荧光分光光度法
一、 实验目的
1、学习荧光分光光度法的基本原理；
2、学习荧光光谱仪的结构和操作方法；
3、学习激发光谱、发射光谱曲线的绘制方法。
二、 实验原理
荧光分光光度法（fluorescence spectroscopy, FS）通常又叫荧光分析法，具有灵敏度高、选择性强、所需样品量少等特点，已成为一种重要的痕量分析技术。荧光（fluorescence）是分子吸收了较短波长的光（通常是紫外光和可见光），在很短的时间内发射出比照射光波长较长的光。由此可见，荧光是一种光致发光。
任何荧光物质都有两个特征光谱，即激发光谱（excitation spectrum）和发射光谱（emission spectrum）或称荧光光谱（fluorescence spectrum）。激发光谱表示不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。绘制激发光谱时，将发射单色器固定在某一波长，通过激发单色器扫描，以不同波长的入射光激发荧光物质，记录荧光强度对激发波长的关系曲线，即为激发光谱，其形状与吸收光谱极为相似。荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长的相对强度。绘制荧光光谱时，使激发光的波长和强度保持不变，通过发射单色器扫描以检测各种波长下相应的荧光强度，记录荧光强度对发射波长的关系曲线，即为荧光光谱。激发光谱和荧光光谱可用于鉴别荧光物质，而且是选择测定波长的依据。
荧光强度（F）是表征荧光发射的相对强弱的物理量。对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，即
该式即荧光分光光度法定量分析的依据。使用时要注意该关系式只适用于稀溶液。
三、 仪器与试剂
F-4500荧光光谱仪；比色管（10mL）；牛血清白蛋白（BSA）
四、 实验内容
1、 开机准备：接通电源，启动电脑。打开光谱仪主机电源，预热15分钟。
2、 运行FL solution软件，设定检测方法和测量参数：
荧光分析法的基本原理
荧光分析法是一种常用的分析化学方法，它利用物质在受到激发后发出的荧光来进行定量或定性分析。荧光分析法具有灵敏度高、选择性好、分析速度快等优点，因此在生物医学、环境监测、食品安全等领域得到了广泛的应用。
荧光分析法的基本原理是物质受到激发后发出的荧光强度与其浓度成正比。当物质受到特定波长的激发光照射后，其中的分子会吸收能量并处于激发态，随后分子会自发地返回基态并释放出能量，这种能量以荧光的形式发射出来。荧光分析法利用荧光强度与物质浓度的关系来进行分析，通过测量样品的荧光强度，可以间接地推断出样品中目标物质的浓度。
荧光分析法的基本原理还包括激发光源、激发光和荧光检测器。激发光源通常采用紫外灯或激光器，用于提供足够的能量来激发样品中的分子。激发光是指对样品进行激发的光线，其波长通常由样品的特性决定。荧光检测器则用于测量样品发出的荧光强度，并将其转化为电信号进行处理和分析。
在实际应用中，荧光分析法可以应用于各种领域。在生物医学领域，荧光分析法可以用于检测生物标记物、药物浓度、蛋白质含量等，具有灵敏度高、特异性强的优点。在环境监测领域，荧光分析法可以用于检测水体中的重金属离子、有机物污染物等，能够快速、准确地进行分析。在食品安全领域，荧光分析法可以用于检测食品中的添加剂、农药残留、重金属等有害物质，为食品安全提供可靠的分析手段。
总之，荧光分析法作为一种灵敏度高、选择性好的分析方法，具有广泛的应用前景。通过深入理解荧光分析法的基本原理，结合实际应用需求，可以更好地利用这一分析方法，为各个领域的分析工作提供更加准确、快速、可靠的支持。
化学化工学院 仪器分析
1 荧光偏振与荧光偏振免疫分析法
【摘要】本文简单介绍了荧光偏振原理和荧光偏振免疫分析（FPIA）的原理，并就荧光偏振及FPIA在环境、食品安全、医疗卫生和蛋白质研究等方面的实际应用进行了简单介绍和举例。
【关键词】荧光偏振 免疫分析 应用
从1852年，Stokes首次提出“荧光（fluorescence）”一词，人们对荧光现象的研究就不断深入，并发展出了荧光分析技术，荧光分析是指利用一些物质被电磁辐射激发后产生反映该物质特性的荧光而对该物质进行定性定量分析的方法。随着相关理论和仪器的发展，荧光分析的手段和技术水平也不断发展，现在荧光分析以其高灵敏度、高选择性、低样品用量、方法简便等诸多优点，在化学、医药、环境、信息、生命科学等领域被人们广泛使用。基于荧光偏振发展的荧光偏振免疫分析法是荧光分析中一个重要的组成部分。
一、 荧光偏振原理
荧光偏振的原理最初是1920年由Perrin建立的。溶液中荧光分子受偏振光激发，如激发时分子保持静止，则发射的荧光仍有偏振性，且如分子分子旋转或翻转，发射荧光的偏振平面会不同于激发光偏振平面。虽然实际测量常得消偏振的荧光，但荧光偏振技术有着重要应用[1]。 荧光偏振与荧光偏振免疫分析法
2 荧光偏振光强度P定义为：
P=（I⊥-I∥）/（I⊥+I∥）
其中，I⊥和I∥表示荧光子被激发后，发射光在垂直和水平方向上的强度。对于荧光偏振仪器，检测到的荧光强度：
P=（Ivv-G×Ivh）/（Ivv+G×Ivh）
式中，下标分别代表起偏器和检偏器方向，v为垂直方向，h为水平方向，G为校正因子，G=Ihv/Ihh。荧光偏振光强度P与测定体系中各因素的关系可用Perrin方程表示:
（1/P-1/3）=1/P0+（1/P0+1/3）（RT/V）(τ/η)
其中，P0为极限荧光偏振光强度，R为气体常数，T为绝对温度，V为摩尔分子体积，τ为荧光寿命，η为溶液的粘度。由上式知当溶液的温度和粘度都固定时，P值主要取决于荧光子的分子体积。荧光偏振光强度与荧光物质受激发时分子转动速度成反比，所以小分子物质在溶液中旋转速度快，P值较小；大分子物质在溶液中旋转速度较慢，P值较大[2]。
S2
S
1
S
0T1
吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫
能量
l l l3外转换
l2T2内转换
振动弛豫第一节荧光分析法的基本原理（2）(二) 有机化合物分子结构(molecular structure)与荧
光(fluorescence)的关系
1. 分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有合适的结构：强的紫外-可见吸收；
（2）具有一定的荧光效率。
2. 有机化合物的结构与荧光
(1）跃迁类型：→ *跃迁的荧光效率高，系间跨越过程的
速率常数小，有利于荧光的产生；(2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移
(3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作
用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。
(4）取代基效应：芳环
上有供电基团，使荧光增强。
综上所述：具有π→π*跃迁，
长的共轭结构，刚性平面以
及具有供电子基团的一类化
合物，有利于荧光的产生。(三) 荧光试剂：为了提高测定的灵敏度和选择性，
常使弱荧光物质与某些荧光试剂作用，以得到强荧
光性产物，扩大荧光分析法的应用范围。常用的荧
光试剂有：
1 荧光胺(fluorescamine)：能与脂肪族和芳香族伯胺
形成高度荧光衍生物；
2 邻苯二甲醛(OPA)：
3 1-二甲氨基-5-氯化磺酰萘(Dansyl-Cl，丹酰氯）：
4 测定无机离子的荧光试剂：三影响荧光强度的外部因素：
1.溶剂的影响：一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增强
而长移，荧光强度也增强。
2.温度的影响：荧光强度对温度变化很敏感，温度增加，外
转换去活的几率增加，使荧光效率和荧光强度降低。
3. 溶液pH：对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格
控制；
4. 荧光熄灭剂：又称荧光猝灭，是指荧光物质分子与溶剂分
子或其他溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象。
引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂(quenching medium)。
如果荧光熄灭强度与荧光熄灭剂的浓度呈线性关系，
