免疫组化染色SP法

免疫组织化学染色原理和操作步骤一、免疫组织化学原理免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。

免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。

间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。

PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP 复合物孵育标本，最后用H2O2和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。

生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。

亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。

ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。

在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB 进行显色。

ABC法的敏感性较PAP法更高。

图1. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）SP法与ABC法相似，其不同于ABC法之处在于用生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。

在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。

与亲和素相比，链酶亲和素的结合力与亲和素相似而非特异性结合较亲和素低。

一、免疫组化技术免疫组织化学（Immunohistochemistry"HC）技术是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。

目前，这种技术在临床病理诊断和形态学研究中已得到广泛应用。

Slide 3:（一）、免疫组化常用染色方法和步骤（石蜡切片）SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）:SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）原理采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。

主要步骤:主要步骤1、石蜡切片脱蜡（与常规HE切片脱蜡相同）：石蜡切片置60 ℃ 烤箱烤片15小时以上一从烤箱中拿出立即放入二甲苯I中5~10 min一二甲苯II 5~10min 一无水乙醇5min 一95%乙醇5min 一80%乙醇5min 一70%乙醇5min 一自来水洗Slide 6:2、3%H2O2阻断20min （以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；PBS 洗3次，每次5min。

3、抗原修复；PBS洗3次，每次5min。

4、滴加5~10% 正常山羊血清封闭，37℃, 10min （消除背景非特异性着色）Slide 7:5、吸干组织周围多余的血清，不洗，滴加第一抗体，37℃,孵育60min或孵育30min 再4℃冰箱过夜；PBS洗3次，每次5min。

6、擦干组织周围PBS, 滴加生物素标记的第二抗体，37c 孵育20min, PBS洗3次，每次5min。

Slide 8:7、擦干组织周围PBS,滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液37c 孵育20min。

8、PBS洗3次，每次5min, D.W洗2次，DAB显色（DAB必须现用现配），镜下控制显色程度，自来水冲洗，苏木素复染胞核，烤干，中性树胶封片。

染色步骤:染色步骤石蜡切片脱蜡到水；3%H2O2阻断10min （以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；蒸馏水洗2次，PBS洗3次，每次5min。

三步法（SP系列），实验步骤使用说明：SP9001（兔）适用于兔来源的一抗SP9002（小鼠）适用于小鼠来源的一抗SP9003 （山羊）适用于山羊来源的一抗SP9000 (通用型) 适用于兔，小鼠，大鼠来源的一抗3.0ml- 价格￥230.00 / 6.0ml- 价格￥380.00 / 18ml- 价格￥1080.00试剂盒规格及贮存条件规格：3ml（50片）/6ml(120 片)/18ml(360 片)贮存条件：本试剂盒宜4℃保存，稳定期1 年一﹑试剂盒内容试剂1 封闭用非免疫的驴血清工作液（含10%驴血清）即用型试剂2 生物素化二抗（驴抗兔/鼠/山羊）即用型试剂3 链酶卵白素-碱磷酶轭合物即用型试剂3 过氧化物酶标记链酶卵白素即用型实验步骤简介：1. 细胞爬片：冷丙酮或4%的多聚甲醛固定的细胞爬片，置0.1mol PBS 室温10分钟复水。

2. 修复：滴加复合消化液（0.125胰蛋白酶% +0.1胃蛋白酶%+0.01 EDTA% ）（0.1molPBS 配制）4度30-40分钟0.1mol PBS 洗三次，每次一分钟3. 血清封闭：（试剂1）室温10分钟，倾去。

4. 一抗：37℃1小时或4度过夜5. 0.1mol PBS 洗三次------每次三分钟6. 相应的生物素化二抗（试剂2）37℃30-40分钟7. 0.1mol PBS 洗三次------每次三分钟8. 链酶卵白素-碱磷酶轭合物或过氧化物酶标记链酶卵白素（试剂3）37℃40分钟9，NBT/BCIP或DAB显色，切片经梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能酒精脱水，而直接用水性封片剂。

灏洋生物15:14:49名称：connexin 43产品编号：CM7269价格/规格：0.1ml/20ug技术指标：小鼠抗人，大鼠，小鼠单克隆抗体Ig分类：IgG2a适用组织：冰冻/石蜡阳性部位：细胞浆组织处理：0.1mol枸橼酸缓冲夜-热修复15分钟（95度）产品说明：产地: Cellscience二步法（无生物素PV6000系列），实验步骤使用说明：试剂盒组成试剂A: 3% H2O2试剂B: Polymerized HRP-Anti Mouse或Rabbit IgG 3.0ml/6.0ml/18ml（根据一抗宿主而定）PV6001（兔）适用于兔来源的一抗PV6002（小鼠）适用于小鼠来源的一抗PV6000 (通用型) 适用于兔，小鼠，大鼠来源的一抗3.0ml- 价格￥300.00 / 6.0ml- 价格￥580.00 / 18ml- 价格￥1780.00试剂盒规格及贮存条件规格：3ml（50片）/6ml(120 片)/18ml(360 片)贮存条件：本试剂盒宜4℃保存，稳定期1 年免疫组化染色步骤1. 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗三次，每次3分钟（3x3`）。

免疫组化（SP 法） 第一天 (5h)准备：60℃ 烘片2-4h1. 二甲苯脱蜡1 30min2. 二甲苯脱蜡2 30min3. 100% 乙醇 10min 2次4. 95% 乙醇 3min5. 85% 乙醇 3min6. 75% 乙醇 3min7. ddH 20 1min 2次 轻晃以防掉片8. 抗原修复：使用1L 烧杯，9ml 柠檬酸（0.1M 现配）溶液和41ml 柠檬酸钠（0.1M ）加450ml ddH 20（ph=6）罩上锡纸，封烧杯口，扎洞若干，煮沸20min （可先煮沸再放片子，也可以先放片子再一起煮，温度先调至420℃多，煮沸后调到250℃左右，计时15-20min ）之后自然冷却（30-40℃） 9ml 柠檬酸配法：9ml ddH 20加0.18g 柠檬酸。

可以直接称取0.18g 柠檬酸加41ml 柠檬酸钠加450ml 水0.1M 柠檬酸钠配法：29.41g 柠檬酸钠加入1L 蒸馏水中，或14.7g 加入500ml 蒸馏水中9. 3%H 202孵育10min （200ml，盒子装，现配，用甲醇稀释30%H 202至3%H202）以消除内源性过氧化物酶活性（内源性过氧化物酶能与HRP 反应，造成假阳性），PBS 冲洗3min 3次10. 加试剂A （山羊血清，起到封闭作用）一滴（蓝色）室温孵育10-15min 盖盖防干，倾去勿洗，先甩再擦（试剂A,B,C 放在1号冰箱侧门，擦干玻片，放在湿盒里，盒子两侧不要放玻片，以防接触到盒壁，抗体流出，要求试剂刚好覆盖组织，全部滴完计时10min ，用黄枪头抹匀试剂）11. 加一抗，4℃过夜，25-50ul 每个组织，一抗用PBS 稀释，4℃放置，加完一抗后，先不要盖盖，放到冰箱里后再盖盖第二天(3h)12.PBS 3min 3次（将1xPBS倒进盒子里，里面放架子，片子甩干后放进架子里）13.加试剂B（黄色）室温孵育10-15min，盖盖（试剂B是生物素化的二抗，能与一抗结合）14.PBS 3min 3次15.加试剂C（橙黄色）室温孵育10-15min，盖盖（试剂C是HRP标记的链霉亲和素，一个亲和素可以与四个生物素非共价键结合，不可逆，结合紧密。