血浆蛋白质醋酸纤维膜电泳要点

生物化学实验醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白质一、实验目的掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质的原理和方法二、实验原理蛋白质是两性电解质。

在pH值小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH值大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。

血清中含有数种蛋白质，它们所具有的可解离基团不同，在同一pH的溶液中，所带净电荷不同，故可利用电泳法将它们分离。

血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸祖坟、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。

由表可知，血清中5种蛋白质的等电点大部分低于pH值7.0，所以在剪下，分别用0.4mol/L NaOH溶液浸洗下来，进行比色，测定其相对含量。

也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，测定其相对含量。

肾病、弥漫性肝损害、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、慢性炎症、妊娠等都可以使白蛋白下降。

肾病时α1、α2、β球蛋白升高，γ-球蛋白降低。

肝硬化时α2、β-球蛋白降低，而α1、γ-球蛋白升高。

三、实验器材1、醋酸纤维薄膜（2cm*8cm，厚度120μm）2、人血清；3、烧杯及培养皿数只；4、点样器；5、竹镊子；6、玻璃棒；7、电吹风；8、试管六只；9、恒温水浴锅；10、电泳槽；11、直流稳压电泳仪；12、7220型分光光度计；13、剪刀四、实验试剂1、巴比妥-巴比妥钠缓冲液：取两个大烧杯，分别称取巴比妥钠和巴比妥溶解于500ml 蒸馏水中；2、染色液，可反复使用；3、漂洗液：取乙醇45ml ，冰醋酸10ml ，混匀；4、浸出液：0.4mol/L NaOH 溶液；5、透明液：取冰醋酸25ml 、无水乙醇75ml ，混匀。

五、实验操作1、准备和点样取一条醋酸纤维薄膜，浸入缓冲液中，完全浸透后，用镊子轻轻取出，将薄膜无光泽的一面向上，平放在干净滤纸上，再放一张干净滤纸吸取多余的缓冲液；用玻棒蘸取少量血清，涂在点样器上，然后轻轻于距纤维薄膜一端1.5cm 处接触，样品即呈一条状突于纤维膜上。

实验一血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳(doc)一、实验目的：了解蛋白质在醋酸纤维素薄膜电泳中的电泳特性，掌握电泳操作技能。

二、实验原理：血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳是一种基于电场作用对蛋白质进行分离的方法。

它是将样品蛋白质通过电泳方式在薄膜上进行分离，通过比较蛋白质的电泳迁移率来判断不同蛋白质的分子量大小。

血清蛋白质主要是血清白蛋白、球蛋白和纤维蛋白，分子量范围从14 kDa到850 kDa 不等。

在醋酸纤维素薄膜电泳中，蛋白质受到电场力的作用下，向电极方向迁移，带电的蛋白质分子在电场力和阻力的作用下进行不断运动，大分子运动缓慢，小分子运动快，不同分子量的蛋白质在电泳中迁移率不同，可以根据迁移率区分出不同的蛋白质成分并计算其分子量。

三、实验步骤：1.制备0.9%琼脂糖凝胶电泳缓冲液：取700ml去离子水，加入1.68g粉末琼脂糖，微弱的加热搅拌至完全溶解后添加1ml 1M Tris-HCl（pH6.8），0.2ml 10%（w/v）SDS，0.1 ml 10%（w/v）溴酚蓝溶液，搅拌均匀，得到电泳缓冲液。

2.制备凝胶：取0.9%琼脂糖凝胶电泳缓冲液120ml，加入3ml 10%（w/v）APS和0.2ml TEMED，充分混合，倒入成型板中，插入2个酯化的平板梳子，待凝胶完全固化后去除梳子。

3.制备血清样品：血清样品先离心5min，将上清离心液保存备用，调整浓度至3mg/ml，加入适量的样品缓冲液，并加入0.1%（w/v）溴酚蓝染料，离心去除蛋白质沉淀，取上清液。

4.醋酸纤维素薄膜电泳：将凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液至凝胶表面，将样品用枪头均匀加到凝胶的对侧。

将电泳槽封好，接上电源，电压保持在120 V，电泳时间约为1.5小时。

电泳完成后取出凝胶。

5.染色：将凝胶放入染色液中，室温下摇晃染色1h，去除染色液，在清水中冲洗几次，静置清水中至少30min。

6.成像：将凝胶放在扫描仪上进行成像，选择合适的波长进行成像。

血浆蛋白质醋酸纤维薄膜电泳
1 蛋白质醋酸纤维薄膜电泳技术
蛋白质醋酸纤维薄膜电泳技术是一种实验室研究蛋白质结构，用来表征蛋白质特性和活性的主要技术，它是充分利用了蛋白质的电性质而研究的。

蛋白质醋酸纤维薄膜电泳技术采用0.5 mmol/L醋酸铵溶液，在醋酸诱导的恒电场作用下，蛋白质被扩散并移动到纤维膜的不同位置，最终被固定于纤维膜表面,从而得到不同蛋白质的离子谱条纹或痕迹。

2 蛋白质醋酸纤维薄膜电泳步骤
蛋白质醋酸纤维薄膜电泳步骤主要有四步：
（1）准备蛋白质样品。

这一步主要包括从物种中获取样品，分离和纯化蛋白质，并将其准备成细胞质、细胞培养液中蛋白质悬浮液或血浆蛋白质样品等。

（2）将蛋白质样品和电泳准备液一起加入到电泳槽中，在0.5 mmol/L醋酸铵溶液中进行电泳，并在空气中脱乳酶，这样蛋白质就可以移动到纤维薄膜上。

（3）在诱导的恒电场和低温条件下及时冷却，有利于蛋白质的固定。

（4）当电泳结束后，利用带有斑点和条纹的纤维薄膜将电泳图像向纸张上传送及处理，最终得到电泳图谱，即从电泳中获得蛋白质离
子谱数据，随后可用作分析和解析蛋白质、细胞等活动物质的机理和
功能。

3 应用
蛋白质醋酸纤维薄膜电泳技术已被广泛的应用在基础科学研究及
药物研究，病原体检测，生物变性研究，基因组研究，分子进化研究，IgA抗体和血清蛋白谱等领域。

它可以获得大量精确的蛋白质数据，用
于衡量及分类蛋白质的结构和活性，可以帮助揭示蛋白质与病原体、
免疫反应或细胞内信号转导之间的关系。

由此可见，蛋白质醋酸纤维
薄膜电泳技术在生物学研究中非常重要，是高精度优质的分析手段。

实验一血清蛋白电泳(醋酸纤维薄膜法)[目的]了解电泳法分离蛋白质的原理、操作方法及临床意义。

[原理]带电荷的蛋白质，在电场中向着与其所带电荷电性相反的电极泳动称为电泳。

血清中各种蛋白质的等电点不同，但大都在pH7以下，若将血清置于pH8.6的缓冲液中，则这些蛋白质均带负电，在电场中都向阳极移动。

由于各种蛋白质在同一pH环境中所带负电荷多少及分子大小不同，所以在电场中向阳极泳动速度也不同。

蛋白质分子小而带电荷多者，泳动速度快；反之，则泳动速度慢。

因此可将血清蛋白质依次分为清蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白、b-球蛋白和g球蛋白五条区带，经染色可计算出各血清蛋白质含量的百分数。

醋酸纤维薄膜电泳具有微量、快速、简便及分辨率较高等优点，广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白、同工酶的分离和测定。

[仪器与材料]1．仪器：电泳仪、电泳槽、分光光度计或光密度仪。

2．材料：醋酸纤维薄膜、培养皿、滤纸、镊子、点样器、直尺、铅笔、剪刀等。

[试剂]1．巴比妥—巴比妥钠缓冲液(pH8.6，m=0.06)。

称取巴比妥2.21克和巴比妥钠12.36克，溶于500毫升蒸馏水中，加热溶解。

待冷至室温后，再加蒸馏水稀释至1000毫升。

2．染色液。

称取丽春红S0.4克及三氯醋酸6克；用蒸馏水溶解，并稀释至100毫升。

3．漂洗液。

3%(V／V)醋酸溶液。

4．透明液。

取无水乙醇75毫升和冰醋酸25毫升混匀备用。

5．0.4mol／L氢氧化钠溶液。

6．40%(V／V)醋酸溶液。

[操作]1．薄膜的准备：取醋纤薄膜(2厘米*8厘米)在毛面的一端约1.5厘米处，用铅笔轻划一直线，表露点样位置并编号。

然后将此薄膜置于巴比妥缓冲液中浸泡，待充分浸透(即膜条无白斑时)后取出，用洁净滤纸轻轻吸去表面的多余缓冲液。

2．点样。

取少量血清置于普通玻璃板上，用点样器的钢口蘸取血清(约3~5ml)，随后将钢口垂直“印”在点样线上，待血清渗入膜后移开点样器。

点样应注意，要适量、均匀和垂直，并避免弄破薄膜。

实验五血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳定量分析【目的要求】1.掌握血清蛋白电泳及其比色定量的基本原理、操作程序、技术要领和影响定量结果的主要因素及其排除2.熟悉血清蛋白醋纤膜电泳图谱的含义及临床意义。

3.了解血清蛋白醋纤膜电泳图谱的透明和扫描定量分析。

【实验原理】血清中各组分蛋白质的等电点均低于pH8.6，将其放在醋纤薄膜载体上，置于有pH8.6的电极缓冲液通过的电场中作电泳时都带负电荷、向正极移动。

由于它们等电点不同，荷电量不等，分子大小各异，在电场中移动速度不同而被彼此分离。

电泳膜经染色、漂洗后，便呈现出五条不连续的区带蛋白电泳图谱，从正极端起，依次为：清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白。

由于蛋白质含量与吸附的染料有一定正比关系，据此，剪下各条谱带，用碱液洗下蛋白质吸附的染料，进行比色分析，即可求出血清样品中各区带蛋白质的百分含量。

此外，也可对透明处理过的电泳图谱进行扫描分析，依据扫描曲线中各区带的面积与总面积之比，亦可求算出各区带蛋白质的百分含量。

【实验准备】一、器材1.电泳仪和醋酸纤维薄膜电泳槽2.醋酸纤维薄膜（8.0×2.0 cm）3.721分光光度计4.万用电表5.加样器、无损伤薄膜镊、铅笔、滤纸、染液缸、漂洗缸、载玻片等6.试管（10cc）及试管架二、试剂1.pH为8.6，离子强度0.06的巴比妥电极缓冲液称取巴比妥钠12.76g，巴比妥1.66g，加水溶解并定容至1000ml即成。

2.氨基黑10B染色液取氨基黑10B 0.5g溶于50ml甲醇中，再加入冰醋酸10ml，蒸馏水40ml。

3.漂洗液用95%乙醇45ml加冰醋酸5ml、蒸馏水50ml混匀，室温贮存。

4.0.4mol/L NaOH溶液5.透明液：A液：15ml冰醋酸+85ml 95%乙醇；B液：25 ml冰醋酸+75ml 95%乙醇。

【实验操作】一、电泳详细操作步骤及要求见Ⅰ-03常规电泳技术训练。

醋酸纤维薄膜电泳法别离血清蛋白目的和要求把握醋酸纤维薄膜电泳的原理及操作方式原理带电质点在电场中向着反向电极移动的现象称为电泳，其移动方向及速度取决于本身所带电荷的性质和数量、电场强度和溶液pH等因素。

蛋白质分子在溶液中的电泳是因其分子具有一些游离的可解离基团如-COOH、-NH2、-OH等，因此在某种pH值溶液中蛋白质分子带有必然的电荷。

混合蛋白样品中由于各蛋白质的等电点不同，在同一pH溶液中所带的电荷性质及电荷数量不同，因此在电场中各类蛋白质泳动的方向和速度也不同，从而使蛋白质混合样品得以别离。

血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白等，其氨基酸组分、立体构象、相对分子质量、等电点及形状等均有所不同。

由下表可见，血清中5种蛋白质的等电点大多低于，在的缓冲液中都电离成负离子(羧基解离)，故在电场中均向阳极移动。

蛋白质种类等电点(pI) 相对分子量(Mr)清/白蛋白α1-球蛋白α2-球蛋白β-球蛋白γ-球蛋白~ 69 000200 000300 00090 000~150 000 156 000~300 000在必然范围内，蛋白质的含量与结合的染料量成正比，故可将各蛋白质区带剪下，别离用mol/L NaOH溶液浸洗下来，通过比色法或将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，以测定特定电泳区带的蛋白质相对含量。

本实验采纳的醋酸纤维薄膜电泳法是以醋酸纤维薄膜为支持物。

醋酸纤维素是将纤维素的羟基乙酰化后形成的纤维醋酸酯，将其溶于有机溶剂(如丙酮、氯仿、乙酸乙酯等)后于聚乙烯材料上涂成均匀的薄膜，待溶剂蒸发后即可。

该膜具有均一的泡沫状构造，有强渗透性、其厚度约为120 μm 。

醋酸纤维薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高、对样品无拖尾和吸附现象等优势，目前已普遍应用于血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白、脂蛋白、结合球蛋白和同工酶的别离及测定。

操作步骤㈠预备醋酸纤维薄膜的润湿和选择：将薄膜裁成8×2cm状，使其漂在缓冲液液面上(假设迅速湿润，整条薄膜一致而无白点，那么说明薄膜质地均匀，可用于电泳实验)，然后用竹夹/镊子轻轻地将薄膜完全浸入缓冲液中，待薄膜完全渗透后利用(约。