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石蜡切片免疫组化染色步骤石蜡切片免疫组化染色是一种常用的组织学染色技术，它能够通过染色反应检测组织中的蛋白质分子、细胞因子、细胞膜受体和细胞核因子等，为研究细胞和组织的功能以及疾病的发生机制提供了重要的工具。
下面将详细介绍石蜡切片免疫组化染色的步骤。
1.组织固定组织固定是石蜡切片免疫组化染色的第一步，它的目的是保持组织形态和结构，使得后续的染色步骤能够成功进行。
常用的固定方法有甲醛固定、醋酸盐固定和乙醇固定等。
其中，甲醛固定是最常用的方法，它可以固定组织细胞的形态和结构，同时减少细胞中的酶活性。
2.组织处理组织处理是将固定后的组织进行处理以便得到合适的切片和染色结果。
处理过程主要包括去水化、脱脂、透明化和浸渍等。
其中，去水化是将固定的组织从水中逐渐转移到无水乙醇中，以防止组织中的水分对后续蜡包埋产生干扰；脱脂是将组织中的脂肪酸等去除，以减少重组过程中的背景染色；透明化是将组织从乙醇中转移到透明剂中，以便光线穿过组织时不受阻碍；浸渍是将透明剂中的组织浸渍入蜡中，使其成为切片的固定基质。
3.蜡包埋蜡包埋是将处理后的组织浸入熔化的石蜡中，使其固定在蜡块中，并利用蜡的硬度和韧性将组织完整地包裹起来。
蜡包埋过程主要包括浸渍、浸透和固化等步骤。
其中，浸渍是将固定在透明剂中的组织浸渍入熔化的蜡中，以提高组织与蜡的亲和性；浸透是将融化的蜡逐渐浸透入组织内部的过程，以保持组织的完整性；固化是将蜡冷却固化，使其成为切片的固定基质。
4.制备切片制备切片是将包埋在蜡中的组织切成适当的厚度，以便后续的染色和观察。
制备切片的步骤主要包括切片机调节、切片和玻片浮法三个步骤。
其中，切片机调节是将切片机调整到适合的刀片和切片速度，以保证切片的质量和均匀性；切片是将包埋的组织从蜡块中切下，并将其转移到切片水槽中；玻片浮法是将切片从切片水槽中捞起，并将其平铺在预处理的玻片上。
5.脱蜡和重组脱蜡和重组是将切片上的蜡去除，并将组织重组成适合的形式，以便后续的染色步骤。
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法1、组织得采集、固定与保存:采取组织后,方法一:4％多聚甲醛(4％ＰＦＡ)4︒Ｃ固定1小时(根据组织大小与致密程度调整固定时间)或过夜方法二:采用boｕｉn’s固定ＲT 2h(6—8dｔeｓis)or RＴ过夜(成年tesiｓ)PBS缓冲液洗三次,每次5ｍin,4︒C保存于7０%乙醇中。
２、组织得包埋、切片、展片及保存::固定后得样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明,５2－54︒C石蜡包埋,常规切片,切片厚4—１０μm,贴于处理过得干净载玻片上,37︒C烤片过夜,之后收集于载片盒中,RT密封保存。
石蜡包埋:保存于４︒Ｃ70％乙醇中得组织样品↓80％乙醇1５ｍin↓95%乙醇15 miｎ↓1０0%乙醇15mｉｎ⨯ 2↓1/2乙醇１／２二甲苯15 ｍin↓二甲苯透明5-１0 min↓1／２二甲苯１/2石蜡３0 min↓石蜡(1) 1。
5hｒ↓石蜡(2) 1.5－２.5hr↓石蜡(3) 包埋↓RT保存3、石蜡组织切片得免疫组化方法:密封保存于RT得组织切片↓二甲苯(1) 20 min↓二甲苯(2)20ｍin↓100％乙醇20ｍin↓95％乙醇10 min↓8０％乙醇10miｎ↓通风橱晾干,阻水笔在组织周围画圈↓切片在ＰBS中浸泡 5 ｍin＊2↓0.4%Tritonx RＴ10 mｉn↓切片在PＢS中浸泡 5 min＊3３％H２O2 RT １０ｍin切片在PBS中浸泡５ｍｉn*30、25％胰酶RT １0min切片在PBS中浸泡 5 min*３Blocking bｕｆfｅr(3%BSA+5%NGS＋０、2%Ｔritｏnx—１０0 in PBS) ＲT 60mｉn倾去blｏｃking buffｅｒ,勿洗一抗4 C overnighｔｉn blｏckinｇbuffeｒ取出切片复温1h,切片在PBＳ中浸泡 5 mｉn*３二抗iｎblocking ｂufｆer GＡR1:２00 (GＡM1:100),R Ｔ 1h切片在PBS中浸泡５min*3DAB显色５—１0min(５0微升A＋５0微升B＋９0０微升ＰBS+5微升3％H2Ｏ2)如果就是增强型DＡB只要1ｍｉn即可。
石蜡切片免疫组织化学操作流程一、组织获取（本实验室多做脑组织，所以以脑组织为例）1.动物麻醉：所用麻醉药物（水合氯醛水溶剂）剂量为350mg/kg动物体重，常用麻醉药物浓度为5%、6%、7%、10%（麻醉浓度越大，动物进入麻醉时间越短，但麻醉致死率相应较高，本人使用7%浓度，若注射位置正确，约3min进入麻醉状态）；动物麻醉后，将其固定于灌流操作平台，仰卧位；2.动物灌流手术：以胸骨剑突为起点，沿左右两侧肋下缘剪开老鼠皮肤至腋下，再次以剑突为起点，剪开皮下肌肉层，沿同样方向剪开肌肉至腋下，避免伤到内部脏器，剪破膈膜，沿左右两侧剪断胸骨，用止血钳夹住剑突向上翻转，充分暴露心脏；用弯镊分离心脏表面黏膜；左手持止血钳轻夹起心脏，倾斜一定角度，使心尖方向与升主动脉尽量位于同一直线上，右手持灌流针，沿直线所在所在角度由左心室进针，将灌流针直接插入升主动脉（可挑动灌流针于升主动脉内观察是否正确插入，此方法操作不熟练易插错血管或是直接刺穿心脏——或者直接将灌流针插入左心室，但前方法灌流效率较高）；固定器械（器械松动或是位置变化会严重影响灌流质量，有时会因为器械位置的变动直接将心脏牵扯下来导致灌流失败，应给与充分注意）3.动物灌流：C57小鼠25-30g左右，灌流开始，可见右心耳充盈，用剪刀剪开，便于血液流出：吊瓶灌流——以生理盐水50-100ml快速冲洗血液，持续最好不要超过5min（时间过长会导致脑组织降解），待无明显血迹流出后换用4%多聚甲醛进行灌流，约100-150ml，灌流速度不宜过快，约10min，固定液较充分的固定组织；注射器灌流——生理盐水50ml快速推注，后换用4%多聚甲醛50ml缓慢推注。
灌流成功的标志——灌流开始，可见肝脏颜色迅速变浅，随着灌流进行，肝脏颜色逐渐变为乳黄色或是白色；换用4%多甲固定液后小鼠全身痉挛抽搐，组织僵硬。
4.开颅取脑：根据实验取材位置的不同，分为不同的取脑方式：应注意需要的组织区域，避免取脑过程中损坏，多从小脑后方依次向前剥离颅骨，获取脑组织（在颅骨剥开后，应注意脑膜的存在，因为会发生脑膜将皮层割裂损伤的情况）5.脑组织修块：将多余脑组织去除，便于固定充分均匀，应留出试刀或找平的部分多余组织（本人实验中因需要海马组织，故修块时沿大脑皮层后边缘切除多余小脑，人字缝前约2.5-3mm切除前脑部分）6.固定过夜：将修块完成的脑组织，浸泡于4%多聚甲醛中，固定过夜，通常不要超过18小时（固定时间越长，组织抗原损失越严重，呈数量级损失），一般控制在12小时以内为宜二、组织石蜡包埋7.组织梯度脱水透明：将过夜固定的脑组织取出置于包埋窗内，并用铅笔做好相应标记，自来水流水冲洗约10min，去除残留的杂质成分，进行梯度酒精脱水（注意：不同的组织类型，同组织类型不同组织块大小所需的每阶段脱水时间不同，需根据自身需要进行简单摸索；若盲目脱水透明，脱水透明过头，会使组织脆性增加，切片时全为粉末状，无法成形；脱水透明不够，会使组织与蜡块分离，无法获取平整组织切片）本实验中，组织样本为脑组织，组织修块后所进行的脱水流程如下：自来水冲洗完成→50%乙醇 25min→70%乙醇 25min→80%乙醇 25min→90%乙醇 25min →95%乙醇I 10min→95%乙醇II 15min→无水乙醇I 10min→无水乙醇II 15min→二甲苯I 15min→二甲苯II 15min8.组织浸蜡：在进行二甲苯透明开始的时候，将石蜡用沸水融化，置于60度烘箱内备用（此过程中应注意将盛放石蜡的烧杯上口封闭，避免水分溅入；根据组织块的数目准备合适体积的石蜡液体，以组织块完全浸没其中为宜）；将透明完成的组织块，尽量沥干多余二甲苯，迅速转入1号烧杯的石蜡液体内（避免包埋窗内产生气泡，气泡若围绕组织块会影响浸蜡过程），依次将所有组织块迅速转入其中，要求组织块要全部浸没在石蜡中，流程如下：1号石蜡2h→2号石蜡2h→3号石蜡2h在每个阶段的浸蜡过程中，可根据时间安排适量的延长浸蜡时间，但尽量不要减少时间9.组织块包埋：包埋前，准备沸水备用；清理干净包埋槽备用；包埋开始时，将装有组织块的烧杯浸入沸水中，防止在包埋过程中，烧杯中的石蜡凝固，具体操作如下：1）用镊子夹取包埋槽在酒精灯预温，控制包埋槽的温度不要过高；2）将烧杯内的石蜡倒入包埋槽内，液面高度刚好没过包埋槽两侧平台3）取出浸泡的组织块，用小镊子过火后夹取组织块放置在包埋槽的凹陷处中心部位，根据切片要求摆放位置，注意在放置过程中避免组织块下面接触包埋槽底部的位置产生气泡，通常在放置前，可将组织块浸没在凹槽内的石蜡中翻滚，使其各面均匀接触石蜡液体，然后放置在正确的位置（此时假如包埋槽预温过高，则会导致组织块在接触槽底面后异常干燥，在整个蜡块凝固后会在干燥处出现凹洞，不利于石蜡块的长期保存）；4）将包埋窗轻轻放置在包埋槽的平台上面，尽量保证两侧高度相同，此时槽内之前的石蜡会浸没部分包埋窗的格栏，静置1-2min（避免倒入热的液体石蜡后，石蜡从包埋窗的边缘流出）；5）静置后，石蜡表面会出现凝固表层，此时再用烧杯中的石蜡填充包埋窗的凹陷处以及靠近边缘的条状凹洞，液面稍高于包埋窗边缘（靠近边缘的条状凹洞一定注意填充石蜡，关乎整个蜡块凝固后与包埋窗结合的紧密程度；石蜡凝固后体积会缩小，避免因液面过低导致的后期包埋窗内部支撑不够）6）静置至少30min，可将包埋后的蜡块从包埋槽内分离（注意分离时，应先清理包埋槽四周的多余石蜡，露出包埋窗与包埋槽接触的边缘，然后从一个角将蜡块撬离包埋槽）三、石蜡切片10.准备工作：蜡块的修整——将组织周边的石蜡在保留操作位置的情况下尽量去除（1-减少石蜡块切面与刀片的接触面积，便于受力均匀，易切出完整切片；2-石蜡切面与刀片接触面积小，会减少刀片接触到蜡块中坚硬杂质的几率，增加刀片的使用寿命；3-接触长度减少，可增加刀片使用次数，通常情况下至少多使用1次）准备器材：40度恒温水浴（温度控制在40-42之间的恒温状态，此温度可使蜡片较长时间保持切片形态，温度较低切片不易展开，温度较高，切片会在短时间内融化，易造成组织变形）切片刀片、包被载玻片、弯镊、毛刷、铅笔、切片盒冰盒（通常情况不需要，在组织脱水透明严重，切片呈粉末状态时，可用冰块冰敷石蜡切面，在短时间内可改善切片表面状态，能够帮助切出3-5片完整切片，只有在前期处理出问题时才使用进行一定程度挽救）切片大致流程：1）安装刀片；将蜡块固定于切片机上，调整蜡块表面与刀片距离，矫正蜡块表面与刀片切线平行；2）调整切片模式为trim-10um进行表面找平，并观察切片状态，调整蜡块角度，使切片左右对称，同时注意观察目标区域出现位置；3）切片调平，并出现合适目标区域，调整切片模式为sect-5um进行切片，获取所需组织切片样本；4）将完整合适的切片，夹取至水浴锅内摊平，左手持载玻片，右手持弯镊辅助，将切片贴于载玻片中，放置在水浴锅边缘进行干燥并做好相应标记；5）将干燥完成切片，按照样本分类放置在一起收于切片盒中备用6）切片完成，清理清片机；剩余组织蜡块，需要在切面表面均匀涂抹融化的石蜡，避免组织块直接与空气接触（不进行封闭，会使组织块在长期的暴露过程中，含水量发生变化，易于与支撑蜡块分离，造成后续再次切片困难）7）切片盒中切片，干燥后可在室温下长期放置，推荐切片完成后及时进行后期组织染色或组织免疫化学孵育。
石蜡切片免疫组化EnVision二步法染色第一组2组一、实验目的：1.掌握石蜡切片免疫组化EnVision二步法染色的原理、步骤及结果分析2.了解石蜡切片免疫组化EnVision二步法染色的临床应用二、实验原理：免疫组织化学技术是应用抗原与抗体接触后可形成“抗原－抗体复合物”的化学反应，以检测组织或细胞内抗原（或抗体）的技术。
EnVision二步法染色是通过一个葡聚糖分子，将多个抗小鼠或抗兔的二抗与多个辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）或碱性磷酸酶（AP)聚合在一起，形成一个免疫组化检测系统。
显色原理：将抗原抗体结合的部位显示出来。
常用ＤＡＢ（３’３－二氨基联苯胺）：阳性细胞染成棕黄色(ＨＲＰ显色剂)，苏木素复染，核淡兰色，显色反应稳定，不褪色，应用最广。
显色原理：酶－－催化剂Ｈ2Ｏ２－－底物ＤＡＢ－－供氢体反应原理：ＨＲＰ＋Ｈ2Ｏ２－－－－ＨＲＰ．Ｈ2Ｏ２ＤＡＢ↓(第一复合物)ＨＲＰ．Ｈ2Ｏ２－－－－ＨＲＰ＋Ｈ２Ｏ＋电子供体(氧化型)生成不溶于水和有机溶剂的有色终产物(棕褐色颗粒)和水，沉着在原来的位置上。
三、实验试剂与器材：试剂：二甲苯试剂，梯度乙醇（70%、80%、90%、100%、），蒸馏水，3%H2O2，柠檬酸盐缓冲液，PBS（磷酸盐缓冲液），鼠抗人CK，鼠抗人C-erbB-2，HRPanti-Mouse/Rabbit，DAB显色剂，苏木素试剂，1%盐酸乙醇，中性树胶，自来水器材：试剂缸、试剂瓶若干；载玻片及盖玻片若干；架子；石蜡切片；微波炉;37度恒温箱；显微镜四、实验地点：科技十楼，病理实验室五、实验时间：2011.12.21六、组员及分工：11120062申海涛，11120111黄冉冉，11120114谭辉，11120140谭丽，11120145张力，分别参与各步骤操作与计时。
七、记录人：黄冉冉八、实验步骤：1.二甲苯10minX 2 次2.梯度梯度乙醇水化，100%、90%、80%、70%由高到低每缸浸泡1min3.蒸馏水洗片刻4. 3%H2O2 去除内源性酶，室温10min5.蒸馏水洗3minX 2 次6.食管癌（CK）、乳腺癌（C-erbB-2）切片微波抗原修复（将切片放入柠檬酸盐缓冲液放入微波炉待煮沸后沸腾15min，室温冷却）7.蒸馏水洗3minX 2 次8.PBS洗3minX 2 次9.加鼠抗人CK（50微升）孵育1小时37°C，鼠抗人C-erbB-2（50微升）孵育1小时37°C10.PBS洗3minX 2 次11.（CK、C-erbB-2）：加HRPanti-Mouse/Rabbit孵育30min 37°C12.PBS洗3minX 2 次13.DAB显色（棕褐色），镜下控制；（镜下观察细胞膜染色即可冲洗）14.自来水冲洗5min15.苏木素复染，水洗16.1%盐酸乙醇分色2s，水洗17.梯度梯度乙醇脱水，70%、80%、90%、100%由低到高每缸浸泡2min18.切片风干后中性树胶封片九、实验结果与分析：食管癌CK：结果：低倍显微镜下观察染色阳性染色强，阳性颗粒定位性佳，组织结构清晰，除了出血部位和炎性区域有轻度背景外，多数组织片均无显著背景染色。
石蜡切片步骤取材：将目标组织样按要求修剪至一定大小。
固定：用10%的福尔马林溶液固定组织样4-6h。
脱水：梯度酒精50% 2h70% 2h80% 2h95% 2h95% 2h100% 40min100% 40min透明：二甲苯Ⅰ 8min二甲苯Ⅱ 5min （观察组织，透明度较好为宜）浸蜡：（蜡温保持在60℃）软蜡Ⅰ 50min软蜡Ⅱ 50min硬蜡Ⅰ 50min硬蜡Ⅱ 50min硬蜡包埋切片：组织化学切片 4μm常规切片 5μm烘片：65℃脱蜡至水：二甲苯Ⅱ 5min二甲苯Ⅰ 5min梯度酒精至水100% 3min100% 3min95% 3min95% 3min80% 3min70% 3min50% 3min染色：1.常规HE染色苏木素 10min自来水洗 5min盐酸酒精分化 10s自来水洗返蓝 10min伊红 1min自来水洗 5mins蒸馏水 1mins2.免疫组织化学染色1.抗原的修复：柠檬酸缓冲液95℃。
time2.消除内源性过氧化物酶：3%的H2O2的甲醇溶液孵育3min。
PBS（10mM磷酸钠，150mM 的氯化钠，pH7.4）洗涤3*3min3.封闭：5%BSA封闭30min。
洗涤3*3min4.加生物素标记的凝集素：用生物素标记的凝集素溶在大约2-20μg/ml（梯度稀释的以找到最合适的浓度）的PBS中，加在切片上然后在室温下孵育30min。
TPBS 洗涤3*3min。
1h混合ABC5.ABC试剂孵育30min。
（现配）TPBS洗涤3*3min。
6.加辣根过氧化物酶标的亲和素：加在切片上后在室温下孵育30min。
TPBS洗涤3*3min。
7.显色DAB：含3%的H2O2的DAB显色10min。
TPBS洗涤3*3min。
结合镜下观终止反应，蒸馏水冲洗。
苏木精衬染 10min蒸馏水洗涤5min盐酸酒精分化10s（视颜色而定）自来水返蓝4min梯度酒精脱二甲苯水透明封片光镜下染色计数，清洁，封片。
石蜡切片免疫组化染色步骤-回复石蜡切片免疫组化染色是一种常用的实验技术，用于检测组织中特定蛋白质的表达和定位。
通过特定抗体的结合，可以在组织切片上形成可见的染色反应，从而了解细胞分布、形态和功能。
本文将一步一步介绍石蜡切片免疫组化染色的详细步骤。
第一步：取材固定首先，需要取得要进行免疫组化染色的组织样本。
可以是新鲜组织，也可以是经过福尔马林或其他适当的固定剂固定后的组织。
固定的目的是固定细胞内蛋白质的结构，以保持其形态和抗原性。
固定过程中要避免产生过度固定，否则可能会破坏细胞结构和抗原的特异性。
第二步：组织脱水和浸渍将固定好的组织样本进行脱水和浸渍。
脱水的目的是去除组织中的水分，使其能够与石蜡充分相溶。
浸渍的目的是使组织均匀地吸收石蜡，以便切片时组织能够坚固并保持形态。
一般的脱水和浸渍步骤包括用不同浓度的酒精进行脱水，然后使用清洁剂和石蜡浸渍组织。
第三步：包埋和切片经过浸渍的组织样本需要进行包埋，以保持其形态和结构。
将组织样本放置在浸渍好的石蜡中，使其充分浸透，然后将其放置在冰上使石蜡固化。
固化后的组织样本可以用切片机切成非常薄的切片，通常是4-6μm。
切片质量对于后续的免疫组化染色非常重要，所以要确保切片的平整和完整。
第四步：切片除蜡和重现组织抗原切片除蜡是为了去除包埋后留在组织切片上的石蜡，以便进行后续的染色。
一般使用酮或甲醇进行除蜡，然后通过多次水洗将组织切片充分清洗。
重现组织抗原则是为了使切片上的抗原能够被抗体检测到。
根据抗原的性质和检测的目的，可以选择适当的方法进行重现组织抗原，如酶解、蛋白酶解或热诱导抗原修复等。
第五步：抗体孵育将免疫组化染色所需的一抗加在切片上，与切片中的特定抗原发生特异性结合。
孵育时间和温度根据抗体的性质和抗原的稳定性来确定，一般在室温下孵育数小时或过夜。
抗体孵育结束后，使用缓冲液或PBS洗涤切片，以去除未结合的抗体。
第六步：二抗孵育和信号检测在一抗的基础上，可以使用与一抗来源不同物种的二抗来进行信号放大。
石蜡切片免疫组化染色步骤1、载玻片的处理：抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。
为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine 等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。
具体方法如下：1.1 APES：现用现配。
将洗净的玻片放入以1:50 比例丙酮稀释的APES 中，停留20~30 秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。
用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。
1.2 HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2 分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC 烤箱烘烤一小时，装盒备用。
1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10 比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5 分钟，60oC 烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。
装盒备用。
试验中使用的器具均为非玻璃制品。
2、常用酶消化：2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40 分钟，主要用于细胞内抗原的显示。
2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180 分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：La minin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。
g/ml 的saponin 溶液，消化时间为室温孵育30μ2.3 皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~10 分钟。
3、抗原热修复：可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。
抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M 枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法（精髓版）免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法一、原理及应用免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。
二、操作步骤：（1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。
（2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。
（3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。
（4）0.5% Triton X-100通透（PBS配制），目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。
Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
当然了，如果检测的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。
（4）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火 3min，之后转成低火 15-30min。
注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。
所以冰冻切片不需要抗原修复！！抗原修复方法有多种，一般包括两大类：酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。
微波法最为常用。
（5）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（6）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。
（7）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（8）使用1% BSA 进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。
（9）根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜孵育。
（10）次日取出切片，室温下复温30min。
（11）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（12）按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。
（13）DAB 显色：DAB 显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。
二步法（无生物素PV6000系列），试剂A: 3% H2O2试剂B: Polymerized HRP-Anti Mouse或Rabbit IgG 3.0ml/6.0ml/18ml （根据一抗宿主而定）免疫组化染色步骤1. 石蜡切片脱蜡和水化二甲苯1涮洗一下，二甲苯2中放置15min，接着在三个二甲苯中涮洗（脱蜡彻底表现为组织玻片透明光滑），之后2个100%乙醇，2个95%乙醇，1个85%乙醇中涮洗（时间不严格2min），蒸馏水涮洗2次（时间自己把握）。
2. 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。
高压修复：修复液于高压锅内加热煮沸后关火，待放入组织玻片后等高压锅放气后，中小火煮沸2.5min。
自来水冷却10min左右，蒸馏水洗2次。
3. 每张切片于3%H2O2中室温孵育10分钟，阻断内源性过氧化物酶的活性。
组化笔圈出组织，TBS（pH 7.4）冲洗4次，第一次短时涮洗，后三次每次时间3-5min。
若用胃蛋白酶修复，37℃10min。
4. 甩去TBS液，每张切片加1滴或50μl一抗（完全覆盖组织），室温（22℃左右）下孵育55min或4℃过夜，建议参见每种抗体的说明书。
5. 蒸馏水涮洗2次，TBS(pH7.4)洗3-4次(时间不定)。
甩去TBS液，每张切片加1滴或50μl酶二抗聚合物(试剂B)，室温下孵25min。
（书上37℃30min）6. 蒸馏水涮洗2次，TBS(pH7.4)洗3-4次(时间不定)。
甩去TBS液，每张切片加1滴或50μl新鲜配制的DAB，显微镜下观察10-15min （胞核胞质染色均一）。
7. 自来水中涮洗2次（棕黄色），放置于苏木素中复染1-2min，自来水中涮洗，之后可用0.1%HCl分化（75%乙醇配制）；温蒸馏水（40-50℃）放置2-3min返蓝(介于紫色和蓝色之间)。
8.梯度酒精脱水80%、95%×2、100%×2时间适当延长（2-3min）。
一：步骤石蜡切片（骨组织）1：PFA固定，4℃冰箱过夜后，用10%的EDTA脱钙，时间3-5周，鉴定脱钙完成的标志是：用细针可以刺进骨头。
脱钙完成后开始做实验前需要把骨头放到70%的酒精24h。
2：脱水：70％酒精（1h）→ 80％酒精（30min）→ 95％酒精Ⅰ（20min）→无水乙醇Ⅰ（15min）→无水乙醇Ⅱ（15min）。
3：透明：二甲苯（15min）（如果组织小（例如小鼠和大鼠的组织）就15min，如果透明时间过长组织易脆，如果组织大（例如兔子、人、狗等)时间就可以稍微长一些。
4：浸蜡：恒温56℃～58℃（不超过60℃）。
→石蜡Ⅰ（1-2h）→石蜡Ⅱ（1-2h）。
（如果组织大浸蜡时间可以延长，可以达6-8h。
）5：包埋：待石蜡稍微凝固以后放到4℃冰箱过夜。
6：切片与展片：切片的时候要保持包埋好的蜡块的硬度，如果蜡块软的话切片的时候组织就会碎，所以要把蜡块放在冰上。
在42℃温水中展片（如果组织太脆，就先把组织浸泡在甘油中，几分钟？后在把组织放在冰块上，一段时间后再取出来重新切片。
）7：捞片：捞片时，载玻片45°倾斜，然后将片置于载玻片2/3处。
8：收片子，37℃保存。
HE染色1：脱蜡和脱水：二甲苯，10min×3（不常换，脱蜡用），酒精5min（100%Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ；95%；70%），蒸馏水Ⅰ，Ⅱ5min（如果在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。
如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长）2：染色：苏木精-2-3min3：蒸馏水冲洗（起反蓝的作用）：大概1h-2h4：伊红染色-2min4:脱水 70%→80%→95%Ⅰ→100%ⅠⅡ、Ⅲ酒精各一分钟5：二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各3min（脱水用，最好是用一次换一次，脱水用的二甲苯要透明干净，质量才好）6：封片用树胶∶二甲苯=3:1（1∶1，3∶2）{现配现用}，树胶多一些，用铅笔或者其他工具赶气泡。
免疫组化染色步骤：（两步法）第一天下午一、备片1、5微米厚组织涂有APES的胶片，干燥切片烤片：60℃、60-90min。
至蜡融化组织贴在玻片上。
2、二甲苯脱蜡：15minX3。
至蜡消失。
可第一缸时间较长，第二三缸较快。
需上下提洗，加快速度。
3、水化：梯度酒精水化（100%，90%，80%）入自来水。
如未洗净，则片子看上去有油腻感。
洗至看上去非常干净。
也宜上下提洗。
二、免疫组化染色1、3%双氧水封闭10-15min。
（注：现用现配，30%双氧水用蒸馏水稀释1：10）；蒸馏水洗一次，冲一下即可。
2、依据抗体说明热修复，高火每盒3min，然后低火12min。
过夜。
一些抗体比较特殊：CD68、Vimentin、S－100水化后胰酶消化15min，用TBS冲干净后，放入缓冲液中过夜；Kappa、Lambda需修复两次，即低火12min两次；第二天上午3、擦干背面及组织周围的水（注意：分清正反不要擦掉组织）；加1XTBS稀释后一抗30-50微升/张（注：一般为1：50；多抗1：100；可依据抗体说明书摸索）室温40min，TBS洗5min×3次；4、加A液（聚合物增强剂）20min，TBS洗3min×3次；5、加B液（二抗即酶标抗鼠/兔聚合物）30min，TBS洗3min×3次；6、DAB显色（A液B液15μl/1000μl，现配现用）3-10min。
7、显微镜下观察显色满意后自来水终止显色。
8、用Mayer’s苏木素复染核（新配1－2min），分化（盐酸酒精），返蓝（自来水）。
三、脱水（80%，90%，100%酒精）；透明（纯二甲苯3X5min）；封片。
免疫组化配液一、1XTBS：(5000ml，1XTris-NaCl，PH=7.6)Tris NaCl HCl（纯）蒸馏水30.28g 43.83g 14ml 定容至5000ml二、修复液1、0.01M枸橼酸盐缓冲液：（1000ml，PH=6.0）0.1M枸橼酸（A液）9ml 19ml 4℃储存0.1M枸橼酸钠（B液）41ml 81ml 4℃储存蒸馏水450ml 加至1000ml配置前摇匀，配后摇匀测PH值。
免疫组化染色操作步骤
1.准备染色：将需要染色的组织切片用4%-10％的甲醛溶液处理，然后放入0.2%的甲醛溶液中浸泡10-15分钟，除去水分后，用石蜡或玻璃滑片冰冻干燥后备用；
2.细胞选择：将滑片放在温度为60℃的预处理室内，经过5分钟的预处理，清除细胞的表面活性物质；
3.免疫化学染色：选择适宜的免疫染色培养液，将其放入干燥的滑片上，放入正常培养的锅炉内，温度在37℃；持续室温处理60min，以停止免疫反应；
4.洗涤：将染色滑片放入PBS洗涤3次，每次洗涤10min，使抗体与反应物完全稳定，以避免多余的洗涤对结果的干扰；
5.染色：将抗体连接到细胞上，使用应用适当的洗涤液将染色滑片淋洗；然后使用适当的染料进行染色，建议使用DAPI染色，因为其能够在高度细胞存在下染色，或者使用其他染色方法，比如无铁紫藤染色，铜绿假单胞菌染色等；
6.滤过：将染色滑片分批放在滤纸上，进行滤过，以减少染料在细胞上积累的可能性；
7.拍摄：使用荧光显微镜拍摄染色细胞，绘制免疫组化染色的结果图片，为最终研究结果的分析提供数据支持。
免疫组化染色步骤第一天：1．切片脱蜡：第一排试剂瓶从左至右（二甲苯→Alcohol），二甲苯内浸泡10min，Alcohol 内浸泡5min。
【二甲苯→二甲苯→100% Alcohol→100% Alcohol→95% Alcohol→90% Alcohol→80% Alcohol→70% Alcohol】2．PBS洗10 min×3，置摇床上。
3．【注意避光】用0.3% H2O2和0.3%Triton 混合液处理切片30min，置于摇床上。
增加切片渗透性。
【注：H2O2原液是30%，先把Triton溶解在PBS中后，再加入H2O2】4．PBS洗10 min×3，置摇床上。
5．抗原修复：塑料染缸中加入250mL 0.05M Citrate buffer（或0.05M Tris-HCl缓冲液）液，然后放入片子，调至“解冻”档，先微波加热5min（温度升至95o C左右），继续加热10min,中间冷却5min，再加热10min，然后室温冷却20min6．PBS洗10 min×3，置摇床上。
7．将切片取出，组织周围的水分用滤纸吸干，用特制的记号笔（冰箱中，可防止液体流出）在组织周围划上圈后放入湿盒中，并在圈内滴入5%羊血清，做到完全覆盖住组织，然后将湿盒放入恒温水箱（37℃）中20 -30 min。
8．将湿盒取出，把切片上的羊血清轻轻倒掉，用滤纸擦干留下的水道，否则再加入的液体将会沿着水道流出。
加入Ι抗，做到完全覆盖住组织，放入湿盒中，置恒温水箱（37℃）1h。
9．从水箱中取出湿盒，放入4℃冰箱中过夜。
第二天：10. 取出湿盒（室温30 min，恢复到室温），将抗体倒掉，PBS洗10 min×3，置摇床上。
11.滤纸将圆圈周围的水分吸去，加入相应Π抗，做到完全覆盖住组织，放入恒温水箱（37℃）中1h12.取出湿盒，将Π抗倒掉，PBS洗10 min×3，置摇床上。
免疫组化技术操作规程
一、石蜡切片免疫组化步骤(手工EnVision法)：
1、切片常规脱蜡至水洗。
2、根据一抗的要求进行修复：枸橼酸缓冲液（0.01M，PH6.0）高压锅修复（排气以后1 min 40s）；EDTA微波炉98℃20min；酶修复。
3、冷却至室温后水洗，3%过氧化氢处理10min。
4、以下步骤同冰冻3-7步。
所用试剂盒是机器所剩余的二抗（IgG多聚物技术，避免了生物素的影响）；还有中山的二抗，二抗前需要增加一步增强剂20min。
二、石蜡切片免疫组化步骤(机器)：
1、切片烤好后贴好标签入10%奶粉浸泡15 min。
2、充分冲洗后上机。
3、根据机器提示时间滴加一抗。
4、染色结束后清洗去油，脱水透明后中性树胶封固。
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