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1.2
新鲜花药整体及游离细胞
观察选择处于各生育期的主茎穗,放在铺有湿滤纸的 平皿中,对穗中部的一次枝梗上的小穗(顶端第一、二小穗 除外)依次进行观察。具体操作如下:在双目解剖镜下,剥出 6个花药,其中3个迅速放入滴有2%蔗糖水溶液的载片上,盖 片,进行整体花药观察;另外3个花药迅速放入滴有8%蔗糖 水溶液的载片上,用解剖针横断花药,挤出花药药室内的细 胞,盖片后观察游离细胞的形态。在Leica显微镜下进行观 察及拍照。
1.
材料与方法
1.1 取样及树脂半薄切片的制作
水稻种子浸种催芽后，按常法种植、管理。 从幼穗发育进入第 4期(雌雄蕊原基形成期)开始取样,直到 开花为止。取穗中部的一次枝梗上的小穗(顶端的第一、二小 穗除外),以小穗长度相差1mm进行分组固定。其中发育早期以 刚形成小穗雏形,小穗长度不及1mm即行固定;发育后期参考 小穗内、外稃形态及花丝伸长情况辅助判断。每组取小穗50 个左右,切去小穗稃端及小穗梗,采用半薄树脂连续切片的方 法。
1
3.0－4.9
谢谢！
2.8 成熟花粉期
当细胞内完全充满淀粉等贮藏物质时, 花粉粒圆球形,生殖细胞进行第二次分裂, 形成两个精细胞(图2-F)。此时由于花粉 内充满了淀粉等贮藏物,其内的三个核通 常不容易观察到。至此,水稻花粉的发育 过程完成。药壁各层细胞退化。表皮细 胞仅剩细胞轮廓,药室内壁加厚(图2-F箭), 中层和绒毡层的原生质体降解消失,仅剩 下绒毡层膜紧贴在药室内壁上(图2-F箭头)。
3.总结
综上所述,可将水稻花粉发育的主要分期特征列于表1。
表1 水稻花粉发育过程分期及各期主要特征
小穗长度mm 期号 时期 小孢子母细胞形成 期 小孢子母细胞减数 分裂期 2 3 小孢子早期 小孢子近球形，五液泡，尚未出现萌发孔核孢壁， 绒毡层胞质浓缩状 小孢子体积增大，液泡出现，核偏离中央，小孢子 壁和萌发孔形成，绒毡层细胞成带状 4 小孢子中期 小孢子体积明显增大，出现中央大液泡，胞质及核 贴于孢壁内侧，壁加厚，绒毡层细胞山丘状 5 小孢子晚期 二胞花粉早期 6 7 二胞花粉晚期 成熟花粉期 8 小孢子体积增大，生殖细胞移向营养核，淀粉开始 积累，尚有液泡 淀粉粒等贮藏物充满整个花粉粒，生殖细胞分裂成2 个精细胞，绒毡层消失，仅剩次生绒毡层壁 淀粉粒开始积累至液泡消 失之前 充满淀粉粒等内含物至3 －细胞花粉粒形成 8.5－9.0 8.5－9.0 小孢子有丝分裂形成营养细胞和生殖细胞，营养细 胞具中央大液泡，绒毡层仅剩残留物 小孢子进行有丝分裂至淀 粉粒出现之前 8.0－8.4 中央大液泡形成至小孢子 核移到萌发孔对侧 7.0－7.9 四分孢子散开至萌发孔出 现 萌发孔明显可见至中央大 液泡形成前 5.0－5.4 5.5－6.9 主要特征 小孢子母细胞呈多面体行，彼此相互紧贴，孢质浓 厚，药壁四层细胞分化 小孢子母细胞椭圆球形，经减数分裂各期最终形成 四分体，绒毡层的胞质开始浓缩 起止点 孢原细胞出现至小孢子母 细胞分裂前 小孢子母细胞减数分裂开 始至形成四分体形成 1.0－2.9
2.5
小孢子晚期
中央大液泡形成,小孢子核移至萌发孔对侧,核的体积增大,孢壁增 厚(图2-C),并大体上恢复了圆球形(图3-D)。由于这一时期核的位置及 中央大液泡的特点,在一些文献中,常称之为“单核靠边期”或“单核 大液泡期”。在小孢子中期到晚期,除小孢子的核由细胞中央向萌发 孔对侧的定向移动外, 还观察到细胞质的“定向移动”现象:即小孢 子核移至萌发孔对侧以后,在细胞核外侧聚集一股细胞质,向着萌发孔 方向伸展,形成“细胞质桥”(图3-D左上图箭头)。小孢子发育的同时, 药壁组织进一步降解。表皮及药室内壁细胞高度液泡化,中层细胞更 加狭窄(图2-A,B,C)。在此期间,绒毡层的胞质由浓缩成的“空腔”状 态(图2-A)逐渐变薄似带状(图2-B);当进入小孢子晚期,绒毡层细胞成为 山丘状,染色变淡,但大多数细胞仍有细胞核轮廓及较丰富的细胞质(图 2-C)。
2.3 小孢子早期
随着包围四分体的胼胝质壁的解体,四分孢子彼此分开,即进入 小孢子早期。在新鲜的整体花药内或游离状态下,早期小孢子呈现圆 球形或椭圆球形,小孢子“壁”隐约可见(图3-B)。实际上,在花药横 切片上,此时的小孢子仅具有极薄的初生细胞壁,细胞质均匀,细胞核 位于中央(图2-A)。
2.4 小孢子中期
1.3 实验说明
均采用树脂半薄连续切片显微技术，较之以往的石 蜡切片，可以得到水稻花粉发育过程的更清晰的形象， 包括某些现象的细节，有助于水稻胚胎发育过程中一些 胚胎学现象的解释。本研究共观察了350个各时期的小 穗材料,观察到从小孢子母细胞至成熟花粉的每一个时 期。 图版说明：Ta-绒毡层;Ml-中层;En-药室内壁;Ep-表 皮;Ms-小孢子母细胞;Vn-营养核;Gc-生殖细胞;Sc-精细 胞;V-液泡。
水稻花粉发育过程水稻的生殖生长阶段即幼穗的发育过过程划分成8个时 期,给育种应用和理论研究带来了很大的方便,一直被广泛采用。幼穗 的发育主要是雌、雄生殖系统即胚囊和花粉的发育。其中对于胚囊的 发育,刘向东等已作了系统的研究,并进行了分期。而对于花粉的发育 过程,前人也有一些报道,但已有的报道往往是不同学者出于不同的实 验目的,着重对小孢子发育的某一方面或某些阶段进行的研究,缺乏系 统性。并且,在用词和术语上不统一,造成了一些混乱,如对于同一个时 期,出现了单核晚期、单核靠边期、单核大液泡期等不同用法,这样就 不便于资料的分析和比较。出于此原因，我们就水稻花粉的发育过程 作进一步的研究。 研究在对固定的材料进行半薄切片观察的同时,又对新鲜的花药进 行整体观察及游离细胞的观察,进一步验证花粉发育中的真实形态,以 期能对水稻花粉发育过程作出准确的判断和分析,为相关的研究提供参 考。
2.2小孢子母细胞减数分裂期
花药进一步发育,小孢子母细胞之间渐渐分离, 进入减数分裂 阶段。本试验观察了从细线期到末期的减数分裂的各个时期。细 线期小孢子母细胞之间稍微分开(图1-D)。粗线期小孢子母细胞 核内出现明显可辨的染色线,同时细胞变成椭圆形状(图1-E)。到 了中期 ,染色体排列于赤道板上(图1-F箭头)。其后,由新的细胞壁 将其分隔成二分体(图1-G)。二分体分裂形成四分体细胞(图1-H、 图3-A ),四分体的平面平行于花药纵轴,这样每个四分孢子都能与 绒毡层直接接触。在同一个花药内,减数分裂过程并不是完全同 步的,但一般是处于相邻的时期(图1-F)。整个减数分裂期间的小 孢子母细胞、二分体及四分体均被胼胝质壁包围。在减数分裂过 程中,四层药壁细胞发生液泡化,开始降解过程(图1-D)。进入减数 分裂细线期,绒毡层细胞的内切向面及径向面的原生质体向细胞 中央退缩,胞质浓缩(图1-D)。粗线期时,绒毡层胞质进一步浓缩,周 边出现明显的“空腔”(图1-E箭)。直至二分体和四分体时,绒毡 层的胞质仍呈浓缩状态,染色很深(图1-G,H)。
当萌发孔的孔阜出现,细胞壁明显可辨时,即进入小孢子中期。 在此期间,小孢子增大,壁显著加厚,液泡增多,并逐渐合并成较大的 液泡,但尚未形成中央大液泡。细胞质相对稀少,并贴向细胞的周 边(图2-B)。在固定的花药的横切片上,小孢子外形多不规则(图2B),但从新鲜花药内释出的小孢子均呈规则的圆球形(图3-C,图3-C 左上图)。这一时期,在绒毡层内切向面,已可见颗粒状的孢粉素体 (图2-B箭头)。
2. 水稻花粉发育的分期及特点
通过对大量的新鲜花药进行 整体观察及游离细胞观察,以及 对固定的花药进行显微结构的 观察和分析,初步将水稻花粉发 育过程分为8个时期。
2.1 小孢子母细胞形成期
当小穗的内外稃刚刚合拢时,其内的花药呈四棱柱形。从横切面看,最外 层为单层表皮细胞,表皮下方在四个角隅处分化出孢原细胞(图1-A)。随后孢 原细胞进行平周分裂,形成初生壁细胞和初生造孢细胞。初生壁细胞进行两 次平周分裂形成中层细胞和绒毡层细胞(图1-B)。同时,初生造孢细胞进行有 丝分裂形成次生造孢细胞。次生造孢细胞经一次有丝分裂后发育为小孢子 母细胞(图1-C)。至此,小孢子母细胞形成,药壁分化出四层,从外到内依次是 表皮、药室内壁、中层和绒毡层(图1-C)。
2.6 二胞花粉早期
小孢子核第一次有丝分裂,形成两个细胞,即较大的营养细胞和透镜状 的生殖细胞。随后营养核向萌发孔方向移动,并在移动过程中体积增大(图 3-E左上图)。这一时期花粉继续增大,外形仍不规则(图2-D)。但在自然状 态下为圆球形(图3-E)。
2.7 二胞花粉晚期
当花粉内开始出现淀粉粒直至生殖细胞分裂之前,为二胞花粉晚期。由于淀粉 粒等物质首先在萌发孔附近积累,并在此处不断增加,液泡体积逐渐缩小,并被推至 萌发孔的对侧。生殖细胞逐渐与花粉壁脱离,移至营养核的附近,此时的花粉壁仍有 部分凹陷(图2-E),但在自然状态下为饱满的圆球形(图3-F)。绒毡层细胞的胞质降解 加速,仅有胞质残留,其内表面分布着颗粒状孢粉素体。
