第三章 细胞生物学研究方法 ppt课件

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第一节 形态学研究方法 一、光学显微镜技术 二、电子显微镜技术 三、扫描隧道显微镜技术
第二节 细胞组分的分析方法 一、细胞组分的分离 二、细胞组分的化学染色 三、放射自显影技术 四、显微分光光度技术
第三节 细胞培养及细胞工程 一、动物细胞的分离及培养 二、植物细胞的培养 三、细胞工程 （一）细胞融合与细胞杂交技术 （二）单克隆抗体技术 （三）细胞显微技术
⑵荧光素标记抗体的方法 ①直接法：荧光素直接和第一抗体偶联。 ②间接法：荧光素先和第二抗体(抗第一 抗体的抗体)偶联，再与第一抗体作用。
5. 绿色荧光蛋白
green fluorescent protein GFP
⑴发光原理: 蓝色光 GFP 绿色荧光 ⑵特点: 可在光镜水平，对特异蛋白质等生物大
第四节 模式生物
Baidu Nhomakorabea
五、分子杂交技术
六、流式细胞技术
七、免疫学方法对细胞组分的分析
第一节 形态学研究方法
一、光学显微镜技术
（一）普通光学显微镜及其标本的制备 （二）荧光显微镜及其应用 （三）扫描激光共聚焦显微镜及其应用 （四）相差显微镜 （五）暗视场显微镜 （六）微分干涉显微镜 （七）荧光能量共振转移技术 （八）荧光漂白恢复技术
（二）荧光显微镜 (Fluorescence microscope) 1. 原理:
荧光分子在受到光照射后，可吸收特定波长的 短波光线，并发射出比原来吸收波长更长的光。
紫外光
可见光
红外光
short
λ
long
2.基本构造：
A 光源 B 二向色镜：反射短波光线，透过长波光线 C 一组滤光片：得到纯的激发光和发射光
D：分辨率 λ:光波的波长 n:介质折射率 α:物镜镜口角(标本在光轴的一
点对于物镜镜口的张角)
（2）孔径角：由标本上一点发出的进入物镜最边缘光线L和进入物镜
中心光线OA之间的夹角/2称为孔径角。
（3）数值孔径：令N·A = nsin (/2), 叫物镜的数值孔径。
数值孔径与显微镜的分辨率有密切关系，越短，NA越大，分辨率 越高。
（一）普通光学显微镜
1、构成
Olympus显微镜的结构图
①照明系统：光源 ②光学放大系统：
物镜、目镜、聚光器和 光阑
③机械装置：镜筒、
物镜转换器、镜臂镜座、 载物台、调焦螺旋
3、主要的性能参数
（1）分辨率：显微镜能分辨的最小距离，用D表示。显微镜的鉴别距
离越小，分辨率越高。 D=0.61λ/ nsin (/2)
分子进行定位及显示一些细胞超微结构。 ⑶应用: a.特异蛋白质等大分子的定位
b.观察过氧化物酶体
特异蛋白质生物大分子定位
载体(GFP基因＋待定位蛋白基因) 导入特定的细胞 荧光显微镜下观察
待定蛋白质在细胞内的位置分布
观察过氧化物酶体
GFP ＋过氧化物体内的酶（有定位信号） 导入不同细胞
荧光显微镜下观察各种细胞的过氧化物酶体
4、显微镜的几个光学特点
——制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65 ～ 1.78，所用 介质的折射率越接近玻璃的越好。
几种介质的折射率
——sinα/2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般 为0.05～0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。
——普通光线的波长为400 ～ 700nm，分辨力数值不会小于 0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm,因此显微镜的最大设计倍数 为1000X。
5、观察标本的制备： 取材
↓
固定
↓
脱水
↓
复水
包埋
↓
↓
染色
切片
↓
↓
脱水
脱蜡
↓
透明
↓
封片
↓
观察
第一步. 固定(fixation)
目的：使大分子交联而保持固定，不至在 后面过程中移位或丢失。
试剂：甲醛、戊二醛 机理：可与蛋白质的游离氨基形成共价键， 将邻近蛋白分子交联。
第二步. 脱水
第三步. 包埋（embed）
荧光显微镜光路图
3. 荧光的观察:
1. 自发荧光 某些天然物质本身能发出荧光，如叶绿
素。 2.二次荧光
非荧光性物质用荧光色素染色后，可产 生荧光（二次荧光），以便于进行观察 。
3.抗体荧光技术
带荧光标记的抗体与标本中的抗原结 合，这样就能通过抗体结合的荧光观察到 抗原。
4.绿色荧光蛋白
图示： 鼠主动脉平滑肌
目的：包埋使组织变得坚硬,便于切片。 试剂：蜡、树脂 机理：可进入细胞内，起支持作用。
第四步. 切片（section）
目的：切成薄片，便于切片黏附在载玻片上 进行染色。
仪器：切片机 切片厚度：1～10 m
第五步.染色（staining） 目的：使细胞成为可见. 方法： A.选择性染色 苏木精－细胞内核酸的分布 伊 红－细胞质染色 B.特异性染色 酶 + 底物 抗原 + 抗体
应用： 观察细胞形态 统计光密度来定量细胞内成分 三维重建
（四）相差显微镜
1. 1953年诺贝尔物理奖 2. 特点:
可用以观察活细胞。 3. 原理:
波长 颜色 振幅 亮度 速度 相位
⑴普通显微镜:
（三）激光共聚焦扫描显微镜
（Laser confocal scanning microscope, LCSM）
激光作扫描光源 扫描焦平面上样品，得样品切面像 载物台上微量步进马达使载物台上下移动,改变焦平面
得不同层次的切面图像 计算机图像三维重组获样品立体图像
"显微CT"
分辨率：因激光束波长较短，光束很细，所以共 焦激光扫描显微镜有较高的分辨率，约是普通 光镜的3倍。
第三章
细胞生物学研究方法
Chapter 3 Methods and Techniques in Cell Biology
生物学研究一般规律
Preparatory observe put forward theoretics
Refer to knowledge
Design control tests Collect data
的荧光染色。 核:blue 线粒体:green 肌动蛋白:red
200ng/ml ADM 处理BNL-CL2后细胞微丝骨架的荧光观察 对照组
4. 免疫荧光显微镜技术
（Immunofluorescence microscopy）
⑴原理: 荧光抗体与标本切片中组织或细胞的 抗原进行反应，在荧光显微镜下观察到明 亮的特异荧光。