X射线晶体衍射分析(X-ray Crystallography, X-ray Diffraction Methods)
梁毅
(武汉大学生命科学学院)
测定生物大分子三维结构的主要方法
z完整、精确、实时(动态)地测定生物大分子三维结构的主要研究对象包括核酸、蛋白质、寡糖、脂以及它们之间的复合物。
z直接测定生物大分子三维结构的主要实验方法有:
X射线晶体衍射分析(亦称X射线结晶学或晶体结构分析)、多维核磁共振(NMR)技术、电子晶体学（电镜三维重组）、扫描隧道显微技术(STM)和原子力显微技术(AFM)。
z伦琴（Röntgen）发现X射线（1895年）及其后劳埃（Laue）发现晶体的X射线衍射（1912年），从而开创了晶态物质结构研究的新纪元。
z1953年Perutz在当时的同晶置换原理上，发现了重原子同晶置换法可以解决生物大分子晶体结构测定中衍射的相位问题，从而X射线晶体衍射分析开始踏上了自己发展的伟大历程。
z在1957年和1959年Kendrew和Perutz分别获得了肌红蛋白和血红蛋白的低分辨率（6 Å和5 Å）结构，在此期间Watson和Crick共同建立了DNA双螺旋的结构模型。他们的伟大成就为分子生物学奠定了基础。
z上述4位科学家分别获得1962年度Nobel化学奖和生理或医学奖。
z从1957年到1967年的十年里，在溶菌酶结构之后，胰凝乳蛋白酶A、核糖核酸酶、核糖核酸酶S和羧肽酶等也分别获得了高分辨率的晶体结构，表明X射线晶体衍射分析已经成为一门成熟的学科。
z今天的生物大分子晶体学已经完全超越单纯晶体结构测定的本身，而是直接瞄准待测结构的生物大分子的功能，瞄准那些与功能紧密联系在一起的生物大分子复合物的晶体结构，如酶与底物(DNA聚合酶—DNA)、酶与
抑制剂(溶菌酶-(NAG)
3)、激素与受体
(人生长激素与其受体)、抗原与抗体(流感病毒神经氨酶-单克隆抗体)、DNA与其结合蛋白(TATA box与其结合蛋白)等。
z现在，生物大分子晶体学已被应用到测定由许多生物大分子组成的极其复杂的大分子组装体(Macromolecular assembly)的晶体结构，如组成细胞骨架的微管系统
(Microtubules)、由200多种不同的蛋白质组成的细菌鞭毛(flagella)和由60个不同的蛋白质分子和3条RNA链组成的分子量高达230万的核糖体等。其中核糖体大亚基的分析已达2.9埃分辨率，是当前X射线晶体结构分析的一个突破。
z现在，生物大分子晶体学已不再满足于静态晶体结构的测定，而追求与生物大分子发挥生物功能相伴随的动态晶体结构的测定。生物大分子及其复合体的结构不是刚性的，而是有柔性的，存在着在不同层次的不同自由度的运动，它们是生物大分子发挥生物功能的基础和条件。另一方面，生物大分子发挥功能的过程就是和其他分子相互作用的过程，也是构象变化的过程．因此生命的结构必然是运动的结构，晶体结构分析也必须分析晶体结构的运动。
z那么，生物大分子在晶体状态下的结构是否反映了在有机体内的真实结构?
z回答是肯定的。实验结果表明，大部分生物大分子的晶体结构(crystal structure)接近于其用核磁共振技术测得的溶液结构(solution structure)。
z综上所述，X射线晶体学可在原子或接近原子的水平上分析蛋白质的精细三维结构，并适用于研究各种大小蛋白质的结构，甚至可以测定全病毒和核糖体的结构。晶体结构提供的是静态（在一定程度上也表现出动态），但是极为精确的一个个蛋白质分子堆积于晶体中的画面。
z X射线晶体衍射曾经是蛋白质结构测定的唯一手段，并且在现在和可见的将来仍将是原子水平上解析蛋白质结构的最主要和最有效的手段。
生物大分子晶体结构分析步骤z第一步克隆、表达、纯化：解析蛋白质晶
体结构的前提是制备均一的蛋白质样品并获得晶体。因此获得表达量高，纯化效果好的蛋白对后续步骤，特别是结晶起到及其重要的作用。
z第二步结晶：在大多数情况下，蛋白质结晶是工作的瓶颈，需要通过大量的条件筛选和优化以使蛋白质分子间的弱相互作用促使蛋白质分子形成高度有序的晶体而不是随机聚合形成沉淀。
z第三步数据收集及处理：通常利用（单波长）X射线光束照射在一定角度范围内旋转的蛋白质晶体，同时记录晶体对X光散射的强度。
z这些强度可转换为结构测定中的结构因子的振幅（|F(hkl)|）。此外, 在Laue法中, 晶体通常保持静止而使用连续X光波长（白光）收集数据。
z第四步相角的测定：结构因子的振幅（|F(hkl)|）及相角（α(hkl)）是物理上相对独立的量。由于结构因子相角的全部信息在收集数据时丢失, 因此必须通过其它途径来得到它们的信息。
z第五步相角的改进（优化）：电子密度图的质量及其后的可解释性主要决定于相角的准确性。有的情况下采用晶胞中不对称单位中的等同部分（例如，一个以上的等同分子）的电子密度平均，有可能大大地改善误差较大的起始相角。
z第六步电子密度图的解释：相位确定后,可开始计算电子密度图。若从电子密度图能跟踪出肽链走向和分辨出二级结构（如基于高分辨率的数据，通常这意味着衍射数据的分辨率至少达到3.5 Å），则可能推出多肽链的三维折叠方式。
z进而根据氨基酸序列，就可能构建出原子坐标形式的蛋白质结构模型。
z第七步修正：考虑到已建立的立体化学资料（如键长，键角等）的限制，根据X射线衍射数据对初始的蛋白质分子模型进行修正。
z第八步：结构的描述和与功能关系的研究。
结晶方法和技术
z汽相扩散法（Vapour diffusion）:微量蒸气扩散法主要是通过在一个封闭体系内，在能使某种蛋白质结晶的较高沉淀剂浓度的溶液与含有较低沉淀剂浓度的蛋白质溶液之间发生蒸汽扩散，最后两者达到平衡，蛋白质溶液内沉淀剂浓度逐渐增加使得蛋白质的溶解性降低，达到过饱和析出而结晶。
z这种方法现在使用最为广泛，可以分为悬滴法，坐滴法和三明治法。
