高效液相色谱仪及固定相、流动相PPT

仪器分析课程讲义
第四节 高效液相色谱仪
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目录
高效液相色谱仪 高效液相色谱的固定相和流动相
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6.2 高效液相色谱仪
输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据处理系统
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一、输液系统
1．贮液器 贮液罐的材料应耐腐蚀，对溶剂呈惰性，
容积约为0．5—2．0L； 贮液罐放置要高于泵体； 使用过程贮液罐应密闭； 溶剂在放入贮液罐之前必须经过0．45um
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高压泵按其性质可分为恒压泵、恒流泵两类
1）往复式柱塞泵： 恒流 泵； 易于更换溶剂，适用于梯 度洗脱但有脉冲波动，可 以加一阻尼器抑制脉冲。
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2）气动放大泵： 恒压泵 液缸体积大，更换流动相 不方便，不便于梯度洗脱， 无脉冲、稳定流量的输出, 现多用于装柱。
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二、进样装置
a. 停留进样装置：
许多有机化合物，特别是芳 香族化合物、受紫外光激发 后能够辐射出荧光。
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高灵敏度(比紫外检测器高两个数量级，达 10-11g.ml-1)
高选择性; 线性范围窄； 测量中不能使用抑制、吸收荧光的溶剂； 对不产生荧光的物质，可使其转变成荧光
物质；
广泛应用于生物化工、制药、食品和环境 监测中.
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5. 电导检测器（electrical conductivity detector）
b. 缺点：不能承受高压，须停流进样； 无法取得精确的保留时间
b. 高压定量进样阀：（六 通阀进样装置）
c. 优点：进样准确，重 现性好，适于定量分析
d. c.自动进样器：计算机
控制，适合大量进样。
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三、高效分离柱 色谱柱是实现分离的核心部件。发展趋 势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
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常规液相色谱柱 1～6 mm，10～50 cm。 微孔填充柱 0.5-1mm 毛细管柱 30-50µm
滤膜过滤。
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2．脱气装置
作用：脱去流动相中的溶解气体。
(1)吹氮脱气法 (2)加热回流法 (3)抽真空脱气法 (4)超声波脱气法 (5)在线真空脱气法(on—1ine degasser)
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3、 高压输液泵 输送流动相 压力：150～350×105 Pa 作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到
色谱系统。 输液泵的稳定性直接关系到分析结果 的重复性和准确性。
属电化学检测器，是离子色谱法中应用最 为广泛的检测器
作用原理：根据物质在某些介质中电离后 所产生的电导变化来测定电离物质的含 量。
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五、液相色谱法固定相
1. 固定相的形状 （1）全多孔型
最初由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多 孔球体 100μm的大颗粒，表面涂渍固定液。 传质速度慢，柱效低。 现采用10μm以下的小颗粒 。
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3.液-液色谱固定相
惰性载体：硅胶，无机氧化物、高分子 聚合物、脲醛树脂等，多为3—10um的全 多孔微球。
固定液：正相： 氰基柱、胺基柱等 反相 : 烷基柱、苯基柱。
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4. 化学键合固定相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定 相，一般用硅胶作为基体。
a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡i—C d. 硅氮键型： ≡Si—N
装柱方法：有干法和湿法，按粒度20μm 划分。
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柱温控制
下列几种情况需要控制柱温： 法定标准分析方法中，要求保留时间具
有再现性； 必须通过改变柱温来提高分离效率； 对高分子化合物或黏度大的样品； 对一些具有生物活性的生物分子； 对一些组成复杂的样品，使用二维色谱
技术。
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四、液相色谱检测器 1.紫外检测器: 应用最广，对大部分有机化合
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（2）表面多孔型(薄壳型微珠)
30～40μm的玻璃微球，表面附着一 层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。
表面积小，传质速度快，但柱容量低；
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2.液-固吸附固定相 极性：硅胶、氧化镁、分子筛 等； 非极型：高聚物微球、石墨化碳黑、聚合
物包裹固定相。 结构类型：全多孔型和薄壳型； 粒度：5～10 μm；
物有响应。 作用原理：被分析试样组分对特定波长紫外
光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关 系遵守比尔定律。
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特点：
灵敏度高，可达10-9g.mL-1； 线性范围高； 可用梯度洗脱； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 不适用于对紫外不吸收的试样； 紫外光不透过的溶剂不能用（苯等）。
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2. 光电二极管阵列检测器
， 称为正相液液色谱法; 4. （3）流动相的极性大于固定液的极性，
则称为反相液液色谱 。
组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。 31
2. 流动相类别 按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗
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3. 流动相的选择
常用溶剂的极性顺序：水、酰胺、腈、醇、酮、 酯、醚、烃类, etc. 流动相可分为：底剂及洗脱剂 底剂：决定基本的色谱分离情况； 洗脱剂：调节试样组分的滞留并对几个组分具 有选择性的分离作用。
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化学键合固定相的特点 （1）传质快，表面无深凹陷; （2）寿命长， 无固定液流失，耐流动相冲 击； （3）选择性好，可键合不同官能团 ； （4）有利于梯度洗脱；
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六、液相色谱法流动相
1. 流动相特性 2. （1）流动相的种类、配比可显著改变组
分分离状况； 3. （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相
可连续检测参比池和样品池中溶液的折光 指数差值。差值与浓度呈正比；
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特点： 通用型检测器 ; 灵敏度低（10-7g.mL-1），不能用于痕量分 析; 对温度敏感，要求使用温度恒定; 对流动相流量变化敏感，不能用于梯度洗脱。
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4. 荧光检测器（fluorescence detector）
采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动 相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
紫外可见光度检测 器的重要进展； 1021个二极管阵列， 各检测某一特定波 长，无需停流扫描 而观察色谱柱流出 物的各个瞬间的动 态光谱吸收图
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光电二极管阵列检测器
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3. 差示折光检测器（differential refractive index detector） 除紫外检测器之外应用最多的检测器；