第九章_细菌类疫苗2013

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第二节 细菌灭活疫苗
基本流程 菌液
灭 活
灭活菌液
+
化
佐剂
配置
原料
乳
分装和保存
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灭活疫苗的生产工艺与检定 1. 菌种检定与制备 1）菌种检定：包括 培养特性、血清学特性、毒 力试验、抗原性试验、免疫力试验
制苗用菌种多数为毒力强、免疫原性优良的菌株，通常使用1-3个 品系，均由中国药品生物制品检定所或中国兽药监察所传代、鉴定、 冻干保存和供应。 各种用于制造菌苗的菌种应按规定定期复壮，并进行形态、培 养特性、菌型、抗原性和免疫原性鉴定，合格菌种准许用于制苗。
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（4）结合杆菌抗药性 伴随着结核病回升的另外一个问题是抗药性的 产生，多重抗药性的发生率也越来越高，研制 和开发有效的结合新疫苗势在必行。
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2）结核杆菌的病原学 ①革兰氏阳性，含分枝酸，具有抗酸性，胞壁 含大量脂质，有较强的抵抗力 ②灭菌方法 ③具有免疫佐剂活性
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3）结核疫苗——卡介苗的生产工艺与检定 卡介苗（BCG）是牛型结合杆菌经培养后，收 集菌体，加入稳定剂冻干后制成的，用于预防 结核病 ①菌种 卡介菌D2PB302菌株 ②培养和收集 生产用培养基采用苏通马铃薯培养基、胆汁马铃薯培 样基或液体苏通培养基，搜集菌膜压干，低温研磨， 加入稳定剂，制成原液。
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2）百日咳死疫苗的生产工艺与检定 ①菌种 生产用菌种采用百日咳Ⅰ相含1型、2型、和3 型凝集原的菌株。 ②培养方法 固体培养采用半综合碳琼脂培养基，也可发酵 生产。
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③原液检定 浓度测定、镜检、血清学试验、无菌试验、特 异性毒性试验、效价测定。 ④原液保存 2~8℃，有效期3年 ⑤配合稀释及分装 按原液中具有1、2和3型菌株的配比混合，也 可制成百白破三联疫苗（百日咳、白喉、破伤风）
表 几种灭活菌苗的灭活方法
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5 浓 缩 为提高某些灭活菌苗的免疫力，在培养过程中采取提高 菌数的基础上，再通过浓缩方法达到目的。
常用的浓缩方法：氢氧化铝胶吸附沉淀法 离心沉降法 羧甲基纤维沉淀法
以上方法可使菌液浓缩一倍以上。
此外，有些细菌在生长过程中产生分子量小的可溶性抗原（如猪丹 毒杆菌产生的糖蛋白）也可经氢氧化铝吸附浓缩；将破伤风脱毒液按盐 酸—食盐法处理，以作进一步精制成提纯破伤风类毒素。
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6. 原液检定及保存： 浓度测定：按“中国细菌浊度测定标准”测定浓度 镜检：涂片染色，至少观察10个视野，应菌型典型， 无杂菌 凝集试验：血清型定型凝集试验，应呈阳性反应 无菌试验: 需氧菌、厌氧菌及真菌试验应阴性 免疫力试验： 原液保存：（2-8℃，3-4年有效）
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7.配苗及分装 由于灭活菌苗所用的佐剂不同，所以配苗方法也不 相同。
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（三）浓缩
为提高某些弱毒菌苗的免疫效果，可进行浓缩，以提高单位活菌数，常用 的依缩方法有吸附剂吸附沉降法、离心沉降法等，如于猪丹毒菌液内加入 0.2% ～0.25%羧甲基纤维素(CMC)进行浓缩，也可用离心沉淀浓缩。浓缩 菌液应抽样作纯粹、活菌数等检查。
（四）配苗与冻干
经检验合格的菌液，按规定比例加入保护剂配苗，充分摇匀后随即进 行分装，分装量必须准确。 分装好的菌苗迅速送入冻干柜进行预冻、真空干燥，冻于完毕后立即 加塞、抽空、封口，移入冷库保存，并由质检部门抽样检验。
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（4）伤寒Ty21a口服减毒活疫苗 德国学者将野生型菌株Ty2经化学突变剂亚硝 基胍处理而获得的突变株，在提供较高免疫保 力的同时具有很高的安全性。
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3.百日咳疫苗 1）概述 由百日咳杆菌引起的急性呼吸道传染病，主要 侵犯婴幼儿，全病程较长，可持续几个月，故 名百日咳。百日咳菌可分四种相变：Ⅰ相菌毒 力最强，有免疫原性；Ⅳ相毒力消失，无免疫 原性；Ⅱ、Ⅲ相菌介于Ⅰ、 Ⅳ之间。
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①菌株 我国现用两个菌株生产疫苗： 国际通用Ty2株 国内代表株 ②培养基及培养方法 采用马丁琼脂、肉汤琼脂或其他经批准的培养 基，主要采用固体培养法，也可进行发酵生产 接种后35~37℃培养18~24h。
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③成品检定 鉴别试验、外观、化学检定、无菌试验、异常 毒性试验、菌形及纯度检查 ④疫苗规格及有效期 每安瓿瓶5ml，每人用剂量含伤寒菌6×107~ 3×108，2~8℃避光保存和运输，有效期1.5 年。
经纯粹检查及有关的检查合格者即可作为种子液。 种子液通常在 0～ 4C可保存 2个月，在保存期内可作为菌苗生产的批
量种子使用。
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（二）菌液培养
按1%～3% 量将种子液接种于培养基，然后依不同菌苗要求 进行培养。 如猪丹毒弱毒菌须在在深层通气培养中加入适当植物油作消 泡剂，通入过滤除菌的热空气进行培养制造菌液 如人用炭疽活疫苗、卡介苗经固体表面培养完成后须按规定 要求将菌苔洗下制成菌液 菌液于0～4C暗处保存，待抽样经纯粹、活菌数等检查合格 后使用。
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第三节 细菌减毒活疫苗 一、生产工艺与检定
（一）菌种与种子
弱毒菌种多系冻干品，由中国药品生物制品检定所或中国兽药监察所 菌种使用前应按规程规定进行复壮、挑选，并作形态、特性、抗原性
传代、鉴定、保存与分发，少数由国家指定单位鉴定、保存与供给。
和免疫原性鉴定，符合标准后方可用于制苗。
将检定合格的菌种接种子于规定的培养基，按规定的条件增殖培养，
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流程图1——细菌疫苗制造工艺流程
细菌分离 鉴定 菌种
蛋白质、肉浸液等原料 配置、灭菌 培养基 活化 种子 培养 菌 液 原 料
减毒 弱毒菌种
原 料 配制 灭菌 佐剂
灭活菌液
灭活
菌苗原液
配苗 分装、冻干
配制 灭菌 保护剂
配苗、乳化
分装 检验
灭活疫苗
检验
活疫苗
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二、常用细菌减毒活疫苗 炭疽疫苗 结核疫苗 鼠疫疫苗
配苗和分装：应充分混匀，及时塞塞、贴签或印 字 8.成品检定 按规程进行
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常用灭活细菌疫苗 1.霍乱疫苗 （1）霍乱简介
由霍乱弧菌引起的烈性肠道传染病，霍乱弧菌在小肠分泌 霍乱毒素（cholera toxin），引起腹泻及其他症状。
（2）抗原
鞭毛抗原：不耐热，无分型意义，有免疫保护作用。 菌体抗原：主要成分为脂多糖（LPS），耐热，根据其抗 原决定基可分为 200多钟血清型，O1和O139为流行 血清型。
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②培养及收获 生产用培养基采用牛肉汁琼脂或其他批准培养 基 ③半成品配置及分装 用灭菌的50%甘油将原液稀释成每ml含菌数 4×109 ④成品检定 鉴别试验、外观、纯菌试验、特异性毒性试验 活菌数测定、浓度测定、效力测定
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⑤疫苗规格及有效期 安瓿瓶装，10人份含菌2×109， 2~8℃避光 保存运输，有效期两年。 （3）目前人用炭疽疫苗的缺点 ①毒力不稳定 ②采用划痕接种，免疫效果不均一 ③副反应较大 ④免疫保护力持续时间比较短
第九章 细菌类疫苗
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第一节 概述
细菌类疫苗
定义：用细菌、支原体、螺旋体或其衍生物 制成，进入人体后使机体产生抵抗相应细菌 能力的生物制品——细菌类疫苗 种类： （1）减毒活疫苗 （2）灭活疫苗 （3）亚单位疫苗或成分疫苗
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（3）亚单位疫苗或成分疫苗
主要指在细菌培养液中提取，用化学方法脱毒的类
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③抗原 菌体抗原：多糖组分，耐热性强。 荚膜抗原：由质粒决定，可以抵抗细胞的吞噬 作用，引起感染，对动物没有免疫保护力，不 能作为疫苗。 毒素抗原：水肿因子（EF）；致死因子（LF） ；保护性抗原（PA）；单独组分无毒性，成对 结合才能获得毒素活性。
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3）炭疽疫苗 （1）目前人用炭疽疫苗 ①减毒活疫苗 ②铝胶培养上清液疫苗 （2）炭疽疫苗的生产工艺与检定 ①生产用菌株 人、兽用的炭疽活疫苗生产均采用无荚膜具毒 素（cap-tox+）菌株，我国采用的的A16R菌 种均由药品生物制品检定所分发。
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（3）目前最常用的霍乱疫苗 口服霍乱灭活全菌体+重组霍乱毒素B亚单位 重组霍乱毒素B亚单位（sBS）具有黏膜免疫 佐剂特性，该疫苗安全有效且无明显不良反 应，保护力持久。
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2.伤寒疫苗 （1）概述 由伤寒沙门杆菌引起的急性全身感染，患者出 现高热，胃肠炎，败血症等。含有三类抗原: LPS，荚膜多糖(vi)，鞭毛抗原，耐药性比较严重。 （2）生产工艺与检定 全菌体死疫苗分三种，按杀菌剂不同可分为丙 酮灭活苗，加温加酚灭活苗，甲醛灭活苗。
种子液通常保存于2-8C冷暗处，不得超过规程规定 的使用期限。
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2.生产方法 （1）固体培养法：克氏瓶、茄形瓶 （2）液体静置培养法、液体深层通气培养法 3.细菌采集 （1）固体培养法采集时逐瓶检查，污染杂菌 者废弃。 （2）液体培养法采集时应做纯菌试验，确定 无杂菌生长。
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4. 杀菌、脱毒（灭活） 杀菌剂对疫苗的质量至关重要，通常根据细菌的特性加入最 有效的灭活剂，我国多用甲醛，终浓度不超过1%。 杀菌检查：取样接种于不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基、琼脂 斜面及碱性琼脂斜面各一支，37℃培养5 d，应无本菌生 长。
1、炭疽疫苗 1）概述：
定义：由炭疽杆菌引起的人畜共患的一种急性传染病。 特点：潜伏期3-5d。临床表现为皮肤、肺部、脑膜和肠
道等处的急性感染。
临床分型： ①体表感染型
②消化道感染型 ③呼吸道感染型
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2）炭疽菌的病原学 ①革兰氏阳性，个体最大的杆菌之一，呈竹节 状，无鞭毛，在机体内或特殊培养条件下能形 成荚膜。 ②营养要求不严，需氧，最适温度34~37℃ 炭疽杆菌的营养细胞抵抗力不强，芽孢抵抗力 强，过氧乙酸、高锰酸钾、和甲醛对芽孢的杀 灭力较强。
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灭活疫苗的生产工艺与检定
1. 菌种检定与制备 2）菌种制备 菌种启开：接种于适宜的培养基上，37±1°C一代培养； 扩量转种：一代菌种的扩量接种，于37±1°C二代培养。