金纳米微粒表面能量转移及半胱氨酸的高灵敏度高选择性分析法_刘春

文章编号： 1008-9357(2022)01-0077-08DOI: 10.14133/KI.1008-9357.20210411002金纳米粒子/聚吡咯-聚多巴胺电化学免疫传感器曲春波1， 张静怡1， 那立欣1， 罗 静2（1. 上海健康医学院，上海 201318；2. 江南大学化学与材料工程学院，江苏 无锡 214122）摘 要： 以金纳米粒子功能化的聚吡咯-聚多巴胺（PPy-PDA ）为基质材料，构建了电化学免疫传感器用于癌胚抗原（CEA ）的检测。

首先制备了PPy-PDA 复合物，通过聚多巴胺的弱还原性原位还原氯金酸，得到纳米金/聚吡咯-聚多巴胺（Au/PPy-PDA ）纳米复合材料。

该复合材料具有优异的导电性、水分散性和黏附性，能够在电极表面形成均一、稳定且生物相容性优良的导电膜，利用纳米金与癌胚抗体的特殊作用固定癌胚抗体，并通过牛血清白蛋白屏蔽电极表面的非特异性吸附点，从而构筑了一种用于检测CEA 的电化学免疫传感器。

所制备的传感器对CEA 具有特异性、识别性，在最优条件下，对CEA 的线性检测范围为10−12 ～5×10−7 g/mL ，检测下限为0.2 pg/mL 。

此外，还考察了该传感器的重现性和稳定性，并进行了实际样品中CEA 的回收实验。

该传感器具有检测范围宽、检测限低且稳定性好的特点，在生物医学、临床诊断等方面具有潜在的应用价值。

关键词： 电化学免疫传感器；聚吡咯；聚多巴胺；癌胚抗原中图分类号： O632.6 文献标志码： AElectrochemical Immunosensor Based on Gold Nanoparticles/Polypyrrole-PolydopamineQU Chunbo 1, ZHANG Jingyi 1, NA Lixin 1, LUO Jing 2（1. Shanghai University of Medicine & Health Sciences, Shanghai 201318, China; 2. School of Chemical and MaterialEngineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China ）AuCl −4Abstract: A novel ultrasensitive impedimetric immunosensor was constructed for the detection of carcino-embryonic antigen (CEA) using conductive and adhesive bio-inspired gold/polypyrrole-polydopamine nanocomposites as an immobilization matrix. A polypyrrole-polydopamine (PPy-PDA) complex was first prepared by the polymerization of pyrrole and dopamine, which was then blended with the chloroauric acid solution (HAuCl 4). The in-situ reduction of to gold nanoparticles (Au NPs) by polydopamine led to the successful preparation of gold/polypyrrole-polydopamine nanocomposites (Au/PPy-PDA). Au/PPy-PDA was characterized by Fourier transmission infrared (FT-IR) spectroscopy, scanning electronic microscopy (SEM) coupled with energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) and electrical conductivity test. The dispersion test and adhesion test showed that PPy-PDA possessed good dispersibility in water and outstanding adhesion performance.The electrochemical measurement showed that Au/PPy-PDA not only provided a highly stable and biocompatible matrix for 收稿日期： 2021-04-11基金项目： 国家自然科学基金（51573072）作者简介： 曲春波（1980—），山东青岛人，副教授，从事生物医用高分子的研究。

发光金纳米粒子测定曲通X-100及其临界胶束浓度刘玫瑰;曹春;曹明;朱昌青【期刊名称】《分析化学》【年(卷),期】2009(37)10【摘要】参照文献方法合成了BSA保护的水溶性发光金纳米粒子, 并考察了此探针在非离子表面活性剂曲通X-100中的发光行为.根据观察到的发光增强效应, 建立了一种简单的测定曲通X-100的方法.考察了发光金纳米粒子的浓度、体系酸度、反应时间及共存物质对测定的影响.在最佳条件下, 发光强度与曲通X-100的浓度分别在0～150 μmol/L和150～600 μmol/L范围内分段成正比关系.两条工作曲线的交点所对应的浓度与曲通X-100的临界胶束浓度十分吻合, 为胶束形成过程提供了直接的指示.作为一种生物相容性探针, 发光金纳米粒子被用于生物学样品中曲通X-100的分析测定, 结果令人满意.【总页数】4页(P1503-1506)【作者】刘玫瑰;曹春;曹明;朱昌青【作者单位】安徽师范大学化学与材料科学学院,安徽省化学与生物传感重点实验室,芜湖,241000;安徽师范大学化学与材料科学学院,安徽省化学与生物传感重点实验室,芜湖,241000;安徽师范大学化学与材料科学学院,安徽省化学与生物传感重点实验室,芜湖,241000;安徽师范大学化学与材料科学学院,安徽省化学与生物传感重点实验室,芜湖,241000【正文语种】中文【中图分类】O6【相关文献】1.曲拉通X-100与β-环糊精协同增敏-偶氮胂Ⅲ-分光光度法测定镧(Ⅲ) [J], 张立科;张新海;付冰冰;杨风岭2.达旦黄-曲通X-100体系共振光散射法测定蛋白质 [J], 冯素玲;王瑾;樊静3.高效液相色谱法测定质粒pUDKH中曲拉通X-100的含量 [J], 刘佳;张庆林;毕建进;王正平;吴祖泽4.用一种新的疏水共轭聚合物荧光测定曲通X-100及其临界胶束浓度 [J], 李鸣凤;孙礼林;郝丹;朱昌青5.曲拉通X-100稀释直接进样-石墨炉原子吸收光谱法测定牛奶中的铅 [J], 戴瑞平;刘花梅;陈林因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

基于金纳米粒子局域表面等离子体共振吸收检测卡托普利X许　丹(西南大学化学化工学院,重庆　400715) 摘　要:柠檬酸根稳定的金胶在一定盐浓度下由于盐的电荷屏蔽效应而发生聚集。

加入一定浓度的卡托普利后,由于卡托普利分子中含有巯基和羧基,其分子中的巯基可以通过Au -S 键连在金纳米粒子表面,同时,在pH9.91的条件下,其分子中的羧基去质子化形成-COO -,导致金胶表面负电荷增多,纳米粒子之间的静电排斥力增大,金胶的聚集得到了抑制。

基于金胶由聚集到分散的现象,利用紫外-可见吸收光谱进行表征,建立了定量检测卡托普利含量的方法。

该方法的线性范围为0.04～1.2L M ,检出限为20nM 。

将此方法用于合成样的检测,回收率在86.3%～108.2%之间。

关键词:金纳米粒子;卡托普利;表面等离子体共振吸收 中图分类号:T Q460.7 文献标识码:A 文章编号:1006—7981(2012)03—0006—03 卡托普利(1-[(2S )-2-甲基-3-巯基-1-氧化丙基]-L -脯氨酸,Cap,结构如下图所示)是一种人工合成的血管紧张素转换酶抑制剂,目前广泛应用于治疗高血压及心力衰竭等疾病。

目前,定量测定卡托普利的分析方法有高效液相色谱法[1]、氧化还原滴定法[2]及化学发光法[3]等。

这些方法虽然灵敏度较高,但存在一些缺点如仪器设备昂贵、操作繁琐等。

因此,建立简便、快速、灵敏度高的检测卡托普利的方法仍然具有十分重要的意义。

图1　实验原理图近年来,金纳米粒子由于其独特的表面等离子体共振吸收性质被广泛用于色度传感。

13nm 柠檬酸根包被的金胶呈现酒红色,一旦发生聚集则呈现紫色或蓝色[4]。

这种颜色的改变很容易用肉眼捕获,不需要复杂的仪器。

金胶在一定浓度的NaCl 溶液中发生聚集,在本研究中,我们发现当体系中同时存在卡托普利后,金胶的聚集能得到抑制,基于此现象,建立了一种金胶由聚集到分散的状态来高灵敏检测卡托普利的新方法。

金纳米粒子富集-高效液相色谱同时测定人血浆中三种氨基硫醇蒙芳;刘承伟;陈敏;卢昕;赵书林【期刊名称】《色谱》【年(卷),期】2012(30)10【摘要】建立了金纳米粒子富集-高效液相色谱-紫外检测( HPLC-UVD)同时测定人血浆中3种氨基硫醇(半胱氨酸( Cys)、高半胱氨酸(Hcys)、谷胱甘肽(GSH))的新方法.以Tween 20修饰的金纳米粒子作为选择探针萃取富集氨基硫醇.经二硫苏糖醇脱附后,采用SpursilTMC18柱(250 mm×4.6 mm,5μm)分离氨基硫醇,以60 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 2.0)等度洗脱,检测波长为200 nm.3种氨基硫醇的浓度分别在0.025 ～350 μmol/L、0.02 ～60μmol/L、0.01～50 μmol/L内与峰面积具有良好的线性关系,相关系数均高于0.99.方法检出限(信噪比为3)分别为5.0、6.0和2.5 nmol/L,回收率为92.8％～ 106.0％.该方法能显著降低血浆样品中内源性物质的干扰,提高HPLC-UVD的选择性和灵敏度.将该方法应用于心血管病人血浆中上述氨基硫醇的分离测定,结果显示:与对照组相比,疾病组血浆中的Hcys和GSH水平存在显著性差异,Cys不存在显著性差异.%A high performance liquid chromatography ( HPLC) method with ultraviolet detection (UVD) for the simultaneous determination of cysteine ( Cys) , homocysteine (Hcys) and glutathione ( GSH) in human plasma was established. Tween 20-capped gold nanoparticles (Tween 20-AuNPs) were used as selective probes forthe extraction and enrichment of aminothiols. The aminothiols removed from the Tween 20-AuNPs by dithiothreitol were separated on aSpursil?C18 column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) with a mobile phase of 60 mmol/L phosphate buffer solution (pH 2.0). The column eluent was monitored using UVD at the wavelength of 200 nm. The linear ranges were found between peak area and concentration in the ranges of 0.025 -350 μmol/L for Cys, 0. 02 -60 μmol/L for Hcys and 0. 01 -50 μmol/L for GSH, with linear regression coefficients all above 0. 99. The limits of detection (LOD, signal to noise ratio of 3) for the aminothiols were between 2. 5 nmol/L and 6. 0 nmol/L and the recoveries were between 92. 8% and 106. 0%. Due to the significant interference reduction of endogenous substances in the plasma and the subsequent improvement of the selectivity and sensitivity of HPLC-UVD, the present method was applied for the simultaneous analysis of the forementioned aminothiols in the plasma samples of cardiovascular disease patients. The results showed that the levels of Hcys and GSH had significant differences between the patients and the controls, while that of Cys had no significant difference.【总页数】6页(P1056-1061)【作者】蒙芳;刘承伟;陈敏;卢昕;赵书林【作者单位】药用资源化学与药物分子工程教育部重点实验室广西师范大学化学化工学院,广西桂林541004;桂林医学院基础医学院,广西桂林541004;桂林医学院基础医学院,广西桂林541004;药用资源化学与药物分子工程教育部重点实验室广西师范大学化学化工学院,广西桂林541004;药用资源化学与药物分子工程教育部重点实验室广西师范大学化学化工学院,广西桂林541004【正文语种】中文【中图分类】O658【相关文献】1.高效液相色谱法同时测定人血浆中三种视黄酸同分异构体及其临床应用研究 [J], 杨平;李萍2.金纳米粒子固相萃取-高效液相色谱同时测定人血浆中四种吲哚胺 [J], 聂凡;陈晨;刘承伟;卢昕;赵书林3.人血浆中三种头孢菌素类药物浓度高效液相色谱直接进样测定法 [J], 谢景文;孙卫胜;马骏;张强;贾正平;李爱萍;赵桂荣4.柱前衍生高效液相色谱法测定人血浆中17种氨基酸的含量 [J], 陈蓉;周莉;董吉;张华;缪丽燕5.高效液相(HPLC)荧光法同时测定人血浆中4种硫醇物的浓度 [J], 杨涛;沈杰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

基于金纳米颗粒使用电化学催化原理快速识别和定性检测瘤细胞Alfredo de la Escosura-Muniz Christian Sa nchez-Espinel Bele n Dıaz-FreitasAfrica Gonzalez-Fernandez Marisa Maltez-da Costa and Arben Merkoci纳米生物电化学催化组纳米科学协会CIN2 (ICN-CSIC)这是一个高要求简单，快速，高效，为细胞检测用户友好的替代方法一般来说，特别是，为癌症细胞的检测。

一个细胞的生物传感器能检测将是所有理想装置等应用。

纳米粒子成功融入细胞的检测实验，可能允许这种新型的细胞级开发传感器。

事实上，它们的应用潜力在未来的诊断以及其他领域。

作为一种新型生物传感器的例子，我们在这里报告一个电化学装置的肿瘤细胞特异性鉴定，该定量的（AuNPs）金粒子电诱导转移的平台和传感器。

肿瘤细胞的增殖粘附的实现，电诱导转移探测器，其中包括一个大规模生产的荧光碳电极（SPCE）。

在现场鉴定肿瘤细胞的定量检测与实现，装置限量每700ul 4000个细胞。

这个细胞感应装置实验的创造性和选择性是基于细胞表面蛋白的特异性抗体结与纳米颗粒。

最后的检测只需要几分钟，利用催化性能的优势，纳米金颗粒的演变。

装置的检测方法不需要化学剂AuNPs的使用，对现有的纳米金球检测实验，它允许该系统比其他昂贵和复杂的使用方法肿瘤细胞的检测小型化和便宜得多。

我们设想，这个装置能运作，作为免疫或DNA的简单方法的传感器。

此外，它可以被使用，蛋白质分子或DNA检测股，甚至对缺乏经验工作人员也很方便、生物传感器的开发和应用是一个行业领先的国家的最先进的纳米科学和纳米技术。

生物传感器是根据商业发展的许多应用，包括病原体的检测，测量临床参数、监测环境污染物及其它工业应用。

最有效的生物传感器的方式提供给潜在客户，尤其是对开支有限的人，可能会修改技术。

2021金纳米粒子的性质、制备及运用范文 摘要：　近年来，由于金纳米粒子独特的物理化学性质以及良好的生物相容性和生物安全性，吸引越来越多的科研工作者对其展开广泛的研究和开发。

从金纳米粒子的合成方法、特性以及应用开发等方面的对金纳米粒子近年来的研究进展进行了比较详细的综述。

关键词：　金纳米粒子;合成方法; 应用开发; Abstract：　Inrecent years, more and more researchers have been attracted to carry out extensive research and development on gold nanoparticles due to their unique physical-chemical properties,good biocompatibility and biosafety. In this paper, the recent research progress of gold nanoparticles was reviewed in detail from the synthetic methods, properties and application development. Keyword：　Goldnanoparticles; Synthetisis method; Application development; 金是一种化学性质非常稳定的金属，常用于装饰和货币，但当其尺寸缩小至纳米级别时性质会发生奇特的变化。

金纳米粒子由于具有小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应等，会产生不同于块体金的特殊物理化学性质。

1、金纳米粒子的性质 1.1、表面等离子共振特性 在一束波长远大于金纳米粒子的入射光的影响下，金纳米粒子中的电子重新分布，产生库仑力，在方向相反的内外电场共同作用下其自由电子集体震荡发生共振的现象，即表面等离子共振（SPR）。

激光与光电子学进展47,071702(2010)Las er&Op t oelectronics ProgressΖ2010《中国激光》杂志社doi:10.3788/LOP47.071702金纳米棒的光学性质及其在生物医学成像和光热疗法中的应用杨玉东1,2　徐菁华1　杨林梅1　潘卫三2(1沈阳工业大学理学院,辽宁沈阳110178;2沈阳药科大学药学院,辽宁沈阳110023)摘要　与球形金颗粒相比,棒状金颗粒具有更为特殊的表面等离子体共振(SPR)特性,通过控制不同长短轴比可以实现纵向SPR峰位置的人为调控(从可见光区到近红外光区)。

由于金纳米棒表面SPR的强吸收导致的发光特性,使其在生物组织成像,癌症的诊断和治疗中存在着巨大的应用前景。

结合配体的金纳米棒能够特异性地标记癌症细胞上的受体,并提供特定分子的特有信息,进行生物成像和癌症检测。

另外,金纳米棒能够有效地吸收红外光能量进行局部加热,导致蛋白质变性,并致细胞死亡。

主要回顾各种不同尺寸和形状的金纳米棒的光学特性,综述选择性标记的金纳米棒在生物成像、癌症诊断和光热疗法中的研究进展。

关键词　医用光学与生物技术;金纳米棒;生物成像;光热疗法;癌症中图分类号　R318.51;R392.1 OCIS　170.3880160.4236 文献标识码　AOp t ical P r op e r t ies of Gol d N a n or od a n d It s App lica t i o ni n B i ol ogical I m a gi n g a n d P h ot ot he r m al The r ap yY ang Yudong1,2　Xu J inghua1　Y ang Linmei1　Pa Weisan21College of Scie nce,S he nya ng U niversit y of Tech nology,S he nya ng,Li aoni ng110178,Chi n a2School of Pha r m acy,S he nya ng Pha r m aceutical U niversit y,S he nya ng,Li aoni ng110023,Chi n aAbs t r act　Compared with sp herical gold particles,rod2shaped ones exhibit more unique p roperties of surface plasma resonance(SPR).Gold nanorods have two SPR peaks.The lengitudinal suface plasma resonances position depends on rods′aspect ratio.Thus,the LSPR′s position can be cont rolled f rom the visible region to the near inf rared by adjusting the aspect ratio of gold nanorods.Gold nanorods have great potential use in biological tissue imaging,cancer diagnosis and therap y because of it′s SPR and st rong absorption induced luminescence.Au2ligand conjugates can specifically target the receptor on cancer cells,p rovide specific information about specific molecules,and allow molecular2specific imaging and cancer detection.Gold nanorods can efficiently absorb optical energy into localized heat,and induce p rotein denaturation and cells death.The optical p roperties of kinds of gold nanorods are summarized,and the research p rogress of selective targeting of gold nanorods in biological imaging,cancer diagnoses and photothermal therapy is reviewed.Key w or ds　medical optics and biotechnology;gold nanorods;biological images;antibody;cancer1　引 言近年来,人们对金纳米材料的研究取得了长足的进步,不但可以制备出不同尺寸的球形粒子,还可以对其形貌加以控制[1],并且发现了一些特殊的实验现象和物理性质[2]。

葡萄糖（Glu）在各种生理活动中起着至关重要的作用，因此Glu的催化氧化及检测具有很高的研究和应用价值。

而金纳米颗粒（AuNPs）可用作葡萄糖氧化酶（GOD）模拟物，AuNPs催化Glu氧化在工业生产、科学研究和生物医学检测中有着广泛应用。

尽管AuNPs具有竞争优势，但缺乏选择性和有限的催化能力一直制约着AuNPs的进一步应用。

近日，东南大学生物科学与医学工程学院的研究团队构建了具有选择性与更高催化活性的金基模拟酶。

他们通过表面涂层和掺杂其他金属来提高AuNPs的类GOD活性。

研究者为研究掺杂不同元素对类GOD活性的影响，制备了四种不同柠檬酸盐修饰的Au-Pt 和Au-Ag摩尔比为1：1的金基纳米颗粒，并以柠檬酸钠-鞣酸法制备的10nmAuNPs作为对照。

用ABTS法检测了金基纳米酶催化Glu的氧化反应。

对Glu浓度依赖性研究表明，所有金基纳米酶催化的Glu氧化反应在实验浓度范围内呈现逐渐增加的趋势。

与平均粒径为10nm的AuNPs相比，粒径在10nm左右的金基掺杂纳米颗粒均能显著提高催化活性。

其中Au-Pt合金纳米颗粒最大提高了类GOD活性。

Au core-Ag shell纳米颗粒在金核外形成了致密的Ag壳层，紧密的包覆在金核表面。

在Au core-Pt shell纳米颗粒中，金核主要与周围铂簇吸附。

铂壳层的疏松结构和铂壳层与金核的不紧密结合，可能增加与基底的接触，也可能导致铂壳层的尺寸增大，分散性和均匀性降低。

结果表明，在相同的10nm 金核条件下，Au@Ag的性能优于Au@Pt。

催化活性的不同不仅是由于元素组成的不同，还可能是由于结构的不同。

接下来研究者制备了Au-Pt摩尔比为3：1-1：3的金铂合金颗粒（AuPtNPs），以进一步探索增强类GOD活性的金基纳米颗粒。

与10nm AuNPs相比，不同掺杂比例的AuPtNPs表现出明显的类GOD活性改善。

纳米材料催化性能受多种内在因素的影响，如元素组成、粒径、形态和表面改性阳离子等。

第1卷第2期2002年淮阴师范学院学报（自然科学版）JOURNAL OF HUAIYIN TEACHERS COLLEGE （NaturaI Science EditiOn ）VOI.1NO.22002NAD +在纳米金胶上的组装、表征及其应用研究顾海鹰（南通医学院卫生分析化学教研室，江苏南通226001）摘要：将NAD +固定在纳米金胶-半胱胺修饰的金电极表面构建一种新型的纳米仿生功能界面，用电化学交流阻抗、反射紫外-可见光谱和电化学分析法对其组装过程以及活性进行了表征.基于这种功能界面构建的新型酶生物传感器对乳酸的电催化响应呈现良好的线性，米氏常数为8.8!mOI /L ，检测限为6.0X 10-8mOI /L （!/"=3），且对NAD +的再生和对乳酸的电化学响应机理进行了研究.关键词：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（辅酶，NAD +）；乳酸；生物传感器；纳米仿生功能界面；金胶中图分类号：@811.7；@814.2文献标识码：A 文章编号：1671-6876（2002）02-0048-06收稿日期：2002-03-17基金项目：江苏省南通市科委基金资助项目（Z1008）作者简介：顾海鹰（1963-），男，江苏南通人，副教授，博士，现在南京大学从事博士后研究工作，主要研究方向生物电分析化学.纳米金胶自组装技术已有很多报道，这主要是它能使组装在其表面上的蛋白质、酶保持稳定的生物活性的同时［1~10］，也使自己保持稳定［11，12］.陈洪渊等曾成功地把蛋白质、酶固定在纳米金胶的基础上，保持其生物活性的同时构建了过氧化氢及一氧化氮生物传感器［5~9］.在临床诊断和食品生化等领域，乳酸的监测具有重要的意义.通常人们采用化学氧化或酶催化的方法来实现测定.化学氧化法是基于乳酸的氧化产物的光谱、滴定和色谱分析法；酶催化方法是在乳酸脱氢酶（LDH ）存在下，乳酸被氧化的同时，形成辅酶（NAD +）的还原态NADH ：Lactate +NAD +!"#LDHPyruvate +NADH +H +用吸收和荧光光谱的方法测得NADH 再间接确定乳酸的量.通过固定细胞色素b 2、乳酸氧化酶等在电极表面构建不同类型的安培传感器被用来测定乳酸已有报道［13~16］，近来乳酸的电化学传感器是把LDH 和NAD +固定膜修饰在电极表面，通过氧化NADH 再生NAD +，依据电流与乳酸的关系实现乳酸的测定［17］.SchIereth ［18~22］等报道了一些基于固定辅酶NAD +（及其衍生物）在被一些染料（如CibacrOn BIue 3FG-A 和Triazine Dye ）与酶（LDH ）修饰的生物亲水性金属界面上的乳酸传感器.WiIIner ［23］等也报道了基于LDH 组装在吡咯喹啉并醌-NAD +修饰的金电极上的乳酸传感器.这里，成功地将NAD +组装在纳米金胶-半胱胺修饰的金电极表面，构建一种基于纳米仿生功能界面的乳酸生物传感器.电化学交流阻抗、反射紫外-可见光谱和电化学分析法对其组装过程以及活性进行了表征.这种新型的生物传感器不需要电子媒介体和促进剂，对乳酸呈现电催化活性，用于测定乳酸具有良好的选择性和灵敏度.1实验部分1.1试剂乳酸脱氢酶（LDH ）（E.C.1.1.1.27，type XI ，兔肌肉，700U /mg ），烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和半胱胺购于Sigma 公司.AuCI 3HCI ·4H 2O （Au%>48%，上海试剂一厂）；其它化学试剂均为分析纯.0.1mOI /L 不同pH 值的磷酸盐缓冲溶液（PBS ）可通过混合Na 2HPO 4和NaH 2PO 4的贮备液获得（必要时可用0.1mOI /L H 3PO 4或NaOH 调节pH 值）.所有实验用水为二次双蒸水$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$.1.2仪器和方法铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，工作电极为金盘修饰电极（!=0.5mm ）组成的三电极工作系统.CHI 660A 电化学工作站（上海辰华仪器公司）上进行电化学实验，实验温度为2510.2C.循环伏安实验在静止的体系中进行.计时安培实验的施加电压为-250mV ，在搅拌体系中进行.所有测试溶液均经通入高纯氮气除氧15min ，并维持在氮气氛下.反射紫外-可见光谱（UV-Vis ）图用UV-240紫外-可见光谱（S1imadzU ，Japan ）记录.交流阻抗（EIS ）实验在含有1.00X 10-3moI /L K 3fe （CN ）6/K 4fe （CN ）6（111）-混合物的0.1moI /L 的KCI 溶液中进行.交流阻抗的频率范围为3X 104~1X 105Hz ，所有交流电位的幅度为5mV.1.3电极修饰金丝（纯度大于99.99%）被密封在软玻璃管中，首先用精细砂纸抛光，再用含有AI 203（0.25"m 和0.05"m ）浆的毛毡抛光，随后用纯水和乙醇超声波清洗.在含有1.00X 10-3moI /L K 3［fe （CN ）6］的0.1moI /L KN03溶液中用循环伏安法测得金电极的几何面积为（1.3010.16）X 10-3cm 2.真实面积可用文献报道的方法测得［24］.电极粗糙度是真实面积与几何面积的比值，这里为1.410.2.所有玻璃器具用王水浸泡241，再完全用双蒸水洗涤并用空气吹干.HAUCI 4和Na 3Citrate 在使用前必须用22"m 微孔膜过滤，并置于棕色瓶中保持4C 备用.按文献［3］报道的方法，通过加入一定量的Na 3Citrate 到煮沸的HAUCI 4溶液中制备金胶，当HAUCI 4和Na 3Citrate 面的摩尔比直接影响了金胶粒子的大小，当摩尔比为0.30，0.50，0.75，1.00和1.51，可制得直径为1612.3，2412.1，3112.5，4212.6和5115.1nm 的金胶，可用扫描电子显微镜（SEM ）.图1NAD +/金胶-半胱胺修饰全电极的制备过程首先在室温下于黑暗处，将处理好并洗净的金电极浸泡在0.1moI /L 的经过除氧的半胱胺水溶液中21，制得的半胱胺修饰的金电极，经过用双蒸水充分洗涤除去多余物理吸附的半胱胺后，再完全浸泡到胶体金中121（4C ）.最后金胶-半胱胺修饰电极被浸泡到含有含有10mg /mL NAD +的pH 7.2PBS 中121（4C ）.这样，可获得一种NAD +/金胶-半胱胺-修饰金电极，即一种纳米仿生功能界面.电极的制备过程见图1，制备的修饰电极经洗涤并置于pH 7.2PBS 中4C 保存备用.2结果与讨论2.1固定NAD +条件的优化2.1.1pH 和金胶直径（!）的影响不同尺寸金胶有不同的固定蛋白质能力，研究16，24，31，42和51nm 的金胶对固定NAD +的影响.构建的安培型传感器对乳酸响应与金胶的尺寸有关，实验表明31nm 金胶是最佳的纳米金胶粒子.94第2期顾海鹰：NAD +在纳米金胶上的组装、表征及其应用研究另外NAD +介质的pH 值对组装也有影响.由于NAD +与金胶表面的结合是靠NAD +上的氨基与金胶的化学键作用.NAD +溶液的pH 值会影响NAD +分子的净电荷，将影响与本来带负电荷金胶的作用形成化学键.研究结果表明选择31nm 金胶和pH 7.0的介质，制备的生物传感器有最大的响应电流.事实上当介质pH 值为7.0时，在NAD +中氨基和羟基的氢键被破坏，NAD +中裸露的氨基有利于与金胶结合.因此31nm 金胶和pH 7.0PBS 作为固定基质和NAD +的溶媒.2.1.2自组装时间的影响当用10mg /mL NAD +作为修饰溶液，在金胶（!1）和NAD +（!2）中的自组装时间直接影响制得的传感器对乳酸的响应，当!1和!2均为121，制备的生物传感器对乳酸有较高的电催化活性.2.2NAD +的组装过程及其生物活性表征2.2.1电化学交流阻抗（EIS ）在电极修饰过程中，EIS 能给出电极表面阻抗的变化.图2a 是裸金电极的EIS ，正象报道的那样［25］，它有非常小的半园直径，表明裸金电极对氧化还原探针有非常小的电子转移阻抗.当用半胱胺修饰后，半胱胺单分子层有较高的阻抗（图2b ），表明半胱胺单分子层阻碍电子的电子传递.当半胱胺修饰电极被浸泡在金胶中，发现金胶-半胱图2金电极的电化学交流阻抗图图3修饰金膜的紫外可见光谱（a ）裸金电极；（b ）半胱胺修饰金电极；（a ）NAD +/金胶-半胱胺膜的反射紫外可见光谱；（c ）金胶-半胱胺修饰金电极；（c ）NAD +/金胶-半胱胺修饰.（b ）含有4.0X 10-5mOI /L NAD +紫外可见光谱.胺修饰的金电极的交流阻抗接近于裸金电极（图2c ）.说明了金胶-半胱胺修饰的金电极的传导性与金电极本质上是一致的.也许是固定在半胱胺上的纳米金胶起着类似于导电丝或电子导电隧道的作用，使它更易发生电子转移.图4NAD +/金胶-半胱胺修饰金电极在乳酸中的循环伏安图（a ）0.005mg /mL LDH 的pH8.0PBS ；（b ）a +3.0X 10-6mOI /L 乳酸；（c ）a +6.0X 10-6mOI /L.最后将金胶-半胱胺修饰的金电极浸泡到NAD +溶液，这样可获得NAD +/金胶-半胱胺修饰的金电极.此时电极的界面阻力再度增加（图2c ）.电极修饰过程交流阻抗的变化是NAD +已经被组装到电极表面的有力证据.2.2.2紫外可见光谱（UV-Vis ）图3为NAD +已经被固定到金胶表面上提供了有力的证据.在PBS 中NAD +的吸收谱带位置为259.5nm （图3b ）［30，31］，吸收带位置（发生位移或消失）可以提供NAD +是否变异的信息.将NAD +固定在金胶-半胱胺修饰金膜表面，NAD +位于260nm 的吸收带如图3a 所示.说明组装在纳米金胶上的NAD +保持其生物活性.05淮阴师范学院学报（自然科学版）第1卷比较上述EIS 和UV-ViS ，NAD +已经被组装在金胶表面并保持其生物活性.2.3纳米功能界面对乳酸的催化响应研究NAD +固定在金胶-半胱胺修饰金电极，在含有的pH 8.0PBS 中对乳酸的响应，以验证研制的生物传感器的催化活性，研制的修饰电极放在含有0.005mg /mL LDH 的pH 8.0PBS 中，扫描速度1=100mV /S ，检测对乳酸的响应.图4中，阳极峰电流增加和阴极电流完全消失.说明在LDH 存在下固定的NAD +对乳酸呈现电催化特性.阳极峰电位，即在NAD +再生过程中NADH 的氧化电位，是250mV ，而在裸金电极上NADH 的氧化电位为750mV ［26］.在这样的功能界面上，NADH 的氧化过电位减少约500mV.这些充分说明了NAD +已经被固定在金胶表面，作为乳酸生物传感器，说明仿生功能界面上的NAD +也保持其电化学活性.反应机理可表示如下：制备的传感器对乳酸响应的稳态电流-时间曲线（工作电位：250mV ）见图5.乳酸的浓度在1.0X 10-7~8.0X 10-7mOI /L 范围内，其响应是线性的，线性回归方程为I /DA =2.25+13.8C /!mOI /L ，相关系数（r ）为0.9978.检测限为6.0X 10-8mOI /L （三倍的信噪比，S /N =3）.响应时间约为4S ，6次连续测定浓度为2.0X 10-7mOI /L 乳酸的相对标准偏差（RSD ）为3.6%.图5NAD +/金胶-半胱胺修饰金电极对乳酸的电流-时间曲线（a ）3.2X 10-5mOI /L AA ；（b ）3.0X 10-5mOI /L UA ；（c ）1.6X 10-5mOI /L DA ；（c ）2.0X 10-5mOI /L 葡萄糖；（e ）5.0X 10-5mOI /L CI -和8.0X 10-7mOI /L 乳酸15第2期顾海鹰：NAD +在纳米金胶上的组装、表征及其应用研究当乳酸的浓度高于1.0X 10-5mol /L 时，响应曲线趋于平台，说明具有Michaelis-Menten 动力学机理特性，表观Michaelis-Menten 常数（!m ）是酶-底物动力学的表征，可由Lineweaver-Burk 方程的电化学形式得到［27］1"ss =!m "max X 1C +1"max这里，"ss 是加入底物以后测得的稳态电流，#是底物的总体浓度，"max 是加入饱和底物后测得的最大电流.!m 由稳态电流的倒数和乳酸浓度的倒数作图产生的斜率和截距求得，这种乳酸传感器的!m 值为8.8!mol /L.较低的!m 值说明固定的NAD +对乳酸具有较高的生物亲和性，基于这种纳米仿生功能界面的乳酸传感器有较高的灵敏度在此得到证实.2.4纳米功能界面的稳定性和抗干扰能力进一步研究表明这种生物传感器是非常稳定的，在pH 8.0PBS ，4C 至少能保持5d ，电极对乳酸响应至少是初始响应的90%.这种基于纳米功能界面的生物传感器有较强的抗干扰能力.从图5观察到3.2X 10-5mol /L 抗坏血酸（AA ），3.0X 10-5mol /L 尿酸（UA ），1.6X 10-5mol /L 多巴胺（DA ），2.0X 10-5mol /L 葡萄糖（Glucose ）和5.0X 10-5mol /L 氯离子（Cl -）不干扰乳酸的测定.2.5结论IES 和UV-Vis 能被成功作为有力的工具用来表征固定在金胶表面上的NAD +.研制的纳米仿生功能界面能保持其生物活性，并对乳酸呈现良好的电催化特性.作为一种新型的生物传感器具有较高的灵敏度和选择性，在临床和生物领域具有良好的应用前景.参考文献：［1］Giersig M ，Mulvaney P.Preparation of ordered colloid monolayers by electrophoretic deposition ［J ］.Lagmuir ，1993，9：34083413.［2］Hostetler M J ，Green S J ，Stokes J J ，Murray R W.Monolayers in three dimensions ：synthesis and electrochemistry of "-func-tionalized 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function interface.The preparation process and activity ofthis interface were characterized with eiectrochemicai impedance spectroscopy （EIS ），UV-Vis spectroscopy （UV-Vis ）and eiectroanai chemistry.A novei reagentiess enzyme biosensor based on this function interface was fabricated and showed a good eiectrocataiytic activity to iactate with Michaeiis Menten constant !"of 8.8!M and iimiting de-tection of 6.0>10-8moi /L（#/$=3），the mechanism of the regeneration of NAD +and the eiectrochemicai re-sponse to iactate was aiso studied.Key words ：nicotinamide adenine dinucieotide（NAD +）；iactate ；nanometer-sized bionic function interface ；bio-sensor ；goid coiioid［责任编辑：蒋海龙］35第2期顾海鹰：NAD +在纳米金胶上的组装、表征及其应用研究NAD+在纳米金胶上的组装、表征及其应用研究作者：顾海鹰作者单位：南通医学院,卫生分析化学教研室,江苏,南通,226001刊名：淮阴师范学院学报(自然科学版)英文刊名：JOURNAL OF HUAIYIN TEACHERS COLLEGE (NATURAL SCIENCE EDIITON)年，卷(期)：2002,1(2)被引用次数：2次1.Giersig M;Mulvaney P Preparation of ordered colloid monolayers by electrophoretic deposition [外文期刊] 19932.Hostetler M J;Green 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