质粒提取步骤protcol

质粒提取与分析是分子生物学实验中的基本技术之一，它是从细菌中提取和纯化质粒DNA，并对质粒DNA进行相关的分析和检测。

下面是质粒提取与分析的实验原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。

一、实验原理质粒是一种独立于细菌染色体之外的DNA分子，它不参与细胞的染色体复制，而是在细胞分裂时进行自我复制。

质粒提取的原理是通过物理和化学方法裂解细菌，释放出质粒DNA，然后通过离心、沉淀和洗涤等步骤将质粒DNA与细菌其他成分分离，最终得到纯化的质粒DNA。

二、所需试剂和耗材1.试剂：o溶液Ⅰ：10mmol/L Tris-HCl（pH=8.0）、1mmol/L EDTA （pH=8.0）、50mmol/L葡萄糖。

o溶液Ⅱ：0.1mol/L NaOH、1% SDS。

o溶液Ⅲ：3mol/L醋酸钾、20mmol/L Tris-HCl（pH=8.0）。

o70%乙醇。

o TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl（pH=8.0）、1mmol/L EDTA （pH=8.0）。

2.耗材：o移液器。

o离心管和离心管盖。

o 1.5ml微量移液器。

o无菌水。

o0.22μm滤膜。

o培养板和涂布器。

o细菌培养液（如LB液体培养基）。

o氯仿。

o异戊醇。

三、实验仪器1.实验室搅拌器。

2.高速冷冻离心机。

3.水浴锅。

4.无菌工作台或超净工作台。

5.紫外线分光光度计。

6.电泳仪和电泳槽。

7.显微镜。

8.恒温摇床或振荡器。

9.烘箱或微波炉。

10.量筒和烧杯。

11.计时器。

12.手套和实验服。

四、准备工作1.阅读实验步骤和注意事项，了解所需的试剂和耗材及其使用方法。

2.准备好所需的试剂和耗材，并确保它们处于保质期内。

3.检查实验室内是否具备上述实验仪器，并确保其正常运行。

4.用70%乙醇擦拭实验台面，以确保无菌环境。

5.用高压蒸汽灭菌法灭菌所有的实验器具，包括离心管、移液器等。

6.设置离心机的高速和低速离心参数，以及水浴锅的温度等参数。

提取质粒的主要步骤原理提取质粒是一种分离和纯化质粒DNA的常见实验技术。

质粒是细菌细胞内环状的DNA分子，通常用于基因克隆、转化、表达和基因组编辑等研究。

下面将详细介绍质粒提取的主要步骤原理。

1. 细菌培养：首先，选择含有目标质粒的细菌菌株进行培养。

通常使用大肠杆菌等常用实验菌株。

将细菌接种到含有适当营养物质（如LB培养基）的培养物中，并在适当条件下培养，如37摄氏度、220 rpm振荡培养。

2. 收获细菌：将培养至适当生长期的细菌用离心机离心，收集菌体沉淀。

通常使用1500×g离心10分钟，得到一个细菌菌体的沉淀。

3. 质粒裂解：利用物理或化学方法将细菌菌体裂解，释放内部的质粒DNA。

物理方法包括超声波处理和冻融法，而化学方法则涉及使用碱性裂解液（如SDS 和NaOH）。

该步骤破坏了细胞壁和细胞膜，以及核酸酶等酶的活性。

4. 蛋白质沉淀：为了去除细菌染色体DNA和蛋白质，可通过蛋白质沉淀步骤使质粒DNA纯化。

一种常用的方法是加入混合溶液，其中包含非离子性洗涤剂（如SDS）和蛋白酶K。

SDS具有溶解细菌膜和蛋白质的作用，而蛋白酶K能够降解杂质蛋白质。

该反应可以在高温条件下进行，如50-60摄氏度，以增加SDS和蛋白酶K的活性。

5. DNA沉淀：通过加入盐和酒精，可以使DNA溶液中的质粒DNA沉淀。

正常情况下，添加等体积的冷异丙醇，再加入适量的盐溶液。

因为质粒DNA在冷异丙醇和高盐浓度下更容易沉淀。

经过离心，沉淀的DNA可被分离出来。

6. 洗涤和溶解：将DNA沉淀洗涤一两次，以去除盐和其他杂质。

通常使用70%乙醇洗涤，再次离心以分离DNA沉淀，然后去除液体，使其干燥。

最后，用适当的缓冲液（如TE缓冲液）溶解质粒DNA，以得到高纯度的DNA溶液。

以上步骤提取质粒的主要原理如下：在收获细菌步骤中，细菌通过离心过程被分离出来，得到菌体沉淀。

在质粒裂解步骤中，通过物理或化学方法破坏细胞结构，释放质粒DNA。

质粒大抽protocol(用QIAGEN Maxi Column)2003/4/28陈俊1. 从转染的细菌平板中挑取中等大小，饱满，而且没有和其他克隆接触的单克隆，接种到3ml选择性培养基，摇床培养14小时,225 rpm。

2. 从小量培养物中取1ml用作小量抽提，并且用小量抽提产物酶切鉴定，选取阳性克隆的培养物，以1：1000接种到100 ml选择性LB培养基中，摇床培养14小时,225 rpm。

3. 从大量培养物中取700微升菌液和300微升甘油（灭菌）加入冻存管，放入液氮中，过夜后，放入-70℃冰箱中。

并且在stocklist中加入菌种的详细信息(stocklist 贴在冻存管的上方)。

4. 把100ml的菌液倒进250ml离心管中，4℃离心，6000g离心15分钟（No41 rotor 8500rpm）。

5. 倒掉上清，并倒扣在吸水纸上片刻．然后加入4ml 4℃预冷的细胞重悬液buffer P1（确定是否加了RNase）,反复吹打沉淀至没有悬浮的菌块。

然后将悬浮液转到50ml的离心管中。

6. 加入4ml细胞裂解液 buffer P2，彻底而且轻柔地颠倒混匀4-6次，在室温下孵育不要超过5分钟（从开始加P2时计时，时间太长会使质粒DNA断裂）。

样品不要斡旋，buffer P2用毕也要及时盖好盖子，以免被空气中的CO2酸化。

7. 加入4ml 预冷的PH调节液buffer P3,及时地而且轻柔（避免局部十二烷基磺酸钾沉淀）地颠倒混匀4-6次，在冰上孵育15分钟。

后再一次混匀样品．20000g，4℃离心30分钟（N046 rotor 18000 rpm）.若上清不够清需再离心15min. 此步可对上清取样240ul （sample 1）以备检测分析8. 在层析柱的顶端加四层纱布，并且用buffer QBT润湿纱布。

用4ml的buffer QBT来平衡层析柱，让液体自由的流下（尽量将润湿面积减到最小）。

质粒提取原理及步骤质粒提取是分子生物学中的一项重要实验技术，被广泛应用于基因克隆、基因转染、基因表达等方面。

本文将重点介绍质粒提取的原理及步骤。

一、原理质粒提取的原理基于质粒和细胞的生化学性质差异。

质粒是一种独立复制的DNA分子，可以自主复制并传递给细胞的子代。

而在真核细胞中，大多数DNA都位于细胞核中，很难获得足够的DNA量进行实验。

质粒提取利用了这一差异，将大量的质粒从细胞中提取出来。

质粒提取的主要步骤如下：二、步骤1. 细胞培养首先需要选择适当的细胞类型并在培养基中培养，使细胞处于最佳生长状态。

对于大多数细胞类型，建议在对数生长期时采集，因为此时细胞数量最多且代谢活跃，可以有效提高质粒提取的DNA量和质量。

同时，还需注意避免细胞因为过于密集而形成聚集体或凝胶。

2. 细胞收获收获细胞的方法取决于细胞类型和实验的目的。

常见的方法包括用PBS或细胞培养液将细胞冲洗下来，或者用胶体离心等方法进行细胞收获。

收获的细胞量需要根据实验需求进行调整，一般建议在0.1-1g的范围内收获细胞。

3. 细胞裂解细胞裂解是质粒提取过程中最关键的步骤之一，它能有效破坏细胞膜和核膜，释放细胞内的DNA。

常用的细胞裂解剂包括SDS、Triton X-100和Tween-20等，同时还需要将细胞裂解液加入蛋白酶抑制剂和DNA酶切酶，以避免核酸降解和一些酶促反应的发生。

细胞裂解后，将细胞裂解液转移到离心管中，并进行离心分离，将细胞碎片等大分子杂质通过离心将其剔除。

4. DNA纯化DNA纯化是质粒提取的最后一步，目的是将提取得到的DNA从其他杂质中纯化出来。

不同的实验需求需要不同级别的DNA纯化，从而需要使用不同种类的DNA纯化试剂盒。

目前常用的DNA纯化试剂盒包括酚/氯仿提取法、离子交换柱纯化法、硅胶膜纯化法等。

在DNA纯化后，通过分析电泳和UV测定等方法进行检测，以确保提取的DNA质量和浓度满足实验需求。

总结质粒提取是分子生物学中非常基础和常用的实验技术，其所涉及的步骤包括细胞培养、细胞收获、细胞裂解和DNA纯化等步骤。

质粒dna提取步骤
质粒 DNA 提取是分子生物学实验中的一项基本技术，用于从细菌细胞中分离出质粒DNA。

以下是一般的质粒 DNA 提取步骤：
1. 收集细菌培养物：将含有质粒的细菌培养在适当的培养基上，直到培养物达到合适的密度。

可以使用离心或过滤的方法收集细菌细胞。

2. 细胞裂解：将收集的细菌细胞加入裂解缓冲液中，通过物理方法（如搅拌、超声处理等）或化学方法（如加入裂解酶等）使细胞破裂，释放出质粒 DNA 和其他细胞成分。

3. 去除细胞碎片：将裂解后的混合液通过离心或过滤的方法去除细胞碎片和其他杂质。

4. 沉淀 DNA：向裂解液中加入乙醇或异丙醇等沉淀剂，使质粒 DNA 沉淀。

通过离心将沉淀收集。

5. 洗涤沉淀：用 70%的乙醇洗涤沉淀，以去除残留的盐分和杂质。

6. 干燥沉淀：将洗涤后的沉淀离心，并去除上清液。

然后将沉淀在室温下干燥，以去除残留的乙醇。

7. 溶解 DNA：将干燥的沉淀加入适当的缓冲液中，使质粒 DNA 溶解。

可以在缓冲液中加入 RNA 酶以去除 RNA 杂质。

8. 纯化和浓缩 DNA：可以使用柱层析、电泳或其他方法对提取的质粒 DNA 进行进一步的纯化和浓缩。

9. 质量检测：使用琼脂糖凝胶电泳或其他适当的方法检测提取的质粒 DNA 的质量和完整性。

需要注意的是，具体的质粒 DNA 提取步骤可能因使用的试剂盒或实验条件而有所不同。

在进行质粒 DNA 提取之前，应仔细阅读所使用的试剂盒说明书或相关实验方案，并根据实际情况进行适当的调整和优化。

质粒提取是分子生物学中常用的实验技术，其目的是从细菌中提取出质粒DNA，用于后续的基因操作和分析。

下面是质粒提取的主要步骤和原理的详细解释。

一、质粒提取原理
质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。

作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。

在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。

从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。

二、质粒提取步骤
培养细菌使质粒扩增：将含有目标质粒的细菌接种在适当的培养基上，提供适当的条件（如温度、湿度和营养）使细菌生长和繁殖，从而使质粒得到扩增。

收集和裂解细菌：通过离心等方法收集培养好的细菌，然后使用适当的裂解液裂解细菌，使细菌的细胞壁和细胞膜破裂，释放出内部的质粒DNA。

分离和纯化质粒DNA：通过离心、过滤或层析等方法，将裂解液中的蛋白质、细胞碎片等杂质去除，得到相对纯净的质粒DNA。

这个过程中可能需要使用一些特殊的试剂或柱子来提高分离和纯化的效率。

通过以上步骤，我们可以从细菌中提取出高质量的质粒DNA，用于后续的基因操作和分析。

质-粒-提-取-原理及步骤概述质粒提取，又称DNA提取，是一种分离和提取所需DNA的过程。

质粒提取在许多实验中都是非常重要的步骤，例如基因工程、分子生物学、遗传学和其他DNA相关实验。

本文将介绍质粒提取的原理及步骤。

原理DNA提取的过程通常包括细胞破碎、DNA纯化、DNA溶解和复性等步骤。

对于质粒提取，主要步骤通常包括以下内容：1.细菌培养：在质粒提取之前，需要将细菌培养在含有适当抗生素的培养基中，用于扩增质粒数量。

2.细胞破碎：使细胞破裂以释放出含有质粒的细胞内物质，此步骤需要进行严格的抗污染措施，以避免污染质粒样本。

3.除去污染物：除去细胞壁、蛋白质、核酸和其他污染物。

4.离心分离：将上述步骤中提取出的样本进行离心分离，使DNA沉淀，以便进一步纯化。

5.溶解：通过加入一定的缓冲液或去离子水，使DNA重新溶解。

步骤以下是一种常见的质粒提取步骤：1.处理样本：将含有所需质粒的细胞收集，并进行初始处理，包括细胞壁破裂、核酸纤维溶解等。

2.傅里叶纯化：通过傅里叶变换纯化，将细胞内杂质和有机污染物清除。

3.离心分离：将细胞样本离心，使DNA沉淀到底部，并且将上层样本移除。

4.乙醇沉淀：加入乙醇沉淀，将DNA纯化到上清液。

5.重振溶解：最后使用适当缓冲液重振重振溶解DNA，也可以使用去离子水重振。

以上就是质粒提取的原理和步骤，这是一个非常重要的操作，在DNA研究和实验中有着广泛的应用。

我们需要注意的是，在操作过程中需要进行高标准的质量控制，以确保实验结果的准确性。

通过大肠杆菌扩增质粒1.配2.5L LB培养液。

组分（1L培养液中）：Tryptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl10g。

2.溶解三种按比例称好的组分于800ml去离子水中，用1M NaOH调节PH7.0，定容到1L。

高压灭菌。

3.配制卡那霉素工作液30mg/ml，使用时以1:1000的比例加入培养基中，即工作液浓度为30ug/ml。

4.从-70℃冰箱中取出带有pEGFP质粒的DH5α大肠杆菌，取适量接种于含有30ug/ml卡那霉素的5-10ml LB培养基，在37℃剧烈震摇（300rpm）8h。

5.将小摇的菌液以1/500-1/1000转接到2.5L含30ug/ml LB培养液中，在37℃剧烈震摇（300rpm）12-16h。

3.1.2质粒的大提1.6,000g，4℃，离心15min，倒掉上清，收集细菌细胞沉淀。

2.用125ml buffer P1重新混悬细胞。

涡旋或上下颠倒至细胞无细胞沉淀。

3.加125ml buffer P2，温和混合，颠倒4-6次（不可涡旋），指示剂颜色变为蓝色，然后在室温下静置5min。

用后迅速盖上buffer P2盖子，防止buffer P2被空气中的CO2酸化。

4.加125ml冷冻后的buffer P3，立刻颠倒温和混匀4-6次，至液体颜色由蓝转白，并在冰上孵育30min。

5.20,000g，4℃，离心30min。

迅速转移含有质粒DNA的上清。

将得到的上清同样的条件再次离心15min，取上清待用。

6.用75ml buffer QBT平衡QIAGEN-tip 10000，使其在重力作用下流完。

7.取步骤5得到的上清，上样。

让样品在重力作用下进入树脂。

8.用600ml buffer QC清洗QIAGEN-tip。

重力作用下过柱。

9.用100ml buffer QF洗脱柱子，并收集待用。

3.1.3质粒的纯化和浓度测定1.室温下加入70ml异丙醇，沉淀出DNA。

QIAGEN large-Construct Kit提取过程：准备工作：(1)100mlATP溶液：2.75g无水的ATP-Na2溶解于40ml双蒸水，用10MNaOH(约1ml)调pH至7.5，用双蒸水定容至50ml，分成300μl每小份保存于-20℃。

(2)将RNaseA(220μl)溶液加入Buffer中，每瓶P1加一支RnaseA(用前离心)，终浓度为100ug/ml。

(3)将225μlExonclease Solvent溶液加入ATP-Dependent Exonclease中，轻轻混匀。

放置15min，不要激烈振荡，使其充分溶解。

(4)检查P2中是否有SDS沉淀，如果有则溶解沉淀的SDS。

(5)在4℃下预冷P3。

(6)65℃预热QF Buffer。

提取步骤：(1)从新制备的平板上挑取单克隆接种于2～10ml含有氯霉素（终浓度为12.5ug/ml）的LB液体培养基中，37℃，300rpm摇床培养大约8h。

（培养基的体积不超过培养瓶体积的1/4）(2)取0.5～1ml菌液接种至500mlLB培养基中，即按1/500或1/1000的比例接种。

37℃，300rpm摇床培养12～16h（使细胞密度达到3～4*109/ml）。

（培养基的体积不超过培养瓶体积的1/4）(3)4℃，4000rpm（6000g）离心15min，以收集菌体。

此菌体沉淀可存放到-20℃冻存。

(4)用20ml P1 buffer充分悬浮菌体（用P1 buffer前检查是否添加了RNaseA，此步务必要充分悬浮以使菌体裂解充分）（如果没有60ml大小的管子，则可以将重悬后的细菌分到两个50ml的管子中，分别处理完第（5）（6）步在第（7）步后再混合到一起）。

(5)加20ml P2 buffer，轻柔颠倒4～6次，混匀，室温放置5min。

此步加入P2buffer后要立即盖上盖子，以防止空气中的CO2与Pbuffer作用，同时放置时间不能超过4min，此时不能剧烈摇晃。

Omega 质粒小提试剂盒protocol主要试剂1. 使用前，将RNase A全部加入Solution I中并于4度保存。

2. 按下表用无水乙醇稀释DNA Wash Buffer，并于室温保存。

D6942-00: 加入6 ml无水乙醇D6942-01: 加入120 ml无水乙醇3. 按下表用异丙醇稀释HBC Buffer，并于室温保存。

D6942-00: 加入1.6 ml无水乙醇D6942-01: 加入16 ml无水乙醇D6942-02: 加入32 ml无水乙醇试剂配方及作用Solution I组分浓度25 mM Tris-HCl（pH8.0）,10 mM EDTA,50 mM 葡糖糖（Glucose）溶液1的主要作用是将菌体沉淀悬浮起来。

25mM Tris-HCl是缓冲溶液，保证反应体系的pH 恒定。

EDTA是金属离子螯合剂,10 mM EDTA的作用是与微生物体内的金属离子相互结合，抑制DNase的活性。

50 mM葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，保证菌体悬浮，延缓菌体沉降的时间。

溶液1在使用前通常要加入RNA酶（RNase A）,RNA酶的作用很清楚，降解掉溶液中的RNA。

由于RNA酶属于蛋白质，蛋白质稳定性很差，所以加了RNase A的溶液1需要低温4℃保存。

Solution II组份浓度250 mM NaOH,1％（W/V）SDS（十二烷基硫酸钠）溶液2的主要作用是细胞裂解。

溶液1将细胞悬浮后,就需要添加溶液2了,溶液2的作用就是对细胞进行裂解。

溶液2只包括两种成分：氢氧化钠和SDS。

真正起到到细胞裂解作用的是氢氧化钠,这也是为什么这个方法会被叫做碱裂解法。

氢氧化钠会破坏细胞膜的结构,使之发生bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化,从而导致细胞的裂解。

SDS的作用将在下一步提到。

添加溶液2后需要注意的一个是时间一定不能过长,另一个是不可以剧烈震动离心管。

时间过长以及剧烈震动都将导致氢氧化钠破坏基因组DNA,断裂的基因组DNA碎片将会与相似大小质粒一同被抽提,污染样品。

质粒提取步骤protcol质粒提取步骤（去除内毒素的kit）准备：挑取单克隆后摇菌12-16小时‘异丙醇，无水乙醇，1.5毫升无酶EP管，无菌去离子水，涡旋在SOLUTION 1中加入RNASE A 保存在4度冰箱DNA W ASH buffer中加入无水乙醇，室温保存HBC Buffer 中加入异丙醇，室温保存检查SOLUTION 2是否沉淀，若有沉淀，加热到37度溶解N3缓冲液放在冰上热块加热到42 度，或者水浴锅，还有一个，加热到70度离心机转速5000XG微凉离心机13000XG步骤：1、摇菌2、收集菌液，5000XG，室温离心，10min3、弃掉上层培养基4、加入500ul SOLUTION 1/RNASE A ，涡旋或者抽吸，彻底混匀。

重悬完全能获得好的结果5、转移细胞到新的2ml离心管中6、加入500ul SOLUTION 2，涡旋或轻柔旋转数次，获得澄清裂解液，孵育2-3min，注意避免用力混合，否则会剪切染色体DNA，降低质粒纯度，不要让裂解液反应超过5min，SOLUTION 2要盖紧，防止空气中的CO2导致其酸化7、加入250ul冰浴预冷的N3 Buffer，轻柔颠倒数次，直到形成白色絮状沉淀（除蛋白）Buffer必须充分混合，如果混合液是粘的，棕色的，成团的，需要更多次混合完全中和SOLUTION。

完全中和绝对影响结果。

8、最大转速（大于13000XG），离心10min,形成白色沉淀，迅速进行下一步9、将清澈的裂解有转移到1.5ml EP管，量取清澈的裂解液的体积10、加入1/10的ETR溶液，此时会浑浊，颠倒EP管10次，彻底混匀如果转移500ul清澈裂解液，就加入50ulETR溶液11、冰上孵育10min,在孵育过程中，颠倒混匀数次，冰上裂解后悔澄清，2min/次12、裂解液42度孵育5min,裂解液又会出现浑浊13、25℃12000XG，离心3min,,ETR溶液在管底部14、将上层水相转移到一个新的1.5ml EP管中，加入1/2体积无水乙醇，轻柔颠倒6-7次，室温培养1-2min15、将小柱加入2ml管中，注意：选择性步骤：小柱是否处理16、将700ul混合液加入小柱中17、最大转速（大于13000XG），离心1min,18、弃去滤液，重新放回19、重复16-18，所有的东西都保存在柱里20、加入500ul HBC Buffer 注意加入异丙醇21、最大转速（大于13000XG），离心1min,22、弃去滤液，重新放回23、加入700ul DNA wash buffer 注意加入无水乙醇24、最大转速（大于13000XG），离心1min,25、弃去滤液，重新放回26、重复步骤23-25，27、最大转速空载离心2min,使管干燥，残余乙醇有干扰28、将滤柱放于1.5ml EP管中29、加入80ul洗脱缓冲液或者无酶水，直接加到中间，主要看穿着和穿着的悬液。

大抽protocol（200ml）1：4度，6000rpm，10min，离心菌。

2：4ml溶液1（见分子克隆）重悬。

3：8ml溶液2（0.2MNaOH，1%SDS）裂解，轻颠5-10次，室温10min。

4：4ml溶液3中和，轻颠5-10次，冰上15分钟。

5：4度，20000g，离心45min。

6：上清与0.6倍体积异丙醇混匀，室温10min，离心室温12000rpm，15min。

7：75%乙醇刷洗一遍，离心10min。

8：3ml水溶解充分（很重要）。

9：加入3ml冰预冷的5M Licl混匀，离心4度12000rpm，10min。

10：倒出上清加入等体积异丙醇充分混匀静放10min，离心室温12000rpm，10min。

11：75%乙醇刷洗一遍，离心10min，晾干（重要）。

12：500微升含RNAase（300微克/ml）溶解，37度放60min。

13：酚：氯仿（1：1）抽提一次，若不干净再抽一次（很重要）。

14：加入2倍体积无水乙醇再加入1/10体积乙酸钠充分混匀，室温沉淀15min，离心12000rpm，室温10min。

15：1ml水溶解沉淀（重要），再加入0.5mlPEG-Mgcl2混匀，室温静放20min，离心室温12000rpm，20min。

16：沉淀0.5ml75%乙醇洗两遍，4度离心20000g ，5min。

17：吸去乙醇晾干（重要）。

18：用100-500微升水溶解质粒，测OD值，然后分装。

注意：加入溶液II和溶液III后操作应混和,切忌剧烈振荡。

由于RNA酶A中常存在有DNA酶,利用RNA酶耐热的特性,使用时应先对该酶液进行热处理(80℃1小时),使DNA酶失活。

.加入溶液2后不要剧烈振荡，只需轻轻颠倒几次离心管。

2.加入溶液3后，复性时间不宜过长，一般是5分钟，否则会使染色体复性。

3.在用苯酚、氯仿抽提时应用TE缓冲液将原溶液的体积扩大，一般是200～300 微升，以减少DNA的损失。

质粒提取试剂盒提取步骤
一、质粒抽提
1、细胞抽提：将细胞培养物加入或移植到一种含有高浓度酸性剂的6-8mm离心管里，将细胞离心至半浸没，以保持溶液沉积在离心管壁上。

2、除去膜：添加浓酸溶液（如硫酸氢钠（NaHSO3）），膜结构会被溶解，使其细胞表面的结构被破坏，从而除去细胞的膜。

3、去染色：添加RNA隔离试剂，脱去细胞染色物质以获得高纯度的RNA质粒。

4、离心：离心至接近干旱，并移除液体，这时的混合液中已只剩下RNA质粒。

5、抹拭：将离心管倒过来，将质粒在管壁上均匀抹拭，这时的RNA 质粒就会在管壁上附着。

6、冷冻干燥：将管子放到冰上，将管子中的水分蒸发冷冻干燥，使RNA质粒固定在管壁上。

7、溶解：最后，将RNA质粒溶解到可以用于后续实验的溶液中。

二、PCR扩增：
1、PCR建库：将抽提的DNA放入PCR管中，加入PCR反应混合液（包括DNA聚合酶、dNTPs和MgCl2），并添加特长引物，即可进行PCR 反应。

2、PCR扩增：使用PCR反应温度循环加热并添加高分子量DNA来将DNA片段扩增。

3、电泳：将PCR配型片段送到电泳仪中，使用添加特异性引物的特定电泳条件，检测和鉴定基因突变。

提取质粒的主要步骤质粒提取是分子生物学实验中的一项重要技术，用于从细菌中提取质粒DNA。

质粒DNA是细菌细胞中的一种环状DNA分子，具有自主复制的能力，因此在分子生物学研究中广泛应用。

下面将详细介绍提取质粒的主要步骤。

步骤一：培养细菌第一步是培养携带目标质粒的细菌。

在选择培养基时，应根据质粒的抗生素耐受性选择含有相应抗生素的培养基。

将含有质粒的细菌接种到含有抗生素的培养基中，并在适当的温度下培养细菌。

步骤二：细菌增殖在合适的培养条件下，将细菌培养到较高的密度，以便从中提取足够的质粒。

细菌增殖时间的长短取决于细菌的生长速度和所需的质粒数量。

步骤三：收获细菌当细菌培养到适当的密度时，将菌液进行收获。

可以通过离心将菌体沉淀下来，然后去除上清液，或者使用其他方法收获细菌。

步骤四：裂解细菌细胞在这一步中，需要将细菌细胞裂解以释放质粒。

常用的方法是使用裂解缓冲液，通过机械、物理或化学手段破坏细菌细胞壁，使细菌DNA和质粒DNA被释放出来。

步骤五：纯化质粒DNA在这一步中，需要将裂解液中的杂质和细菌残余物除去，以纯化质粒DNA。

常用的方法是使用离心来分离质粒DNA和其他细胞成分。

离心后，上清液中的质粒DNA可以通过吸附剂或其他纯化方法进一步提纯。

步骤六：测定质粒DNA的浓度和纯度纯化的质粒DNA通常还会带有一些杂质，如RNA、蛋白质和副产物等。

因此，需要对提取得到的质粒DNA进行浓度和纯度的测定。

常用的方法有比色法、光谱法和凝胶电泳等。

步骤七：存储质粒DNA提取得到的质粒DNA可以进行存储，以备后续实验使用。

常见的质粒DNA存储方式有冷冻保存和冻干保存等。

以上是提取质粒的主要步骤，这些步骤在实验中是相互关联的，需要严格按照操作流程进行，以确保提取质粒的质量和纯度。

同时，不同的实验目的可能需要有所调整和优化，具体操作时需要根据实际情况进行调整。

质粒试剂盒提取质粒流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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Wizard○R Purefection Plasmid DNA Purification System protocol所用试剂盒为Promega公司的Wizard○R Purefection Plasmid DNA Purification System，能够去除对细胞有害的细菌内毒素。

具体操作步骤如下：（1）将5ml 培养过夜的阳性菌在室温(24℃)下10000×g离心10 min。

弃上清，将离心管倒置至吸水纸上去除剩余水分。

（2）加入250µl 重悬液，振荡至完全重悬。

（3）加入250µl细胞溶解液，颠倒离心管6～8次，彻底混匀。

室温孵育5min。

（4）加入350µl中和液，立即颠倒离心管6～8次，彻底混匀。

（5）室温下10000×g离心细菌溶解产物20min，上清移至新的1.5 ml 离心管，再次离心20 min，将上清移至新离心管。

（6）彻底摇匀除内毒素树脂，加50µl到离心管中，室温孵育10 min，在孵育过程中每隔3 min剧烈振荡5 sec。

（7）将离心管放置于磁珠分离架使溶液变清，颠倒磁珠分离架和离心管，去除附着在离心管壁和顶盖上的液体。

放置至液体澄清后30 sec，吸取上清至新离心管，弃去沉淀。

（8）加入200 µl GTC（5M/L），与上步分离的上清剧烈振荡混和。

如果GTC产生沉淀，37℃加温10min，冷却到25℃使用。

（9）彻底重悬磁珠，加150 µl至溶液中，剧烈振荡混和，室温孵育2～3 min。

（10）将离心管放置于磁珠分离架使溶液变清，颠倒磁珠分离架和离心管，去除附着在离心管壁和顶盖上的液体。

放置至液体澄清后30 sec，弃上清，离心管继续放置2～3min，去除剩余液体。

（11）将离心管从磁架上取出，加入200 µl 4/40洗脱液。

剧烈振荡15sec 重悬磁珠微粒。

4/40洗脱液可以去除无关蛋白，如核酸酶。

质粒构建一，引物设计:1,选择合适的载体。

酶切位点及其顺序（酶切位点的顺序一定不能颠倒）。

2，在NCBI上再次确认目的片段的碱基序列。

1，使用word2，设计引物：primer-upPrimer-down3，核对----送公司合成。

4，对公司合成的引物离心，10000rpm、5-10分钟、at 4℃，在超净台按照管子上标注的体积加入DEPC水（如46nmol就加入46ul，震荡混匀后分装,取10ul加入90ulDEPC水），分装出来的引物 4℃保存。

其余的—20度保存。

二，PCR（P出目的片段）：（一）、从菌液里P出目的片段：11ul实验室的菌液，相应的抗生素94℃ 5min菌液1ul 94℃ 30sec2x PFU mix 25ul 58℃ 30secPrimer 1ul 72℃ X min2d H2O 23ul 72℃ 5min（X是根据片段的长度设定，500-1000bp/min，退火温度根据Tm值来计算，一般低于Tm值2℃）3，跑胶、回收:（1），配胶：称0.5g的琼脂糖加入50ml的1X TAE加入1.5ul的EB50-60℃左右时) 25分钟后，即可点样跑胶。

（2），跑胶：130-150V、25-30分钟左右。

（3），紫外灯下观察，切胶（要带防护手套和口罩）4，做胶回收（天根{TIANGEN}公司的DNA纯化回收试剂盒）:1、55度开启2、切胶，PN液500ul(100ul/1ug)，55度，10分钟，后置入冰盒中1min3、CA2管加500ulBL液，2000rp,1min4、将胶分两次加入CA2管中，离心1min5、弃废液后离心2min6、分两次加入PW液各600ul，5min后离心1min7、开盖2min8、放入新的EP管中，加入35ulEB液放置2min,离心1min,置于4度冰水中对胶回收的产物跑胶验证。

可建立10ul的体系：回收产物2ul、10xloading buffer 2ul、2d H2O 6ul。

质粒dna提取方法质粒DNA提取是一种常见的实验操作，主要目的是从细菌中提取质粒DNA，以进行后续实验操作，比如质粒转化、质粒测序等。

下面将详细介绍质粒DNA 提取的步骤及方法。

质粒DNA提取的步骤：1. 细菌培养：选择适当的培养基，将所需的细菌接种培养。

培养时间可以根据需要而定，一般为12-18小时。

2. 细菌收获：培养至合适的细菌株数量后，通过离心将菌体沉淀下来。

取出超上清液，保留细菌沉淀。

3. 打断细菌细胞：将细菌沉淀用适当的缓冲液悬浮均匀，加入裂解酶及改性蛋白酶K等酶，使细菌细胞壁及细胞膜打断。

4. 裂解细胞膜：加入裂解液，如碱性SDS溶液或绝对醇等，使细胞膜破裂。

5. 分离细胞核酸：通过盐析法或有机溶剂法，将细胞核酸与其他杂质分离开来。

6. 质粒DNA纯化：使用离心管柱或硅胶膜柱等纯化方法，将纯化后的质粒DNA 获取。

7. DNA沉淀：用乙醇沉淀纯化后的质粒DNA，并通过离心去除沉淀液。

8. 质粒DNA溶解：用适当的缓冲液溶解提取的质粒DNA，并进行质量分析和浓度测试。

以上是一般常用的质粒DNA提取步骤，下面将介绍几种常见的质粒DNA提取方法：1. 碱裂解法（Alkaline lysis）：使用碱性溶液裂解细菌细胞，破坏细胞壁以释放质粒DNA。

该方法简单快速，适用于提取小规模的质粒DNA。

缺点是提取的质粒DNA纯度较低。

2. 硅胶膜柱法（Silica membrane column）：将裂解后的细胞溶液加载到硅胶膜柱上，通过离心和洗涤步骤去除杂质，然后将纯化的质粒DNA洗脱。

该方法纯化效果好，适用于提取高品质的质粒DNA。

3. 盐析法（Salt precipitation）：通过加入高盐溶液使丙酮沉淀蛋白质，并用乙醇沉淀质粒DNA。

该方法适用于大规模质粒DNA提取，但质量稍逊于硅胶膜柱法。

4. 酚-氯仿法（Phenol-chloroform extraction）：将细菌溶解液加入含酚和氯仿的混合溶液中，破坏细菌细胞膜，并使DNA降解酶失去活性。