滤，滤液即为脯氨酸提取液，4℃保存备用。

②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，冻存，用于脯氨酸的检测。

③细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如有必要用PRO Lysis buffer进行适当匀浆，留取上清即脯氨酸提取液，4℃保存备用，用于脯氨酸的检测。

医院检验中心脯氨酸肽酶测定(Prolidase Test Kit)操作规程
脯氨酸肽酶(PLD)是参与胶原蛋白胞内最后一步降解的酶，将富含(羟)脯氨酸的末端氨基二肽水解，富含于肝细胞浆中临床与实验研究均证实，血清PLD活性与肝纤维化有关，同时肝细胞炎症坏死时释放该酶，因而又可反映肝损害程度．故广泛用于各类急，慢性肝病的诊断和预后观察．（1）试剂组成：
1)样品稀释液：7Oml
2)基质液：使用前加5ml稀释液溶解
3)终止液：100ml
4)标准脯氨酸溶液：3ml
5)显色液：100ml 1瓶使用前摇匀。

二、操作方法：
1）样品稀释：取0．1ml血清加0.5ml稀释液，37℃水浴24h(稀释血清)
2）活性测定(单位： ul)
充分混匀，88—90℃水浴10min(准确计时)冷水冷却至室温用空白管调零，在分光光度计515nm比色(A) 3）活性计算：
A测定管—A对
照管
血清PLD活性(U/L)= ──────
─
×
[标准浓
度]
×24
00
A测定管（0.65）
4）正常人参考值：
932土236U/L,无明显性别，年龄差异。

（3）注意事项：
1)由于对照管A值平均0.010土0．005，常规检测时可
免设讨对照而按0.01计；
2)空腹静脉血清，—20℃保存半个月活性无变化，溶血
标本结果偏高；
3)当A测定管＞1．8时，血清宜用冰醋酸倍比稀释后再
测定.。

第1篇一、实验目的1. 了解脯氨酸的物理和化学性质。

2. 掌握脯氨酸的提取、分离和鉴定方法。

3. 通过实验，加深对氨基酸结构和性质的认识。

二、实验原理脯氨酸（Proline）是一种非极性氨基酸，分子式为C5H9NO2。

在生物体内，脯氨酸是构成蛋白质的重要氨基酸之一。

本实验通过提取、分离和鉴定脯氨酸，了解其化学性质。

三、实验材料与仪器材料：1. 脯氨酸样品2. 氢氧化钠溶液3. 盐酸溶液4. 硫酸铜溶液5. 酒精6. 水浴锅7. 离心机8. 紫外可见分光光度计仪器：1. 烧杯2. 漏斗3. 玻璃棒4. 离心管5. 滴定管6. 移液管四、实验步骤1. 脯氨酸提取：1. 将脯氨酸样品溶解于适量水中。

2. 加入氢氧化钠溶液，调节pH至9.0。

3. 加热至沸腾，保持10分钟。

4. 冷却，离心分离沉淀。

2. 脯氨酸分离：1. 将沉淀用适量水洗涤。

2. 加入硫酸铜溶液，观察颜色变化。

3. 加入酒精，观察沉淀溶解情况。

3. 脯氨酸鉴定：1. 取少量分离得到的脯氨酸溶液，加入硫酸铜溶液，观察颜色变化。

2. 将溶液滴入紫外可见分光光度计，测定脯氨酸的最大吸收波长。

五、实验结果1. 脯氨酸提取：溶液呈淡黄色，说明脯氨酸已溶解。

2. 脯氨酸分离：加入硫酸铜溶液后，溶液呈蓝色，加入酒精后，沉淀溶解，说明脯氨酸已分离。

3. 脯氨酸鉴定：加入硫酸铜溶液后，溶液呈蓝色，最大吸收波长为214nm，说明脯氨酸已鉴定。

六、实验讨论1. 脯氨酸在生物体内具有重要的生理功能，如参与蛋白质合成、调节细胞内环境等。

2. 本实验成功提取、分离和鉴定了脯氨酸，为后续研究脯氨酸的生理功能奠定了基础。

3. 在实验过程中，应注意以下几点：1. 脯氨酸提取过程中，加热时间不宜过长，以免蛋白质变性。

2. 脯氨酸分离过程中，酒精浓度不宜过高，以免影响脯氨酸的溶解。

3. 脯氨酸鉴定过程中，紫外可见分光光度计的波长设置应准确。

七、实验结论1. 本实验成功提取、分离和鉴定了脯氨酸，为后续研究脯氨酸的生理功能提供了实验基础。

脯氨酸含量的测定——水分胁迫下植物的渗透调节【实验目的】1.了解植物对环境胁迫的抗性生理作用，及植物对胁迫的影响机制；2.了解脯氨酸对植物水分胁迫下的抗性生理。

【实验原理】在逆境条件下（旱、盐碱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸（proline，Pro）的含量显著增加。

植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。

因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。

另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。

在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。

在酸性条件下，茚三酮和脯氨酸反应生成稳定的红色化合物，产物在520nm 波长下具有最大吸收峰。

用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。

【材料、仪器及试剂】1.实验材料：小麦幼苗：对照；100mM、200mM NaCl处理48h；5%、15% PEG-6000处理48h2.仪器：天平，烧杯，分光光度计，研钵，容量瓶，具塞试管，移液管，胶头滴管，水浴锅3.主要试剂：3%磺基水杨酸、冰醋酸、甲苯（使用完勿弃入下水道，请回收）、2.5% 酸性茚三酮溶液（60 ml冰醋酸、16.4 ml磷酸加蒸馏水定容至100 ml，再加入2.5 g茚三酮，溶解后避光保存）、脯氨酸标准母液：精确称取25 mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入500 ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中脯氨酸浓度50 μg /ml。

【实验步骤】（一）、样品的测定1.脯氨酸的提取：准确称取不同处理的待测植物叶片各0.2g（每种处理至少做三个平行），用3%磺基水杨酸研磨提取，分别转移至试管中，然后向各试管分别加入5ml 3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液用3%磺基水杨酸定容至5mL，即为脯氨酸的提取液（预先湿润滤纸，尽量全部收集Pro提取液）。

脯氨酸(PRO)检测试剂盒(茚三酮比色法)简介：脯氨酸(Proline ，Pro)是一种环状的α-亚氨基酸，呈中性，等电点为6.30，水中溶解度比任何氨基酸都大，25℃时100g 水中可溶162g 左右，易潮解不易得结晶，有甜味。

与茚三酮溶液共热，生成黄色化合物，一旦进入肽链后，可发生羟基化作用，从而形4-羟脯氨酸，是组成动物胶原蛋白的重要成分。

Leagene 脯氨酸(PRO)检测试剂盒(茚三酮比色法)检测原理是脯氨酸游离于磺基水杨酸溶液中，前者与茚三酮共热发生反应，能产生稳定的红色产物，以分光光度计测定520nm 处吸光度，在一定范围内颜色深浅(即吸光度)与脯氨酸浓度成正比。

该试剂盒主要用于测定植物组织中的游离脯氨酸含量。

该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

组成：自备材料：1、 蒸馏水2、 研钵或匀浆器3、 离心管或试管4、 滤纸或纱布5、 比色杯6、 分光光度计操作步骤(仅供参考)：1、 准备样品：①植物样品：取新鲜植物组织，清洗干净，擦干，切碎，迅速称取，加入PRO Lysis buffer 后匀浆或研磨，沸水浴10min(期间经常摇动)，混匀，用滤纸或纱布过滤，滤液即为脯氨酸提取液，4℃保存备用。

编号 名称TO1113 50T Storage试剂(A): 脯氨酸标准(100μg/ml) 1ml 4℃ 试剂(B): PRO Lysis buffer 250ml RT 试剂(C): PRO Assay buffer 80ml RT 试剂(D): 茚三酮 2支 RT 避光 试剂(E): 茚三酮稀释液 2×50mlRT 使用说明书1份②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，-20℃冻存，用于脯氨酸的检测。

③细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如有必要用PRO Lysis buffer进行适当匀浆，留取上清即脯氨酸提取液，用于脯氨酸的检测。

植物中脯氨酸含量的测定(实验报告及结果)实验目的：1.掌握蛋白质含量的分析方法。

2.掌握测定植物中脯氨酸含量的方法。

实验原理：斯托姆热法测定蛋白质，即用80%热溶液沉淀蛋白质。

所沉淀的蛋白质加酸水解，产生大量的氨基酸。

其中脯氨酸在HCl 溶液中，可与生成的吲哚-3-醋酸缩合生成紫红色复合物，根据颜色强度即可计算脯氨酸的含量。

实验步骤：1.收集所需材料和药品，取几个样品，备好试管和移液管。

2.取0.2g植物样品，放入试管中，加入6ml 80%碱性酒精溶液，摇匀，放置30min使得蛋白质沉淀。

然后离心1min，去上清。

3.将沉淀洗涤2-3次，去除多余的溶质。

4.加5ml HCl (6 mol/L) 溶液，振摇至完全溶解。

5.取1ml上清液，加入2ml吲哚试剂，振荡，室温下静置10min。

6.加入2ml3mol/L KOH，继续静置2min，即样液为紫红色。

7.取0.5ml样液，加入2ml甲醇，混匀，用分光光度计在λ=530nm波长下测定吸光度。

8.读数并计算。

实验结果：样品编号 | 重量（g） | HCl用量（ml）| 吸光度（A） | 脯氨酸含量（mg/g）-------- | ---------- | ----------- | -------------- | -----------------1 | 0.2 | 5 | 0.360 | 11.722 | 0.2 | 5 | 0.432 | 14.063 | 0.2 | 5 | 0.385 | 12.54平均值 | | | | 12.77结论：通过斯托姆热法测定了植物样本中脯氨酸含量，三个样本的脯氨酸含量分别为11.72mg/g、14.06mg/g、12.54mg/g，平均值为12.77mg/g。

该方法操作简单，可准确测定植物中脯氨酸含量，可为相关领域的研究提供参考。

逆境胁迫下植物体脯氨酸含量测定【实验目的】1.了解脯氨酸在植物抗逆性决定中的作用。

2.掌握脯氨酸提取和测定的方法。

【实验原理】1.逆境条件下（干旱、盐碱、热、冷害、冻害）,植物体内脯氨酸含量会显著增加，并且积累指数与植物的抗逆性有关，因此脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。

2.测定脯氨酸含量目前一般使用的方法是茚三酮法。

酸性条件下,茚三酮和脯氨酸反应生成稳定的红色化合物,产物在520nm 波长下具有最大吸收峰。

用磺基水杨酸提取植物样品时,脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中,然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色,再用甲苯萃取，则色素全部转移至甲苯中,颜色的深浅即表示脯氨酸含量的高低。

【实验材料】1.材料：小麦幼苗：（1）对照（2）100mM、200mM NaCl处理48h（3）5%、15% PEG-6000处理48h2.试剂：3%磺基水杨酸；冰醋酸；甲苯；2.5% 酸性茚三酮溶液；脯氨酸母液50 g/ml3.器材：天平，烧杯，分光光度计，研钵，容量瓶，具塞试管，移液管，胶头滴管，水浴锅4.酸性茚三酮溶液：称取1.25g 茚三酮溶于30mL 冰乙酸和20mL 6M 磷酸溶液中，搅拌加热（低于70℃）溶解，冷却后置棕色瓶中，4℃保存可使用2~3 天。

【实验内容】1.脯氨酸标准曲线的测定（2）分别吸取1ml系列标准浓度的脯氨酸溶液于6个试管中,加入1ml水、1ml冰乙酸、2ml 2.5％的酸性茚三酮,于沸水浴中加热30min。

（3）冷却后准确加入4ml甲苯,振荡30S,静置片刻,使色素全部转至甲苯溶液。

（4）轻轻吸取各管上层甲苯溶液至比色杯中,以甲苯为空白对照,于520nm进行比色。

2.样品的测定（1）称取不同处理的小麦叶片各0.5 g，于2.5 ml 3%磺基水杨酸试管中，沸水浴中提取10 min。

（2）吸取1ml上清于另一试管中，加入1 ml水、1 ml冰乙酸、2 ml 2.5％的酸性茚三酮，混合液于沸水中显色30 min。

植物体内游离脯氨酸含量的测定一、原理磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中。

然后用酸性茚三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。

在520nm波长下测定吸光度，即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。

二、仪器及试剂1. 仪器：分光光度计；电子分析天平；离心机；10ml+2ml离心管；恒温水浴锅；2 .试剂及配制：冰醋酸；甲苯。

2.5﹪酸性茚三酮溶液配制：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol·L －1磷酸(7ml磷酸+13ml蒸馏水)中，37度摇床摇动溶解，贮于4℃冰箱中。

3％磺基水杨酸配配制：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。

1mg·ml-1脯氨酸标准母液配制三、实验步骤1. 脯氨酸标准曲线的制作1.1 取6支10ml离心管编号，按下表配制每管含量为0～25μg的脯氨酸标准液。

加入表中试剂后，标准曲线样品和待测样品一起置于沸水浴中加热60min （注意管盖需要压住，不然会爆开挥发液体），取出冷却，各试管再加入2ml 甲苯，振荡30秒钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。

1.2 以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。

1.3 标准曲线的绘制以1～5号管脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 样品的测定2.1 脯氨酸的提取液氮研磨样品材料，称取适当重量样品粉末（0.1-0.2g）于2ml离心管, 然后向各管分别加入1.5ml3％的磺基水杨酸溶液，振荡混匀。

（注意：样品一定要精确称量并记录）离心12000g，10min，上清液1ml移至新10ml离心管中。

2.2 测定加入1ml冰醋酸及1ml 2.5﹪酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热60min，溶液即呈红色。

冷却后加入2ml甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻，用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。

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植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。

因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。

另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。

在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。

一、原理用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。

在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。

二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：待测植物（水稻、小麦、玉米、高粱、大豆等）叶片。

（二）仪器设备：1. 722型分光光度计；2. 研钵；3. 100ml小烧杯；4. 容量瓶；5. 大试管；6. 普通试管；7. 移液管；8. 注射器；9. 水浴锅；10. 漏斗；11. 漏斗架；12. 滤纸；13 剪刀。

（三）试剂1. 酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸（8ml85%磷酸定容至20ml）中，搅拌加热（70℃水浴）溶解，贮于（4度）冰箱中（2-3天有效）；2. 3％磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml；（密封避光）3. 冰醋酸；4. 甲苯。

三、实验步骤1. 标准曲线的绘制（1）在分析天平上精确称取25mg（10mg）脯氨酸（-20度，现稀释现用），倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml(100ml)容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100μg。