荧光分析法的基本原理

色谱分析法基本原理

色谱法，又称层析法。根据其分离原理，有吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱与排阻色谱等方法。

吸附色谱是利用吸附剂对被分离物质的吸附能力不同，用溶剂或气体洗脱，以使组分分离。常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。

分配色谱是利用溶液中被分离物质在两相中分配系数不同，以使组分分离。其中一相为液体，涂布或使之键合在固体载体上，称固定相；另一相为液体或气体，称流动相。常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。

离子交换色谱是利用被分离物质在离子交换树脂上的离子交换势不同而使组分分离。常用的有不同强度的阳、阴离子交换树脂，流动相一般为水或含有有机溶剂的缓冲液。

排阻色谱又称凝胶色谱或凝胶渗透色谱，是利用被分离物质分子量大小的不同和在填料上渗透程度的不同，以使组分分离。常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等，可根据载体和试样的性质，选用水或有机溶剂为流动相。

色谱法的分离方法，有柱色谱法、纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。色谱所用溶剂应与试样不起化学反应，并应用纯度较高的溶剂。色谱时的温度，除气相色谱法或另有规定外，系指在室温下操作。

分离后各成分的检出，应采用各单体中规定的方法。通常用柱色谱、纸色谱或薄层色谱分离有色物质时，可根据其色带进行区分，对有些无色物质，可在245-365nm的紫外灯下检视。纸色谱或薄层色谱也可喷显色剂使之显色。薄层色谱还可用加有荧光物质的薄层硅胶，采用荧光熄灭法检视。用纸色谱进行定量测定时，可将色谱斑点部分剪下或挖取，用溶剂溶出该成分，再用分光光度法或比色法测定，也可用色谱扫描仪直接在纸或薄层板上测出，也可用色谱扫描仪直接以纸或薄层板上测出。柱色谱、气相色谱和高效液相色谱可用接于色谱柱出口处的各种检测器检测。柱色谱还可分部收集流出液后用适宜方法测定。 柱色谱法

所用色谱管为内径均匀、下端缩口的硬质玻璃管，下端用棉花或玻璃纤维塞住，管内装有吸附剂。色谱柱的大小，吸附剂的品种和用量，以及洗脱时的流速，均按各单体中的规定。吸附剂的颗粒应尽可能保持大小均匀，以保证良好的分离效果，除另有规定外通常多采用直径为0.07-0.15mm的颗粒。吸附剂的活性或吸附力对分离效果有影响，应予注意。

X射线荧光分析的基来源根基理之答禄夫天创作

1. 绪论

物质是由各种元素依照分歧的构成方式构成的。各种元素的原子是由原子核和一定数目的核外电子构成。分歧元素的原子，原子核中质子和中子的数量分歧，核外电子数也分歧，具有分歧的原子结构。核外电子的能量也各不相同，这些能量分歧的原子按能量大小分层排列，离原子核最近的电子层称为K电子层，其外依次为L,M,N,O…层。K层上的电子能量最低，由里向外，电子的能量逐渐升高。原子在未接受足够的能量时，处于基态，即稳定状态，此时，K层最多容纳2个电子，L层最多容纳8个电子，M层最多容纳18个电子……。当使用高能射线（如X射线）照射物质时，物质中的原子的内层电子被高能射线逐出原子之外，在内层电子层上即出现一个“空穴”。具有较高能量的外层电子立即弥补这一“空穴”而发生跃迁。发生跃迁的电子将多余的能量（两个电子层能量之差）释放出来。释放出来的能量以电磁波的形式向四周发射，其波长恰好在X射线的波长范围内（0.001～10nm）。为了与照射物质的X射线（初级X射线）相区别，将被照射物质发出的X射线（二次X射线）称为荧光X射线（荧光即光致发光之意）。对于K层电子而言，L层电子向K层电子跃迁时放射出的荧光X射线称为Kα谱线，M层电子向K层电子跃迁时放射出的荧光X射线称为Kβ谱线，其他层的电子发生跃迁时的情况依此类推（如图1.1所示）。利用被测物质发出的荧光X射线进行物质化学成分的定性分析或定量分析，称为X射线荧光光谱分析。

在形成的线系中，各谱线的相对强度是分歧的，这是由于跃迁几率分歧。对K层电子而言,特定元素的荧光X射线Kα>Kβ,对于同一种元素而言，强谱线只有1-2条,特征谱线比较简单，易于分析，光谱干扰小。

2. X射线与固体之间的相互作用

X射线照射在固体概况上，主要会发生吸收和散射两种效应。固体物质可以吸收一部分射线，并可以使X射线在固体概况发生散射，使X射线的强度衰减。衰减率与样品的厚度成正比。

1 1 荧光定义

某些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态回到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射出去即发光，称之为荧光。可产生荧光的分子或原子在接受能量后引起发光，供能一旦停止，荧光现象随之消失。

2 荧光分类

由化学反应引起的荧光称为化学荧光，由光激发引起的荧光称为光致荧光，课题主要研究光致荧光。按产生荧光的基本微粒不同，荧光可分为原子荧光、X射线荧光和分子荧光，课题主要研究分子荧光。

3 光致荧光机理

某一波长的光照射在分子上，分子对此光有吸收作用，光能量被分子所吸收，分子具有的能量使分子的能级由最低的基态能级上升至较高的各个激发态的不同振动能级，称为跃迁。分子在各个激发态处于不稳定的状态，并随时在激发态的不同振动能级下降至基态，在下降过程中，分子产生发光现象，此过程为释放能量的过程，即为光致荧光的机理。光致荧光的过程按照时间顺序可分为以下几部分。

分子受激发过程

在波长为10~400nm的紫外区或390~780nm的可见光区，光具有较高的能量，当某一特征波长的光照射分子时，是的分子会吸收此特征波长的光能量，能量由光传递到分子上，此过程为分子受激发过程。分子中的电子会出现跃迁过程，在稳定的基态向不稳定的激发态跃迁。跃迁所需要的能量为跃迁前后两个能级的能量差，即为吸收光的能量。分子跃迁至不稳定的激发态中即为电子激发态分子。

在电子激发态中，存在多重态。多重态表示为2S+1。S为0或1，它表示电子在自转过程中，具有的角动量的代数和。S=0表示所有电子自旋的角动量代数和为0，即所有电子都是自旋配对的，那么2S+1=1，电子所处的激发态为单重态，用Si表示，由此可推出，S0即为基态的单重态，S1为第一跃迁能级激发态的单重态，S2为第二跃迁能级激发态的单重态。S=1表示电子的自旋方向不能配对，说明电子在跃迁过程中自旋方向有变化，存在不配对的电子为2个，2S+1=3，电子在激发态中位于第三振动能级，称为三重态，用Ti来表示，T1即为第一激发态中的三重态，T2即为第二激发态中的三重态，以此类推。

荧光法和benedict-behre法

荧光法是一种化学分析方法，用于检测物质的浓度和成分。荧光法的基本原理是利用物质吸收光的能量，然后以荧光的形式发射出来。荧光法在生物化学、医学、环境保护和食品工业等领域得到广泛应用。

荧光法最常用的应用是测定蛋白质、DNA、RNA等生物分子的浓度和成分。当这些生物分子吸收特定波长的光时，会发生荧光现象，荧光的强度与物质的浓度成正比。因此，通过测量荧光的强度，我们可以确定物质的浓度。

荧光法与吸收光谱法类似，但二者的主要区别在于荧光法不需要外部光源，而是通过激发物质内部的电子转移来产生荧光。荧光法的敏感性比吸收光谱法高，因为荧光信号可以在很低的浓度下检测到。

常见的荧光染料包括荧光素、二苯乙烯、罗丹明和SYBR Green等。这些染料通常具有激发波长和荧光波长。

荧光法的优点是灵敏度高，方法简单，测量范围广，还可以实现实时检测。然而，荧光法也存在一些限制，例如需要专业设备和高成本。此外，荧光信号也受到环境因素的影响，如温度和pH等。

Benedict-Behre法是用于分析土壤样品中的碳和氮含量的一种经典方法。该方法利用强碱性的乙二胺四乙酸（EDTA）和碘化钾将土壤样品中的碳和氮分离出来。然后，使用Benntict液或Behre试剂进行定量测量。

Bennict液是一种蓝色色素溶液，主要由硫氰酸铵、碳酸钠和铜硝酸组成。Bennict液会将还原糖类氧化成酮类，并将还原剂还原成氧化剂。Bennict液的浓度可以反映还原糖类的含量。

Behre试剂是一种含有银离子的溶液，用于测量样品中的氨基酸含量。在Behre试剂的存在下，氨基酸会与钛黄液中的亚硝基结合，形成深褐色的化合物。这种深褐色的化合物的浓度与氨基酸的含量成正比。

Benedict-Behre法的优点是方法简单、重现性好、成本低、使用方便，适用于分析土壤样品中的碳和氮含量。然而，Benedict-Behre法也存在一些限制，例如对于不同样品的分析结果会有差异，因此需要建立标准化的测试方法。此外，Benedict-Behre法只能检测到土壤中的简单化合物，不能检测到复杂有机物的含量。