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分离培养：无菌采取病料接种马铃薯琼脂培养基中，置37℃恒温箱中培养24小时，长成绒毛样菌丝，未见其它细菌生长。
经48小时培养长成白色菌落。
72小时菌落呈纽扣状，由中心向外周逐渐变深，转变成灰白色、灰绿色。
取培养物镜检可见大量球形的分生孢子。
通常人们把真菌和霉菌认为是一种病原的两种说法。
真正真菌包括霉菌，霉菌只是众多真菌中的一种。
真菌是由单细胞或多细胞组成，按有性或无性方式进行繁殖的真核细胞类微生物。
根据其侵犯人体的部位分为前部真菌和深部通常人们把真菌和霉菌认为是一种病原的两种说法。
真正真菌包括霉菌，霉菌只是众多真菌中的一种。
真菌是由单细胞或多细胞组成，按有性或无性方式进行繁殖的真核细胞类微生物。
根据其侵犯人体的部位分为前部真菌和深部真菌，包括皮肤癣菌、孢子丝菌、念珠菌、曲霉菌、隐球菌、组织胞浆菌等。
而霉菌多为细胞真菌的一种，也为深部感染真菌，包括烟曲菌、黄曲菌、黑曲菌、土曲菌等，常发生于免疫力低下的患者，引起全身播散性感然，影响预后。
培养基的选择应根据实验材料和检验目的来确定。
目前国标方法中使用的培养基有:马铃薯葡萄糖琼脂(PDA),孟加拉培养基(RBC)、高盐察氏培养基(CAO),其中PDA和RBC适合于一般的霉菌和酵母菌生长,而CAO则适合于高渗性霉菌生长,酵母菌几乎不长。
在日常检测中我们发现,有些常见的耐高渗性霉菌,如局限曲霉、谢瓦曲霉、赤曲霉、Wallemia等在PDA、RBC上生长非常缓慢或不长,而这些菌在高渗培养基如M40Y、DG18(M40Y琼脂配方:蔗糖400g,麦芽提取汁20g,酵母提取汁5g,琼脂20g,氯霉素50mg,蒸馏水1000ml;DG18琼脂配方:葡萄糖10g,蛋白胨5g,KH2PO41g,MgSO4·7H2O 0.5g,氯霉素0.1g,0.2%二氯硝基苯胺1.0mL,琼脂15g,蒸馏水1000mL,PH6.5)上则正常生长,孢子、形态特征发育良好,而且酵母菌也能在M40Y、DG18上生长,因此,若能同时采用PDA和M40Y(或DG18)分离培养各类样品中的霉菌,将能更全面地反映出污染霉菌的菌相。
真菌的鉴定及药敏试验分析真菌对人类健康的危害包括由病原性真菌、条件致病真菌所致的深部真菌病和浅部真菌病；由气传真菌所致的变态反应真菌症即过敏；由污染真菌产毒所致的真菌中毒症。
随着医学的发展，特别是抗生素的广泛使用，大量治疗手段的开展，免疫障碍疾病的大量发生，使真菌感染的情况日益增加，医院感染中的真菌感染也不断增加，因而，掌握真菌检验的方法就成为检验工作中的一个重要组成部分。
1 材料与方法1.1 真菌来源收集临床送检标本所分离出的真菌120例，男性84例，女性36例，其中痰液96株，粪便11例，咽拭子12例、尿液5例、血液4例，分泌物3例。
1.2 采集及处理根据真菌侵犯组织和器官的不同而采集不同的标本，而采集最合适的标本是决定能否找到病原性真菌的关键，要尽量用消毒方法采集标本以免污染。
深部真菌病的标本如血液、脑脊液、脓液、尿、痰等应及时收集检查，一般不超过1～2h，以免变质污染，标本采取前，应忌用药。
为避免污染杂菌，在收集标本时，应严格无菌操作，必要时在培养基内加入抗生素类。
1.3 检验方法1.3.1 酵母样菌的检验直接涂片法各类标本，除脑脊液、尿、胸水、腹水等需离心沉淀后取沉淀物作涂片外，其他均可用生理盐水或10％～40％KOH作涂片后直接镜检或用革兰、墨汁、0.1％甲苯胺蓝染色后镜检。
分离酵母样菌所选用的培养基为沙保弱固体或液体培养基，在培养基中可加入各种抗生素抑制细菌的生长、有利于真菌生长含抑制剂的霉菌琼脂。
将备类标本直接接种上述培养基，除新型隐球菌需同时接种两支培养基；一支孵育于37℃，另一支孵育于22～28℃，其他酵母菌均孵育于22～28℃。
每日观察生长情况。
根据酵母菌在培养基上的菌落特征及在玉米粉吐温80培养基上生长物在显微镜下生长情况可作初步鉴定。
1.3.2 丝状真菌的检验某些丝状真菌如孢子丝菌或荚膜组织胞浆菌的直接涂片，必须染色后检查。
真菌的形态和结构通过染色更为清楚，不染色涂片不易保存，染色涂片可长期保存。
真菌感染的常规检验方法真菌的临床实验室检查一般包括标本采集、直接镜检、染色镜检、分离培养、生化反应及免疫学试验等。
以直接镜检和分离培养最重要。
1标本采集不同真菌感染应采用不同的临床标本。
浅部真菌感染可以采集毛发、皮屑、指(趾)甲、痂等，标本在分离前常先用75％的乙醇消毒。
深部真菌感染的检查可取痰、尿液、口腔或阴道分泌物、脑脊液、各种穿刺液和活检组织等。
采集标本时应注意无菌操作。
采集标本后应及时转运至实验室进行检查，一般不超过1～2h，以免标本变质污染。
标本须在用药前采集，对已用药者则需停药一段时间后再采集标本。
2检查方法2.1 直接检查法直接镜检是最简单也是很有价值的实验室诊断方法。
其优点在于简便、快速，无菌部位的阳性结果可直接确定真菌感染。
但是，除了少数真菌外，多数不能确定其种类。
由于阳性率较低，阴性结果亦不能排除诊断，有时需反复检查或做其他方法检查以进一步确定。
直接镜检对于浅表和皮下真菌感染最有帮助。
2.1.1 不染色标本检查取皮屑、毛发、指(趾)甲屑等标本置于载玻片中央，滴加100～200g／L KOH溶液1～2滴，以盖玻片覆盖后在火焰上微微加热，使组织或角质溶解、透明后，先于低倍镜检查有无真菌菌丝或孢子，再以高倍镜检查其特征，可初步诊断真菌感染。
2.1.2 染色标本检查有些真菌如深部真菌需要染色后才能更清楚地观察，常用的染色方法如下。
(1)革兰染色法：多用于白假丝酵母菌、孢子丝菌和新近感染的组织胞浆菌等。
所有真菌均为革兰阳性。
(2)乳酸酚棉蓝染色法：取标本于载玻片上，滴加染液，加上盖玻片后于镜下观察，真菌被染成蓝色。
该法适用于各种真菌的直接检查，培养物涂片检查及小培养标本保存等。
(3)荧光染色法：用0.1％吖啶橙对标本涂片和组织切片进行染色，在荧光显微镜下观察，白假丝酵母菌、皮炎芽生菌、球孢子菌为黄绿色，新型隐球菌、鼻孢子菌为红色，组织胞浆菌为红黄色，曲霉菌为绿色。
2.2 分离培养法真菌培养是目前鉴定真菌的唯一方法。
XXXX医院真菌标本采集标准操作规程1 目的规范真菌标本采集、接种培养及鉴定标准操作规程，确保检验结果准确可靠。
2 适用范围各类真菌检测的标本。
3 标本采集及处理3.1 标本类型痰、尿、粪、脓液、脑脊液、血、拭子、皮屑、甲屑、气管穿刺抽取的痰液等。
3.2 标本采集与处理3.2.1 痰液、气管穿刺抽取的痰液。
3.2.2 尿液：早晨中段尿10ml，离心收沉淀液1 ml，作真菌涂片及培养。
3.2.3 口腔、咽喉、外耳道、阴道、和直肠黏膜的标本：应迅速放入内装1 ~ 2 ml无菌蒸馏水的试管送检。
常规KOH涂片及SDA培养。
3.2.4 粪便：无菌盒送检，挑取黏液、脓血接种于含氯霉素培养基上。
3.2.5 脓液：脓液标本应置无菌广口有盖玻璃瓶或小的无菌平皿中，立即送检。
3.2.6 脑脊液：采集于无菌试管3 ~ 5 ml立刻送检，离心后以无菌吸管吸取离心沉淀物1 ml，作黑汁涂片镜检和培养（SDA）25℃及37℃1周。
3.2.7 血液：分别于左右两侧尢菌抽血3 ~ 5 mI，立即置于脑心浸出液肉汤。
3.2.8 体液：支气管积液、关节腔积液、心包积液、腹水等10ml，离心沉淀后取0.5ml沉淀液作直接镜检（注意颗粒）及培养。
3.2.9 组织：标本置无菌平皿中立即送检，置无菌研钵或组织匀浆器加2 ml蒸馏水，研磨成浆或切成1 ~ 2 mm3的小块作真菌直接镜检（KOH涂片）及培养。
3.2.10 皮屑：皮损的边缘、疱壁、脓液、深层趾（指）间皮屑或活动边缘皮屑。
取材前用75％酒精棉球消毒取材处，标本作真菌直接镜检（KOH涂片）和培养。
3.2.11 甲屑：用细锉或牙科磨钻取病甲与正常甲交界处并且贴近甲床部的甲屑，标本用酒精浸泡待干燥后以十点接种法分别种于含放线菌酮及不含放线菌酮的SDA平皿，25℃ ~ 28℃培养3周，并同时作KOH 涂片。
3.2.12 毛发：取病发15根、75%酒精消毒，3 ~ 5根作直接镜检，5 ~ 10根种于SDA斜面（加氯霉素），稍划破斜面掩埋。
真菌的常规检验法实验室检查：♦标本采集分离培养♦直接镜检生化反应♦染色镜检免疫学试验一、临床标本的采集♦1．皮肤的角质性物质：毛发、指(趾)甲、头屑、皮屑等。
2．各种分泌物和排泄物：生殖道分泌物、耳垢、痰、粪便、尿液等。
♦3．血液和体液：体液包括胸水、腹水、脑脊液、淋巴穿刺液等。
4．脓汁及渗出物。
二、检验方法（一）标本直接检查法不染色标本检查染色标本检查（二）培养检查（三）鉴定①KOH溶液：本液适于检查致密的难以透明的材料（如毛发、指甲、鳞屑等）。
②墨汁：主要用于检查有荚膜的真菌（如新型隐球菌等）③水合氯醛－石炭酸－乳酸封固液：此液透明力较强，只限于不透明的标本。
④生理盐水：为观察真菌的出芽现象可用生理盐水代替氢氧化钾溶液。
微生物学检查步骤：取患部标本（毛发、皮屑等）__置载玻片__加10%NaOH（或10%KOH）→微加温消化→镜检（观察菌丝和孢子）直接镜检的意义①有诊断意义，如浅部真菌病等；②通过真菌的形态，可确定某些致病性真菌的属或种, 如假丝酵母菌的厚膜孢子等；③判断某些真菌种的致病性等,如皮肤癣菌、曲霉等。
直接镜检的局限性：①阴性结果不能排除真菌感染；②有假阳性结果。
因此，对直接镜检可疑结果应作复查或用其他检验方法鉴定。
2. 染色标本检查♦（1）革兰染色：各种真菌均染成革兰阳性。
♦（2）乳酸酚棉蓝染色♦（3）糖原染色：♦又称过碘Schiff（简称PAS或PASH）。
真菌细胞壁由纤维素和几丁质组成，含有多糖。
过碘酸使糖氧化成醛，再与品红－亚硫酸结合，成为红色，故菌体均染成红色。
为真菌染色最常用的方法之一。
♦（4）嗜银染色（GMS）：染成黑色♦（5）粘蛋白卡红染色法（MCS）：主要用于新生隐球菌荚膜的染色。
隐球菌荚膜和细胞壁呈红色，细胞核呈黑色。
♦（6）荧光染色：主要使用吖啶橙和氢氧化钾来染直接涂片、培养涂片及组织切片。
（二）培养检查法♦本法可确定菌种，辅助直接检查的不足。
①菌落性质：酵母菌还是霉菌；②菌落大小：致病性真菌菌落小，而条件致病性真菌菌落大；③菌落颜色：病原性真菌颜色淡，污染真菌颜色深；④致病性真菌菌落下沉，有时使培养基开裂；污染性真菌菌落不下沉，很少引起开裂。
八细菌和真菌标本的采集指南标本类型采集时间和温度重复采样限制说明原则装置和最小量转运储存脓肿用无菌盐水或70％乙醇拭去表面渗出物组织或体液优于拭子标本，如必须用拭子，采集2个，1个培养，1个做革兰氏染色。
开放性尽可能抽取或将拭子深入伤口，紧贴伤口前沿取样拭子送捡系统≤2h，常温≤24h，常温1/d/来源从脓肿底部或脓肿壁的取样，结果最好封闭性用针及注射器抽吸脓肿壁，将所有物质无菌转入厌氧转运装置厌氧送捡系统≥1ml≤2h，常温≤24h，常温1/d/感染来源取样时，可能会带入与感染过程无关的定植细菌咬伤见脓肿不要培养≤12h的动物咬伤伤口（通常不能分离到感染性病原体，除非位于脸上或手上，或有感染的指征存在）血培养培养瓶的消毒：加70％异丙基乙醇到橡胶塞1min细菌：血培养瓶≤2h，常温≤24h，常温或按说明3套/24h急性脓毒病：10min内从不同部位采2－3套成人，5-10ml/套急性心内膜：1－2h内从3个不同部位采3套首先触摸静脉婴儿，3－5ml/套亚急性心内膜炎：从3个分离部位采3套，间隔≥15min，如24h内为阴性，要再采3套型采样限制说明原则装置和最小量转运储存血培养静脉穿刺消毒：1.用70％乙醇清洗采集体位2.使用蘸碘拭子，次女嘎中心开始呈同心圆式涂抹3.让碘制剂晾干4.不要触摸该点5.采血6.穿刺后，用乙醇将皮肤上的碘除去原因不明发热：从不同部位采2－3套，间隔≥1h，如24h内为阴性，要再采3套骨髓对穿刺一侧准备同外科切口接种血培养瓶≤24h，常温，≤24h，常温1/d少量骨髓可直接接种培养基烧伤标本采集前，先清洗和清创烧伤伤口将组织放入有旋帽的容器内用拭子取渗出物≤2h，常温≤24h，常温1/d/感染只需进行需氧培养，烧伤表面的培养可能会有误导导管1.用乙醇清洗导管周围的皮肤2.将导管末端距夹子5cm无菌移入无菌管3.直接转运微生物实验室，以防干燥无菌或有旋帽的管或杯≤15min，常温≤24h，4℃无对半定量培养，导管是可以接受的，如静脉导管（Maki法）：中心的、CVP、Hickman、Broviac、外周的、动脉的、Foley 由于培养物代表尿道末端的菌群，不要培养要求培养是不能接受的型采样限制说明原则装置和最小量转运储存蜂窝组织炎1.用无菌生理盐水或70%乙醇擦拭2.用细针头和注射器抽吸发炎的区域（一般是中心而不是边缘）3.往注射器吸入少量无菌生理盐水，将标本抽入无菌旋帽管无菌管（不要用注射器转运）≤15min，常温≤24h，常温无只有25－30%可产生潜在的致病菌CSF 1.用2%碘酒消毒采集体位2.用带L3－L4，L4－L5或L5－S1通管丝的针头插入3.进入蛛网膜下腔后，移去通管丝，采集1－2ml液体，分别放入3个防漏管无菌旋帽管所需的最小量：细菌，≥1ml真菌，≥2ml细菌：不要冷冻；≤15min，常温≤24h，常温无也可采血进行培养。
